Góp phần xây dựng tiêu chuẩn định lượng paracetamol

r—-~-Mục tiêu của đề tài này là khảo sát phần định lượng nhằm đưa ra một phương pháp định lượng Paracetamol thích hợp với Việt Nam để chuyển tới hội đồng Dược điển tham khảo, xem xét việ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

GÓP PHẦN XÂY DỤNG TIÊU CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 19 9 5-2000)

Người thực hiện: sv Hoàng Tùng

Người hướng dẫn: TS Thái Duy Thìn

GVC Nguyễn Đình Hiển

Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược

Thời gian thực hiện: 01/03/2000-20/05/2000

Hà Nội 5 - 2000

BỘ Y TẾ

GÓP PHẦN XÂY DựNG TIÊU CHưẨN ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1995-2000)

Hà Nội 5 - 2000

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện hhố luận tốt nghiệp Được sỹ Đại học, tơi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy hướng dần, các cán bộ của bộ mơn lỉố Được.

Trước tiên, tơi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo-TS Thái Buy Thìn và thảy Rguyễn Đình ĩịiển mà tơi đã cĩ được các tài liệu và các kỹ năng cần thiết trong thực nghiệm do cấc thầy cung cấp, hướng dẫn Đổng thời tơi cũng được các thầy cơ và hỹ thuật viên khác ở trong bộ mơn giúp đỡ rất nhiều trong thời gian íơi thực hiện đề tài này ĨỈỈ1Ờ những sự giúp đỡ đĩ mà tơi đã hồn thành được đề tài của mình trong thời gian ngắn nhất.

Xin cảm ơn sự giúp đỡ cửa thư viện trường Đại học Được Ẹá nội, thư viện Khoa học kỹ thuật Trung ương đã cung cấp những tài liệu cĩ liên quan; phịng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Được lịà nội đã giúp xử lý một số mẫu mà điều hiện máy mĩc ở phịng thí nghiệm ở

bộ mơn Tịó Được chưa cho phép.

ữỉộí lần nữa, tơi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý giá của thầy cơ và mọi người.

MỤC LỤC■ ■

Trang

Phần 1: Đặt vấn đề 1

Phần 2: Tổng quan 2

2.1 Paracetamol 2

2.2 Điểm qua một số phương pháp định lượng Paracetamol 3

2.3 Các phương pháp khảo sát trong khoá luận 4

2.3.1 Phương pháp đo Nitrit 4

2.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại 4

Phần 3: Thực nghiệm và kết quả 12

3.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 12

3.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 12

3.2.1 Định lượng Paracetamol bằng phương pháp đo Nitrit 12

3.2.2 Định lượng Paracetamol bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại 22

3.2.3 So sánh hai phương pháp định lượng Paracetamol 31

3.2.4 ứng dụng định lượng Paracetamol trong một chế phẩm có trên thị trường 34

Phần 4: Kết luận và đề xuất 36

PHẦN 1 ĐẶT VÂN ĐỂ

Paracetamol là một thuốc thuộc nhóm hạ nhiệt giảm đau đang được sử dụng rộng rãi Có tới 281 bào chế phẩm với các tên biệt dược khác nhau được phép lưu hành ở Việt Nam có hoạt chất là Paracetamol [4]

- Chỉ có Paracetamol như: Apo-Acetaminophen, Bé Nóng, Daíangal, Panadol, Paracetamol, Efferalgan, Oralgan, Tylenol

- Có thành phần khác kết hợp Paracetamol như Alaxan, Ankitamol, Zandol, Efferalgan-Codein, Decolgen, Pamin [13]

Việc kiểm nghiệm Paracetamol nguyên liệu là một khâu rất quan trọng trong việc sản xuất ra thuốc có chất lượng tốt Paracetamol đã được các Dược điển khác nêu trong chuyên luận [14] [18] [20] [22] [23] [24] [26] nhưng Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận này [1] [2] Định lượng Paracetamol từ trước tới nay thường theo Tiêu chuẩn ngành [9] hoặc Tiêu chuẩn cơ sở [8] Vì vậy cần phải có phương pháp định lượng Paracetamol chính thức trong Dược điển Việt Nam lần xuất bản tới để thống nhất tiêu chuẩn trong cả nước

r—-~-Mục tiêu của đề tài này là khảo sát phần định lượng nhằm đưa ra một phương pháp định lượng Paracetamol thích hợp với Việt Nam để chuyển tới hội đồng Dược điển tham khảo, xem xét việc đưa tiêu chuẩn này vào Dược điển Việt Nam xuất bản trong thời gian tới

