I. Các bước tiến hành
1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.
I.1 Dung dịch chuẩn gốc 1000
Cân chính xác khoảng 50mg chất chuẩn acid ascobic trên cân phân tích có độ chính xác 0.1mg. hòa tan váo bình định mức 50ml bằng nước cất ta thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1000.
1.2 Dung dịch chẩn trung gian 100g/l
Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc ở trên cho vào bình định mức 10ml, pha loãng bằng dung dịch ortho-phosphoric 0.35% đến vạch, lắc đều.
1.3 Dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn bị các dung dịch chạy máy có nồng độ lần lượt là 1; 5; 10; 20g/l trong dung dịch acid ortho-phosphoric 0.35%.
GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 38 Nhóm 2
2. Chuẩn bị mẫu
2.1 Chuẩn bị mẫu sơ bộ
- Mẫu cần được đồng nhất kỹ trước khi thức hiện phân tích. - Đối với mẫu rắn phải nghiềm mịn bằng máy nghiền mẫu. - Đối với mẫu lỏng phải lắc kỹ.
2.2 Mẫu thử
- Mẫu lỏng: tùy theo hàm lượng vitamin C trong mẫu hút khoảng 1-10ml dung dịch mẫu và định mức 100ml bằng dung dịch acid meta-phosphoric 3%. Lọc qua giấy lọc và màng lọc 0.45mm sau đó bơm vào hệ thống HPLC.
- Mẫu rắn: cân chính xác từ 0.5-5g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid meta-phosphoric 3% vào ống ly tâm và lắc đều trong 5 phút bằng máy vortex. Siêu âm 10 phút và ly tâm với tốc độ 3000 vồng/phút trong 5 phút. Gạn dịch trong ở trên vào bình định mức 25ml. - Lặp lại quá trình trên với 10ml dung dịc meta-phosphoric 3%. Thu lớp
nước vào bình định mức 25ml ở trên, và định mức đến vạch bằng dung dịch mete-phosphoric 3%, Lọc qua giấy lọc và màng lọc 0.45mm, sau đó bơm vào máy HPLC.
Lưu ý:
- Đối với các mẫu có hàm lượng béo lớn (mẫu sữa, mẫu thực phẩm chức năng có nhiều dầu…) cần loại béo trong quá trình chiết mẫu.
GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 39 Nhóm 2
- Quá trình loại béo: sử dụng diethylete hoặc cloroform để phân tách lớp béo, tiến hành loại bỏ lớp béo trên bề mặt. Sau đó chiết mẫu theo quy trình “mẫu rắn”.
Điều kiện chạy máy:
- Cột C18 (250 mm x 4,6mm x 5m) - Nhiệt độ cột 40oC.
- Detector PDA ở bước sóng 241 nm
- Pha động: Dung dịch đệm KH2PO4 3mM trong 0.35% acid ortho- phosphoric.
- Tốc độ dòng: 0.5 ml/phút. II. Quy trình vận hành máy HPLC
Bước1: Mở máy
- Kiểm ta bình dung môi A, bình dung môi B (tốt nhất là còn 2/3 bình). - Nước thải đầy quá phải đem đổ.
- Lần lượt mở công tắc:
o Water In-line Degasser AF
o Water 1525 Binary HPLC Pump
o Water 2996 Photo diodes Arraydetector
GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 40 Nhóm 2
- Mở phần mềm empower login : Use: System Pass: Manager
Bước 2: Tạo Project
- Trên màn hình chính
- Chọn Configuse data -> File -> New project -> Chọn next 5 lần - Project name:
Project conment:
- Chọn finish.
Bước 3: Tạo Instrument method
- Trên Home, chọn Run Sample -> chọn Instrument Method. - Hiện cử sổ Instrument Method Edit, cài đặt:
•
Cài đặt thông số về dòng -> Zome 1 Enable
GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 41 Nhóm 2 Project data Review data Configuse data Pant data ViataminC_Instrument Nhóm I2 PCM/15xx W2996 TCM TCM Run Sample
nhiệt độ của cột • Có 2 chế độ: o 2D : gồm 2 trục bước sóng và nồng độ. o 3D: Bước sóng Nồng độ
Thời gian (khảo sát thời gian lưu)
Nên chọn 3D vì có thể từ 3D chuyển qua 2D, còn nếu 2D thì không thể chuyển lại 3D.
- Start Wavelength -> End Wavelength
Bước 4: Chạy mẫu ( Run Sample )
- Chạy rữa cột.
