Báo Cáo Thực Hành Hóa Phân Tích 2

Trang 1

Lời nhận xét của giáo viên

………

……….………

………

Trang 2

Lời mở Đầu

Sắc kí là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗnhợp Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường làdòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyểncủa các thành phần trong mẫu Khi các thành p hần này di chuyển qua hệ thống vớitốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian, giống như các vậnđộng viên chạy maratông Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trongmột khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu."

Trong kĩ thuật sắc kí, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các

thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi chúngchảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng Nhiều kĩ thuật khác nhau đã được dùng để phân tíchhợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khíhoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua, như giấy,gelatin hay gel magnesium silicate…

Ngành hóa học phân tích cho phép ta xác định các mẫu phân tích chứa hàmlượng rất nhỏ các chất nhưng với độ chính xác rất cao mà phương pháp phân tích phổbiến là phép phân tích sắc ký Để hiểu rõ và hoàn thiện hơn về thao tác phân tích trênthiết bị phân tích sắc ký thì sinh viên sẽ tiến hành phân tích một số hợp chất dựa v àocác thiết bị phân tích như HPLC, GC, TLC thông qua các bài thực hành sau đây

Trang 4

BÀI 1

XÁC ĐỊNH TỈ LỆ DUNG MÔI VÀ KHẢO SÁT CÁC

YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT TÁCH

I CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng và là một kỹ thuật tách cácchất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đ ặt hỗnhợp các chất cần tách Trong đó pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thànhphần được trộn với nhau theo tỷ lệ tối ưu được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụtrơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng,đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic Trong quátrình di chuyển của pha động qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thửđược di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau.Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được dùng trong cả phân tích định tính và phân tích địnhlượng

Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách Hệ số dichuyển Rfđược tính theo công thức:

Rf= a/b

Với: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùngđường đi của vết (cm)

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l và tôt nhất Rf nên nằm trong khoảng 0.2 -0.8

Trang 5

- 10ml dung dịch vaniline: cân 100mg vaniline cho vào bình định mức 10ml

và định mức tới vạch bằng dung dịch ethyl acetat

- 10ml dung dịch 2 - naphthol: cân 100mg 2 - naphthol cho vào bình địnhmức 10ml và định mức tới vạch bằng dung dịch ethyl acetat

Trang 6

- Hỗn hợp dung dịch vaniline và 2 – naphthol: dùng pipet hút mỗi loại 1mlcho vào cốc sau đó dùng giấy parafilm đậy cốc lại.

2 Chuẩn bị triển khai

Tráng kĩ cốc 50ml làm bình khai triển bằng acetone và để khô

Chuẩn bị hệ dung môi Chloroform - Ethyl acetat với các tỉ lệ sau:

o Cắt giấy lọc và ép vào mặt trong của bình triển khai

o Cho 5ml hệ dung môi Chloroform - Ethyl acetat (mỗi lần triển khai với

1 tỉ lệ đã pha ở trên)

o Sau đó đậy nắp lại cho dung môi thấm ướt hết giấy lọc

Trang 7

3 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hệ dung môi lên quá trình sắc kí bảng mỏng

3.1 Triển khai sắc kí bảng mỏng bằng hỗn hợp Chloroform - Ethyl acetat với các tỉ lệ khác nhau để tìm hệ dung môi tách các cấu tử trong hệ tối ưu nhất

2- Để yên cho vết chấm khô rồi cho bảng mỏng vào bình triển khai với tỉ lệ

hệ dung môi 1:9 sau đó đậy nắp lại

 Quan sát hệ dung môi giải ly thấm ướt đến cách mép trên của bảng mỏngkhoảng 1cm thì lấy bảng mỏng ra Dùng bút chì và thước đánh dấu mựcdung môi thấm ướt Để yên cho bảng khô tự nhiên rồi đem đi hiện màu

- Hiện màu bảng mỏng

 Sau khi triển khai và để khô tự nhiên, đem bảng mỏng soi dưới đèn UV(bước sóng 254nm)

 Lấy bút chì khoanh các điểm phát hiện dưới đèn UV Sau đó dùng thước

đo khoảng cách a1, a2, b để tính giá trị Rf1, Rf2, ∆Rf

Rf= a/b

∆Rf= Rf2- Rf1

Với: a1, a2 lần lượt là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm điểm thứ nhất vàđiểm thứ hai (cm)

Trang 8

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi trên cùng đường

đi của vết (cm)