PHẦN 2 TỔNG QUAN2.1 PARACETAMOL [7] [15]

* Công thức phân tử: C8H9N 02

* Công thức cấu tạo HO-<\0^)-NH-COCHg

* Tên khoa học: N-Acetyl p.Aminophenol; p.Hydroxyacetanilid;

Acetamidophenol

* Tên khác: Acetaminophen

* Điều chế theo sơ đồ sau:

C6H5-OH NítroS° ho^ HO- C,H4-N 0, Khửhoá^ HO-C6H4-NH2 Amid hoá >

- Cho phản ứng của -OH phenol tự do: với Fe3+ cho màu lam tím

- Dễ bị thuỷ phân do chức amid không bền

* Tạp chất cần chú ý là p.aminophenol, thường xác định giói hạn tạp chất này bằng phép đo Nitrit

* Công dụng: Ngoài tác dụng giảm đau, hạ nhiệt, còn có tác dụng làm(fhử giãn cơ; không gây kích ứng dạ dầy, dung nạp tốt.

2.2 ĐIỂM QUA MỘT s ố PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL

2 2 1 Đ ịn h lượng b ằ n g N itrit [9] [26] Thuỷ phân Paracetamol để giải

phóng nhóm amin thơm bậc I, định lượng nhóm amin thơm này bằng dung dịch

Natri nitrit trong môi trường HCL

2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại [22] [24]

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử Paracetamol

trong môi trường acid có cực đại hấp thụ tại 245 nm; trong môi trường kiềm có

cực đại hấp thụ tại 257 nm

2.2.3 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với Detector u v [6] [19] [21]

Nguyên tắc định lượng; Dựa vào việc đo chiều cao hay diện tích pic

2.2.4 Định lượng Nitơ bằng phương pháp Kendal (Kieldahl)

[3] [23] Phương pháp này dựa trên sự phân huỷ các phân tử hữu cơ có chứa Nitơ

khi đun với H2S 0 4 đặc với sự có mặt của Kali hay Natri sulfat Khi đó Nitơ

chuyển thành NH3, kết hợp với H2S 0 4 thành (NH4)2S 0 4 Thêm NaOH vào hỗn

hợp phản ứng rồi cất kéo NH3 giải phóng ra bằng hơi nước vào dung dịch chuẩn

H9S 0 4 0,1N quá thừa, chuẩn độ acid dư bằng dung dịch NaOH 0,1N

Để phân huỷ dễ dàng các chất có chứa Nitơ bằng phương pháp Kendal, ta

thường dùng xúc tác như: CuO, CuS04, Selen, Selen oxyd, Pt, Pd, Selen clorid

Thêm Na2S 0 4 hay K2S 0 4 làm tăng độ sôi của H2S 0 4 làm phản ứng oxy hoá-

nhanh hơn

2.2.5 Định lượng theo phương pháp chuẩn độ gốc amin tự do

[18] [20] Trong dung dịch acid có mặt một chất khử, Ceri IV kết hợp một điện tử

và chuyển thành Ceri III

Trong phương pháp chuẩn độ đo Ceri, người ta sử dụng íeroin để phát hiện điểm kết thúc Feroin là phức chất sắt của 1,10 diazaphenantren (o-Phenantrolin) Sắt ở trong phức hợp này có thể là sắt II hoặc sắt III Phức chất sắt II có màu đỏ, còn phức chất sắt III có màu xanh Khi đến điểm tương đương, lượng Ceri IV quá thừa sẽ oxy hoá phức chất sắt II thành sắt III và chỉ thị sẽ chuyển màu

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TRONG KHOÁ LUẬN

2.3.1 Phương pháp đo Nitrit [6] [9] [17] [26]

HO-C6H4-NH2 + NaN02 + 2HC1 -> [H0-C6H4-N+=N]C1- + NaCl + 2H20 (2)

* Điều kiện đ ể thực hiện phản ứng (2):

(+) Nhiệt độ:

- Ở nhiệt độ cao >18°c sẽ xảy ra phản ứng sau:

HN02 —> H20 + NO (3) làm mất một lượng chất chuẩn NaNOo / '

- Còn nếu nhiệt độ quá thấp thì phản ứng xảy ra quá chậm, rất khó xác định được điểm kết thúc của phản ứng

2.3.I.2 Chọn cách xác định điểm kết thúc:

+ Dùn2 chỉ thi ngoai: dung dịch Kl/hồ tinh bột, tẩm lên giấy lọc, phơi khô Thỉnh thoảng lấy 1 giọt hỗn họp định lượng chấm lên giấy

2KI + 2NaN02 + 4HC1 -> I2 + 2NaCl + 2NO + 2H20 + 2KC1 (4)

Iod giải phóng sẽ phản ứng với hồ tinh bột tạo ra màu xanh

Nhược điểm: Nếu phản ứng chậm thì không biết thời điểm nào phản ứng kết thúc và mỗi lần chấm mất 1 giọt nên gây sai số

+ Dùng chỉ thi nôi:

- Đỏ trung tính: chuyển từ màu đỏ hồng sang xanh lơ

- TropeolinOO: chuyển từ màu từ đỏ sang vàng, vì hai màu này đều thuộc gam màu sáng, khó phát hiện sự chuyển màu nên ta trộn thêm Xanh methylen vào để màu chuyển từ hồng tím sang xanh lơ hoặc xanh lá mạ, dễ phát hiện hơn

Muốn chỉ thị chuyển màu đúng điểm tương đương thì nồng độ acid ban đầu phải trong khoảng giới hạn Đối với trường hợp Paracetamol, ta phải qua giai đoạn thuỷ phân bằng HC1 10% nên không thể khống chế được nồng độ acid sau khi thuỷ phân Vì vậy sau khi thuỷ phân xong, nếu định lượng ngay thì không chính xác Hơn nữa nếu sản phẩm tạo ra có màu thì càng gây khó khăn hơn trong việc phát hiện sự thay đổi màu của chỉ thị khi phản ứng kết thúc.

+ Chuẩn đô đo thế: Khi OH-C6H4-NH2 phản ứng hết vói HN02 thì khi thêm NaN02 sẽ làm chuyển trạng thái tạo ra bước nhảy thế Nhờ đó ta có thể phát hiện được điểm kết thúc của phản ứng

Cặp điện cực thường dùng là: (1) Calomen bão hoà-Pt

(2) Điện cực Ag-Pt

ưu điểm: Không phụ thuộc vào nồng độ acid, miễn là đủ lượng cho phản ứng xảy ra hoàn toàn; không phụ thuộc vào việc muối diazoni tạo ra có màu gì hay không màu; có độ nhạy cao; tránh sai số chủ quan khi nhìn mắt; có thể chuẩn độ chọn lọc amin thơm bậc I trong hỗn hợp có nhiều thành phần

+ Chuẩn đô Amve (đo d ò m ): Cặp điện cực dùng có thể là:

- Một điện cực chỉ thị và một điện cực so sánh: Chọn thế làm phân cực điện cực chỉ thị Vẽ đường cong chuẩn độ: sự phụ thuộc dòng khuếch tán vào thể tích dung dịch chuẩn độ Đường cong chuẩn độ gồm hai đoạn thẳng cắt nhau, điểm cắt nhau đó ứng với điểm kết thúc của phản ứng

- Hai điện cực chỉ thị: Cả hai điện cực được nhúng vào dung dịch phân tích Giữa hai điện cực có sự chênh lệch thế, trên điện cực xảy ra phản ứng điện hoá, từ đó có dòng điện qua mạch Thế phân cưc hai điện cực khoảng 0,01-0,1 V Ghi lại đường cong chuẩn độ để xác định điểm kết thúc

Nhận xét: Chuẩn độ Ampe có ưu điểm là chỉ cần ghi kết quả một số điểm trước và sau tương đương để vẽ đường cong chuẩn độ trong khi đó chuẩn độ đo

thế phải xây dựng đường cong chuẩn độ từ nhiều điểm Tuy nhiên, ở Việt Nam

máy đo dòng chưa phổ biến, mà chủ yếu là sử dụng máy đo thế

Từ những nhận xét trên, nên chọn cách phát hiện điểm kết thúc bằng

phương pháp đo th ế là thích hợp vì máy đo pH-mV sẵn có ở trong nước.