- Chạy baseline ( Momtor ). - Chạy mẫu. - Lập đường chuẩn: GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 42 Nhóm 2 W2996
o Tiêm pha động 3 lần.
o Tiêm dung dịch chuẩn làm việc 1ppm, 5ppm, 10ppm, 20ppm.
Cách tiêm:
• Đưa kim vào -> Nhấn prepare -> Hiện Single Inject (chưa tiêm), hiện inject mới tiêm.
• Gạt Inject -> hiện Inject Running -> gạt trở lại -> rút kim.
Bước 5: Xử lý kết quả
- Bắt peak tại một bước sóng:
+ Chọn chuẩn ở nồng độ thấp nhất.
+ Chọn process -> Extract Choromatogram -> Chọn bước sóng (243) + Save -> Choromatogram -> OK -> Update
- Nhấp chuột phải -> chọn Process Method Wizard -> OK-> Next (2 lần ) -> bắt peak -> Next ( 2 lần ) -> No -> Next -> Chọn đơn vị (ppm )-> Next -> Method name
- Chọn Process Method -> Default Amuonts -> Nhâp giá trị chuẩn. - Nhấp chuột phải -> Process -> Usespectified Method Set:
Processing -> Usespectified Processing Method -> Chọn process mới tạo
Reponding -> Usespectified Method Set -> Chọn OK - Sau đó Update : GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 43 Nhóm 2 Đặt tên Nhóm I2
Channel Result Peak Curve
Làm tương tự cho giả mẫu
Bước 6: In kết quả và Xử lí kết quả
Bước 7: Tắt máy
- Chạy tốc độ dòng Flow A: 0,0 mL /min để rữa.
- Đợi ánh sáng ổn định thì làm lại thao tác này cho cả 2 dòng trở về 0,0 mL/min - Khi ánh sáng đầu côt trở về 0,0 psi thì tắt lần lượt:
o Water 2996 Photo diodes Arraydetector
o Water 1525 Binary HPLC Pump
o Water In-line Degasser AF
o PC
Chú ý: Khi tắt máy cần shutdown máy tính trước khi tắt các công tắc trên thân máy để tránh việc ngắt kết nối đột ngột với thiết bị, dễ bị lỗi cho lần mở máy tiếp theo.
III. Quy trình đo mẫu.
- Khởi động cho pump 1525, detetor 2996, máy vi tính và chờ phần mềm ổn định.
- Cài đặc các thông số thích hợp và đặt thông tin cho để lưu các giá trị khi máy chạy.
- Nhấp Monitor để test năng lượng và chờ đến khi Base Line ổn định. GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 44 Nhóm 2
- Sau khi ổn định ta nhấp vào biểu tượng Abort để chuẩn bi tiêm mẫu.
Lặp đường chuẩn: tiêm mẫu chuẩn 1ppm và sau đó tiêm thêm 3 lần pha động và tiêm tiếp mẫu chuẩn 5ppm, 10ppm, 20ppm.
Đo mẫu: nồng độ của mẫu đã được tính toán sẽ nằm trong đường chuẩn.
Tiêm mẫu cần đo vào và tiêm tiếp 3 lần pha động. - Xử lý số liệu.
IV. Kết quả và thảo luận
- In ra các đường chuẩn và các kết quả phân tích. - Tính toán hàm lượng Vitamin C trong mẫu thử.
• Mẫu lỏng:
Cppm=(V2/V1)*Cđo HPLC Với (V2/V1) là hệ số pha loãng.
• Mẫu rắn:
P%=(25*Cđo HPLC)/(10*mcân)
V. Câu hỏi củng cố
1. Nêu phương pháp lựa chọn pha động trong phân tích vitamin C bằng HPLC?
Pha động trong phân tích HPLC là dung dịch đệm KH2PO4 3mM trong 0.35% acid ortho-phosphoric.
GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 45 Nhóm 2
2. Vai trò của lọc trong phân tích Vitamin C bằng HPLC?
Lọc mục đích loại bỏ những chất rắn lơ lững không tan và các tạp chất làm cho mẫu đồng nhất và không ảnh hưởng đến các bộ phân của máy sắc ký HPLC
3. Kết quả bị ảnh hưởng như thế nào khi thay đổi dung môi và tỷ lệ dung môi trong phân tích vitamin C
Khoảng cách giữa các vạch sẽ bị thay đổi. Có thể bị chồng nhau, không kéo được hoặc sẽ kéo xa hơn.
Bài 5:
GIỚI THIỆU VỀ HỆ THỐNG SẮC KÍ KHÍ - GC