- Thực hiện tương tự với các tỉ lệ dung môi trên để chọn tỉ lệ dung môi tối

ưu (hệ dung môi có ∆Rflớn nhất)

3.2 Triển khai sắc kí bảng mỏng với hệ dung môi có tỉ lệ tối ưu

Sau khi khảo sát ta chọn được hệ dung môi có tỉ lệ tối ưu Ta tiến hành triểnkhai sắc kí trên bảng lớn bằng hệ dung môi với tỉ lệ trên

 Để yên cho vết chấm khô rồi cho bảng mỏng vào 2 bình triển khai với hệdung môi có tỉ lệ tối ưu và đậy nắp lại

 Quan sát hệ dung môi giải ly thấm ướt đến cách mép trên của bảng mỏngkhoảng 1cm thì lấy bảng mỏng ra Dùng bút chì và thước đánh dấu mực dungmôi thấm ướt Để yên cho bảng khô tự nhiên rồi đem đi hiện màu

Trang 9

Với: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử ( là vết nằmngang với vết của mẫu so sánh)(cm).

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi trên cùng đường

đi của vết (cm)

Từ đó xác định được giá trị Rf= a/b

IV KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ hệ dung môi tối ưu

Tỉ lệ hệ dung môi 8:2 là tối ưu nhất

a Triển khai sắc kí bảng mỏng với hệ dung môi có tỉ lệ tối ưu

- Bảng mỏng 1: hỗn hợp vaniline và 2-naphthol + vaniline.

a = 0,8cm

b = 3,7cm

Trang 10

V TRẢ LỜI CÂU HỎI

Câu 1/ Nêu nguyên tắc lựa chọn dung môi cho sắc ký bảng mỏng?

Nguyên tắc lựa chọn dung môi cho sắc ký bảng mỏng là:

- Dung môi cần có độ tinh khiết cao

- Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng0.2 – 0.8 đạt độ phân giải cực trị

- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môiphân cực như hỗn hợp n – buthanol - nước Thêm một ít acid acetic hoặcamoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực củapha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf củachúng Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dungmôi không phân cực như methylbenzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf

- Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể

sử dụng cho TLC với pha tĩnh là silicagel hoặc alumina

Trang 11

Câu 2/ Tại sao khi triển khai sắc ký bảng mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp lại và để yên cho dung m ôi thấm ướt hết giấy lọc ?

- Khi triển khai sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp bình lại

và để yên cho hệ dung môi thấm ướt hết giấy lọc để cân bằng, bão hòa hơi dungmôi trong bình nhanh hơn

Câu 3/ Hệ dung môi và tỷ lệ dung môi có ảnh hưởng như thế nào đến giá trị

R f ?

- Khi thay đổi hệ dung môi hoặc thay đổi tỷ lệ dung môi sẽ làm thay đổi độ phâncực của pha động dẫn đến thay đổi sự tương tác giữa pha động với chất phân tíchhay nói cách khác là làm thay đổi sự lôi kéo của pha động lên chất phân tích Kếtquả hệ số di chuyển Rf thay đổi theo

Trang 12

BÀI 2

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHANOL TRONG MẪU

RƯỢU BẰNG THIẾT BỊ GC CLARUS 500

I CỞ SỞ LÝ THUYẾT

Hầu hết các loại máy sắc ký đều hoạt động dựa trên nguyên tắc di chuyển của cácmẫu chất cần phân tích trong cột sắc ký Những chất nào tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ ra sau,những chất tương tác yếu sẽ ra trước

Sơ đồ hệ thống GC

- Nguyên lý hoạt động của máy GC 500 : đầu tiên mẫu được tiêm vào trongInjector, tại đây mẫu được chia dòng theo tỉ lệ cài đặt và cần phải gia nhiệt choinjector để hoá hơi những mẫu chất cần phân tích, khi mẫu tiêm vào đ ược hoá hơi,cần cài đặt nhiệt độ của injector phải cao hơn nhiệt hoá hơi của mẫu.Sau khi mẫuđược hoá hơi chúng được khí mang đẩy vào trong cột Nhiệt độcủa cột cũng

cầnphải được gia nhiệt để tránh sự ngưng tự của mẫu trong cột Chất nào cónhiệt

độ sôi thấp sẽ ra trước và chất nào có nhiệt độ sôi cao thì ra sau Ngoài ra còn phụthuộc vào ái lực của chất phân tích và pha tĩnh Sau khi mẫu ra khỏi cột, lúc nàymột lần nữa mẫu được khí mang đẩy vào detector , tại đây mẫu được đốt cháy

Trang 13

bằng ngọn lửa và tạo ra ion, nhờ vào lượng ion tạo ra mà detector đã nhận dạngđược trong mẫu cần phân tích có được ion nào, các tín hiệu mà detector phát hiệnđược chuyển thành các tính hiệu điện và được xuất ra dưới dạng dữ liệu.