2.3.I.3 Chuẩn độ đo thế: [6] [10] [16] [17]

* Cách xác định điểm kết thúc (Vkt) của phản ứng: Trong chuẩn độ đo

thế, điểm kết thúc được phát hiện thông qua bước nhảy thế

- Phương pháp tính Vkt dựa vào đạo hàm bậc 2 : Chỉ cần ghi lại kết quả

đo thế tại gần điểm kết thúc Ta thêm các cột giá trị ÀE/AV và A2E/AV2

Bảng 1: Ví dụ về cách xử lý kết quả của phương pháp chuẩn độ đo thế

Ta thấy giá trị A2E/ÀV2 tăng dần và sau đó chuyển qua giá trị 0 khi thể tích

dung dịch chuẩn độ vào khoảng 25,0 và 25,1 ml Vì 0,1 ml gây ra tổng thay đổi

giá trị A2E/AV2 là +12000-(-22400) = 34400, phân số (12000/34400).0,1 là xấp

xỉ số ml thêm vào từ thể tích 25,0 để À2E/AV2 đạt được giá trị 0 Do vậy, thể tích

tại điểm kết thúc được tính là:

a2e/a v2

Hình 3: Đồ thị phụ thuộc giữa À2E/AV2 và V

2.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại [11] [22] [24]:2.3.2.I Đại cương về phương pháp [2] [6]

Nguyên tắc: Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng ỵ và cường độ

lo qua dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là 1 Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) đi qua dung dịch, sự liên quan các đại lượng được biểu thị bằng phương trình sau:

log — = log ị = k.C l = E k: hệ số hấp thụ

C: nồng độ chất hoà tan trong dung dịch

T = I/Io = độ truyền qua E: độ hấp thụ

Độ hấp thụ E có giá trị cực đại khi đo ởbước sóng hấp thụ cực đại

Hệ số k là một hằng số đối vói một chất, do đó nồng độ của chất hoà tan phụ thuộc bậc nhất theo độ hấp thụ

Định luật Lambert-Beer cho phép xác định nồng độ của các dung dịch hấpthụ bức xạ điện tử bằng cách đo độ hấp thụ: Q - J _ £

k í

Trong thực tế thường gặp các trưòng hợp không tuân theo đúng định luật

Lambert-Beer Khi đó, ta dùng đường cong chuẩn "Mật độ quang/Nồng độ" để

suy ra kết quả định lượng

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến được áp dụng để định

tính, thử tinh khiết và định lượng các chất có cấu tạo đặc biệt (Ví dụ: hợp chất

thơm, hợp chất có liên kết chưa bão hoà, các chất có màu )

Định lượng một chất bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở độ dài sóng

xác định, thường là ở độ dài sóng hấp thụ cực đại (A,max) Nồng độ c của dung

dịch được tính theo công thức: c = — E

k l'

Để tính hệ số hấp thụ k, ta đo độ hấp thụ của các dung dịch có nồng độ đã

1biết rồi tính theo công thức: k = —— E

c.l

Nếu nồng độ được tính bằng mol/lít và chiều dày lớp dung dịch đo bằng

cm, thì hệ số đó được gọi là hệ số hấp thụ phân tử gam và được ký hiệu là 8

Nếu nồng độ được biểu thị bằng số gam trong 100 ml (nồng độ %) và

chiều dày lớp dung dịch đo bằng cm thì hệ số đó được gọi là hệ số hấp thụ riêng

và được ký hiệu bằng E (1%, lcm) hay E 1]

2.3.2.2 Một sô kỹ thuật định lượng

* Dựa vào hệ sô hấp thụ riêng: Đo độ hấp thụ E của dung dịch thử tại cực đại hấp thụ X,max Tính nồng độ c của dung dịch thử dựa vào giá trị E ’ ] đã được

xác định dựa vào chất chuẩn (tra cứu): E = E ' I C = > C = — (Với 1 = 1 cm)

e ; Nhận xét: Phương pháp này yêu cầu phải có một máy quang phổ chuẩn

* Phương pháp so sánh: Đo độ hấp thụ Ex, Ec của dung dịch thử được pha từ mẫu thử có nồng độ Cx (chưa biết) và dung dịch chuẩn được pha từ chất

chuẩn có nồng độ Cc (đã biết): = = — Cc

Nhận xét: Phương pháp này luôn phải có chất chuẩn hay chất đối chiếu Tuy nhiên cho kết quả tin cậy và ít phụ thuộc vào độ phân giải của máy quang phổ

chuẩn hay chất đối chiếu, đo E của chúng ồ bước sóng đã chọn, lập đồ thị E-C

Đo Ex của dung dịch trên và xác định Cx dựa trên đường chuẩn (Hình 4)

PHẨN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ■ ■

3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

3.1.1 Nguyên liệu

Paracetamol nguyên liệu do phòng giáo tài cung cấp

Paracetamol chất đối chiếu do Viện kiểm nghiệm cung cấp

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu

* Bằng thực nghiệm, dựa vào các kết quả thu được để xử lý thống kê và rút

ra những kết luận

* Hai phương pháp được sử dụng trong thực nghiệm là:

- Phương pháp định lượng Paracetamol bằng đo Nitrit

- Phương pháp định lượng Paracetamol bằng quang phổ hấp thụ uv.

- Máy đo thế mV-pH meter 3305 Jenway

- Cặp điện cực Calomen bão hoà-Pt

- Máy khuấy từ

- Bộ dụng cụ thuỷ phân với ống sinh hàn hồi lưu

- Một số dụng cụ thuỷ tinh khác

3.2.1.2 Thuốc thử: Chuẩn bị theo Dược điển Việt Nam II, tập 3

- Dung dịch Natri nitrit 0,1 N

- Dung dịch Acid Hydro cloric 10%

- Kali bromid

3.2.1.3 Quy trình định lượng

Cân chính xác một lượng chế phẩm khoảng 0,25 g (p g) cho vào bình cầu dung tích 100 ml, thêm 10 ml dung dịch HC1 10%, đun hồi lưu cách thủy trong khoảng thời gian thích hợp Rửa ống sinh hàn bằng khoảng 10 ml HC1 10%, thêm Ig Kalibromid, để nguội và làm lạnh trong nước đá Định lượng bằng dung dịch Natri nitrrit 0,1N Xác định điểm kết thúc (Vkt) bằng phương pháp đo thế

Cứ 1 ml dung dịch Natri nitrit 0,1M tương ứng 0.01512 g C8H9N 0 2 Hàm lượngphần trăm CgH9N 0 2 được tính theo công thức sau: ỵoỵ0_ ^-0,01512.100

Bảng 2: Liên quan giữa các đại lượng trong phương pháp đo thế

* Lựa chọn cách xác định Vkt của phản ứng

Cách 1: Dựa trên sự phụ thuộc %iữa qiá trị E và V

700 680

- Cách 2: Dựa trên sự phụ thuộc qiữa qiá trị AE/AVvà V

dE/dV

Hình 6: Đổ thị liên quan giữa AE/AV và V

Xắc định điểm kết thúc: Từ đỉnh của đường cong, kẻ một đường thẳng vuông góc với trục thể tích Từ đó xác định được Vkt « 14,30 ml

Nhận xét: Cách này có ưu điểm hon cách 1 vì thống nhất được việc xác định đỉnh của đường cong hơn Tuy nhiên, cách xác định này lại mắc sai số giọt

từ buret vì ta không thể nhỏ dần dần được từng lượng dung dịch chuẩn xuống mà mỗi lần ta thường phải thêm khoảng 0,05 ml dung dịch chuẩn Vì vậy giá trị AE/ÀV lớn nhất (ứng với đỉnh của đường cong chuẩn độ trên hình 6) thường là không ứng với điểm kết thúc Vì vậy ta sẽ mắc phải một sai số giọt từ buret

- C ách 3 :Dựa vào sự phụ thuộc qiữa qiá trị À2E/ÀV2và V

d2Đdv’

50000

-50000 i

Hình 7: Đồ thị liên quan giữa À2E/ÀV2 và V

Xác định điểm kết thúc: Vkt chính là giao điểm của đường cong với trục V Vậy ta xác định được V k t« 14,28ml

Nhận xét: Cách 3 giúp ta dễ dàng xác định được Vkt với độ chính xác cao hơn cách 1 và 2 Tuy nhiên, để chính xác hơn thì ta cần chia trục thể tích nhỏ hơn nữa, mà điều này là không thật tiện lợi bỏi vì muốn nhìn rõ được vạch chia thì đồ