- Trong bài thí nghiệm này chúng ta sẽ xác định hàm lượng methanol trong rượudựa vào nguyên tắc : diện tích mũi sắc ký trên sắc ký đồ tỉ lệ với nồng độ của chất

đó từ đó có thể tính được chính xác nồng độ của mỗi thành phần trong hỗn hợptheo phương pháp nội chuẩn với chất nội chuẩn là n-butanol

Trang 14

1.2 Pha dãy chuẩn và mẫu

 Pha dãy chuẩn methanol

- Sau khi chạy mẫu thử với chuẩn methanol 10% thì thấy diện tích peak và thờigian lưu khá tốt nên quyết định chọn dãy chuẩn với nồng độ methanol là 6%,8%, 10%, 12%, 14%

- Chuẩn methanol 6%: Lấy 3ml methanol 20% + 2ml n-buthanol 30%, địnhmức bằng ethanol 99.9% đến vạch 10ml

- Mở khóa máy nén khí, khóa van xả khí thừa, rồi cấm điện máy nén

- Mở công tác trên máy GC clarus 500, máy sẽ tự động kiểm tra bên trong

Trang 15

- Chọn “Login” để vào màn hình chính của thiết bị

- Mở máy vi tính và chọn biểu tượng Total Chrom Navigator để mở phần

 Thao tác trên màn hình của GC

Trên màn hình chính chọn vào biểu tượng PSSI Trong thẻ A-PSS

Nhiệt độ cho Injector: 1800CCarrier gas (N2): 5

Chọn Ok rồi chọn Lose để đóng Tools

Khi nhiệt độ của FID đạt trên 1500C, khí H2 và Air ổn định ta có thể

tiến hành đánh lửa Nhấp vào biểu tưởng “ Ignite” trong thẻ A-FID để

đánh lửa

Khi đánh lửa, khí Air sẽ giảm về 0 và tang lại dần đến ổn định, đồngthời nghe 1 tiếng “Bụp”, và tín hiệu điện xuất hiện gần 1mV thì quátrình đánh lửa thành công

 Thao tác trên phần mềm Total Chrom Navigator

Ta setup các điều kiện cho mẫu thử

Trang 16

Vào biểu tượng Setup trên giao diện chính của phần mềm.

Xuất hiện cửa sổ Setup Instrument Thực hiện các bước sau.

Setup type: chọn Quick start Raw file path: mở đường dẫn đến vị trí lưu file raw

Sau đó chương trình sẽ kết nối với máy GC Khi kết nối thành công, ở

góc trái phía trên màn hình của máy GC sẽ xuất hiện chữ “External” Nếu không thành công , vẫn giữ nguyên chữ “ Method 5”.

b Đo mẫu thử

Sau khi cài đặt phương pháp xong, khi chữ “ Ready” xuất hiện trên giao diện

chính của phần mềm Total Chrom Navigator (hoặc góc phải phía dưới trenmàn hình của thiết bị) thì ta tiến hành thao tác tiêm mẫu như sau:

- Dùng ống tiêm (loại 1µl) rút đúng 1µl, (loại bỏ bọt khí để tránh sai số kếtquả)

- Đặt kim vào vị trí Inject, sau đó chọn biểu tượng Run trên màn hình máy

GC Màn hình Run xuất hiện, nhấn START, máy sẽ đếm ngược từ 5sec

về 0sec và nghe 1 tiếng píp thì lập tức tiêm mẫu vào buồng mẫu, máy sẽghi nhận kết quả và bộ đếm thời gian bắt đầu hoạt động Chờ khoảng0.2min rồi rút kim ra

Ta có thể xem sắc kí đồ trong lúc phân tích bằng cách chọn View Real-time plot trên giao diện chính của phần mềm Total Chrom Navigator

Trang 17

Thực hiện tương tự cho các lần tiêm tiếp theo đối với mẫu thử nhưng thayđổi thông số của nhiệt độ cột và tốc độ dòng như sau:

Nhiệt độ cột (0C) Tốc độ dòng (ml/min)

70

521

75

521

65

521

Nhận xét: Trong các lần thử trên thì thấy lần chạy với nhiệt độ cột 700C, tốc độdòng 5 ml/min, thì các peak xuất hiện được tách rõ nhất Nên sẽ áp dụng 2thông số này cho phương pháp đo mẫu và dựng đường chuẩn

2.3 Đo dải chuẩn và mẫu

a Tạo phương pháp đo dải chuẩn và mẫu

- Trên giao diện chính của Total Chrom Navigator chọn :

- Build Method => Creat new method => clarus 500 => next => next

=> next

- Trong cửa sổ Instrument control ta cài đặt như sau:

o Oven ramp: temp: 700C;

hold: 5 => chọn Apply

o Inj A Ramp: temp: 1800C;

hold: 999 => chọn Apply

o Carrier flow (ml/min): 5 => chọn Apply

o Detector: temp: 2300C => chọn Apply

Trang 18

o Chọn next ở các cửa sổ tiếp theo.

- Đến cửa sổ Global Information => chọn Internal Stadard

- Chọn next => chọn finish Rồi chọn save để lưu lại.

- Trở lại màn hình chính của Total Chrom Navigator

- Chọn setup, xuất hiện cửa sổ Setup Instrument

- Trong thẻ setup type ta chọn method

Method: chọn method vừa tạo.

Raw file path: mở đường dẫn đến vị trí lưu file raw

(D:\DA10HH\Nhom I.3)

Result file path: mở đường dẫn đến vị trí lưu file result

(D:\DA10HH\Nhom I.3)

Base file path: methanol

- Trong thẻ Build ta chọn Vial list, xuất hiện cửa sổ Sequence Cho phép

ta nhập thông tin mẫu, GEN, số lượng mẫu,…: nhập lần lượt theo thứ tựmẫu tăng dần theo nồng độ

- Trong thẻ processing ta chọn Suppress processing.

- Cuối cùng ta chọn OK

Sau đó chương trình sẽ kết nối với máy GC Khi kết nối thành công, ở góc trái

phía trên màn hình của máy GC sẽ xuất hiện chữ “ External” Nếu không thành công , vẫn xuất hiện chữ “Method 5”

b Đo dải chuẩn và mẫu

Sau khi cài đặt phương pháp xong, khi chữ “Ready” xuất hiện trên giao diệnchính của phần mềm Total Chrom Navigator (hoặc góc phải phía dưới trenmàn hình của thiết bị) thì ta tiến hành thao tác tiêm mẫu như sau:

- Dùng ống tiêm (loại 1µl) rút đúng 1µl, (loại bỏ bọt khí để tránh sai số kếtquả)

- Đặt kim vào vị trí Inject, sau đó chọn biểu tượng Run trên màn hình máy

GC Màn hình Run xuất hiện, nhấn START, máy sẽ đếm ngược từ 5sec

Trang 19

về 0sec và nghe 1 tiếng píp thì lập tức tiêm mẫu vào buồng mẫu, máy sẽghi nhận kết quả và bộ đếm thời gian bắt đầu hoạt động Chờ khoảng0.2min rồi rút kim ra.

Lưu ý: ta chỉ đưa kim vào vị trí Inject khi xuất hiện c hữ “Ready”

c Xử lý kết quả

 Định danh

- Ta tiến hành định danh peak cho 4 mẫu chuẩn và 2 mẫu phân tích

- Quá trình định danh được thực hiện theo các bước sau:

B1: Chọn biểu tượng Graphic Edit trong giao diện chính của Total Chrom

Navigator

B2: Chọn file *.raw cần xử lý => open Sắc kí đồ sẽ xuất hiện trong của sổ

của Graphic Method Editor

B3: Chọn Calibration/Edit Components…

(xác định trên lý thuyết để đưa ra kết luận khác quan về peak của n

-buthanol và methanol để ta tiến hành chọn peak đặt tên)

B4: Chọn vào peak của n-buthanol (chất nội chuẩn) thực hiện như sau:

Chọn vào 2 ô Rel và ISTD Name: n-buthanol

Absolute window : 3.00s Relative window: 3%

Chọn “Find tallest peak in window”

Chọn Prev

B5: Chọn vào peak của methanol (chất cần xác định) thực hiện nh ư sau:

KHÔNG Chọn vào 2 ô Rel và ISTD

Name: methanol Reference: chọn n-buthanol ISTD: chọn n-buthanol Absolute window : 3.00s

Trang 20

Relative window: 3%

Chọn “Find tallest peak in window”

B6: chọn biểu tượng Return để đóng dialog box

Lưu ý: File *.raw sau khi xử lý sẽ tạo ra file *.rst (cùng tên với file raw)

 Dựng đường chuẩn

- Cài đặt thông số hiệu chuẩn

B1: Chọn Build Method => create a new method => Ok

Chọn Clarus 500 => Ok => Cancel

 Xuất hiện cửa sổ Method Editor

B2: Trên thanh menu chọn Component => Edit component (xuất hiện cửa sổ

component)

B3: Thao tác trong thẻ Identification như sau:

Component type: chọn Peak

- Nhập thông tin cho n-buthanol (chất nội chuẩn)

Name: n-buthanol

Retention time: 3.485min

Absolute window: 3.00s

Relative window: 3%

Chọn “Find tallest peak in window”

Chọn “this component is an internal standard”

Chọn “Find tallest peak in window”

Chọn “this component is a retention reference”

Internal Standard: chọn n-buthanol

Trang 21

B4: Chọn Apply

B5: Trong thẻ Calibration chọn Apply

B6: Trong thẻ User Values/LIMS chọn Apply rồi chọn Ok

 Xem kết quả đường chuẩn

B1: Trên thanh menu chọn Component => Calibrate (xuất hiện hộp thoại

Cửa sổ Method Editor chia làm 3 vùng

- Vùng 1 (bên trái màn hình): hiển thị danh sách tên (methanol và buthanol)

n Vùng 2 (ở giữa màn hình): hiển thị thông tin về mẫu

- Vùng 3 (bên phải màn hình): hiển thị đường chuẩn và sai số chuẩn (ngayphía trên đường chuẩn)

 Lưu phương pháp với các đường cong chuẩn vừa tạo

- Vào File\save as

- Xuất hiện bảng documentation để nhập những thông tin cần thiết ChọnOk

- Xuất hiện bảng TotalChrom File-Save-As

- Nhập tên file cho phương pháp vừa tạo và chọn vị trí lưu thích hợp

- Chọn Save để lưu

Trang 22

3 Tắt máy

Thao tác tắt máy thực hiện trên màn hình của thiết bị

B1: Ngắt kết nối giữa GC clarus 500 với phần mềm Total Chrom Navigator Chọn Tools/Release/OK (khi đó xuất hiện chữ “Method 5” ở góc trái phía

trên màn hình)

B2: Tắt các thông số sau:

Vào PSSI: tắt nhiệt độ cho Injector => Chọn Heater off Vào Oven: cài oven ở nhiệt độ 2000C trong khoảng 10 phút, sau đó đểOven về nhiệt độ phòng

Vào A-FID: tắt nhiệt độ cho detector FID => Chọn Heater off Vào Tools/Configuration/A-FID

Air: 0 ml/min

H 2: 0.0 ml/min

=> Ok => Close B3: Chờ nhiệt độ của FID và Injector <1000C thì tiến hành tắt máy

Vào Tools/Logout

Tắt công tắc trên GC

B4: Tắt các van khí như sau:

Khóa các valve khí H2, N2Ngắt điện máy nén không khí => mở van xả áp máy nén

Trang 23

IV KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Diện tích peak

Tỉ lệ diện tích peak

methanol n-buthanol Chuẩn methanol 1 6 6077.05 46533.75 0.130594461 Chuẩn methanol 2 8 8181.4 29964.16 0.273039525 Chuẩn methanol 3 10 8878.98 31470.8 0.282133915 Chuẩn methanol 4 12 10519.21 29510.75 0.356453496

Trang 24

Từ đồ thị ta có phương trình: y = 0.0343x – 0.0484 ( R2=0.8827)

- Dựa vào phương trình trên, suy ra được % methanol trong mẫu 1:

10.0059%

Nhận xét: Do R2=0.8827 < 0.98 Nên kết quả thu được không thực sự có

ý nghĩa, không thể kết luận trong mẫu rượu có hay không có methanol

- Mẫu 2 có diện tích peak nằm ngoài dãy chuẩn

V TRẢ LỜI CÂU HỎI

Câu 1/ Mô tả các bộ phận chính của GC Clarus 500

- Khi lựa chọn khí mang cần chú ý đến dertector sử sụng, độ tinh khiết củakhí mang và yêu cầu tách, khí mang được sử dụng phải không được thayđổi trạng thái lý, hóa học khi đi qua hệ thống sắc ký

- Phòng thí nghiệm sử dụng khí mang là nitrogen d o không nguy hiểm giá

rẻ và dễ dàng l àm tinh khiết

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	422,41 KB