Nghiên cứu sản xuất igg KHÁNG DỊCH HẠCH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT  NGUYỄN THỊ LOAN BỨỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ÑAØ LAÏT – 2010 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT  NGUYỄN THỊ LOAN BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 30 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN BỔN Đà Lạt - 2010 2 Luận văn này được hoàn thành tại: Phân xưởng Vắc xin thành phẩm – Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN BỔN Phản biện 1: …………………………………………………….. Phản biện 2: …………………………………………………….. Luận văn này sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm thi luận văn Thạc sĩ họp tại: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………… Vào lúc: …… giờ, ngày………..tháng………năm 2010 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Đà Lạt 3 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:  Ban giám hiệu và các thầy cô giáo Khoa Sau đại học - trường Đại học Đà Lạt đã tạo điều kiện cho tôi học tập, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường.  Tiến sĩ Phan Bổn, Quản đốc phân xưởng Vắc xin thành phẩm, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đề tài.  Ban giám đốc Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt đã cho phép và tạo điều kiện cơ sở vật chất để tôi thực hiện đề tài.  TS. Nguyễn Xuân Tùng đã tận tình giúp đỡ, cung cấp cho tôi một số tài liệu để tôi hoàn thành luận văn.  Các anh chị cùng các cô kĩ thuật viên của phân xưởng Vắc xin thành phẩm đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.  CN. Trần Ngọc Nhơn, CN. Đặng Hồng Vân Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện một số kĩ thuật trong phòng thí nghiệm để tôi hoàn thành đề tài.  Thầy Nguyễn Văn Chức, cán bộ thư viện trường Đại học Đà Lạt đã nhiệt tình giúp tôi tìm kiếm thông tin, tài liệu để tôi thực hiện đề tài.  Gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Học viên: Nguyễn Thị Loan 4 ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra. Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét. Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong. Tuy đã được phát hiện từ lâu nhưng hiện nay các ổ dịch thiên nhiên vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực trên trái đất. Trong gần nửa thế kỉ qua có 7 quốc gia trên thế giới bệnh xảy ra hàng năm là Brazil, Cộng hòa Dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanma, Pêru, Hoa Kì và Việt Nam [6,23,50]. Hiện nay bệnh dịch hạch vẫn còn tồn tại ở nhiều khu vực trên thế giới, đặc biệt là ở Châu Phi. Gần đây nhất tháng 08/2009 ở Trung Quốc dịch hạch thể phổi đã xuất hiện làm 3 người thiệt mạng, 12 người bị nhiễm bệnh và hơn 10.000 người bị cách ly [57]. Ở Việt Nam, dịch hạch đã xuất hiện lần đầu tiên ở Nha Trang ( 1898 ) và Sài Gòn (1906). Kể từ khi xuất hiện, dịch hạch tiếp tục lây lan ra các tỉnh, thành trong cả nước và trở thành dịch lưu hành địa phương. Khu vực miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ là những nơi có tỉ lệ mắc dịch hạch cao nhất trong cả nước. Đặc biệt là giai đoạn 1966 – 1972 dịch lớn xảy ra ở Việt Nam chiếm hầu hết số mắc trên thế giới. Số mắc và tử vong dịch hạch có chiều hướng giảm mạnh và phạm vi dịch hạch lưu hành thu hẹp nhiều. Trong bốn năm từ 1999 – 2002 dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương là hai tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai. Hiện nay, ở Việt Nam bệnh dịch hạch đã được kiểm soát, chỉ còn tồn tại ở các ổ dịch trong thiên nhiên trong các loài gặm nhấm, không còn xuất hiện ở người và chủ yếu là ở Tây Nguyên [5, 6, 16]. Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ học vẫn phải được tiến hành thường xuyên bởi dịch có thể xuất hiện bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi và gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc sống của con người. Điển hình là dịch hạch thể phổi đã bùng phát ở Trung Quốc tháng 08 vừa qua cho thấy công tác 5 điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch không thể chủ quan. Vì vậy để phát hiện sớm dịch hạch trong các vật chủ ở các ổ dịch hiện nay thì đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác. Trong những năm qua để chẩn đoán labo và điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch ngoài thực địa, hầu như tất cả các labo trong nước đều sử dụng các chế phẩm chẩn đoán dựa trên các bộ kít chẩn đoán dịch hạch của Liên Xô cũ là bộ kít kháng nguyên F1 gắn hồng cầu cừu đông khô và kháng thể F1 gắn hồng cầu cừu dạng đông khô hoặc dạng nước, nguồn cung cấp này ngày càng ít đi và hầu như không còn. Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã dùng kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên F1 đặc hiệu của vi khuẩn dịch hạch, đây là phương pháp chẩn đoán cho kết quả chỉ sau vài giờ và độ chính xác lên tới 98 – 99,4%. Tuy vậy ở Việt Nam chưa có labo nào sản xuất bộ kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện vi khuẩn dịch hạch, vì thế để có nguồn nguyên liệu IgG sản xuất kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang đáp ứng nhu cầu giám sát dịch tễ học dịch hạch trong nước, chúng tôi tiến hành đề tài sau: BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH Mục tiêu đề tài: - Sản xuất IgG kháng dịch hạch - Đánh giá chất lượng IgG sản xuất được. Các nội dung đề tài cần tiến hành: - Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch - Nghiên cứu phát đồ gây miễn dịch - Ứng dụng các phương pháp tinh chế kháng thể IgG - Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng IgG sản xuất. 6 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DỊCH HẠCH 1.1.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới [ 6, 20, 23, 57] Vào năm 1894, Alexandre Yersin đã phát hiện ra vi khuẩn Yersinia pestis là tác nhân gây ra bệnh dịch hạch. Kể từ khi xuất hiện, dịch hạch đã gây ra các vụ đại dịch lớn trên thế giới. Đại dịch lần thứ I xảy ra ở Trung Phi ở thế kỉ VI sau đó lan đến Hy Lạp và Địa Trung Hải đã làm cho 100 triệu người chết. Đại dịch lần thứ II xuất hiện ở Trung Á quanh biển Caspies vào thế kỉ thứ XIV sau đó xâm nhập vào Châu Âu, làm chết khoảng 50 triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu chiếm 1/3 dân số Châu Âu thời kì đó. Đại dịch lần thứ III bắt đầu từ Yunnan Trung Quốc lan đến Hồng Kông (1894). Trong vòng 10 năm ( 1894 – 1903 ) dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu. Từ 1954 – 2001, tổ chức Y tế thế giới đã ghi nhận có 38 quốc gia xảy ra bệnh dịch hạch với tổng số mắc là 89.651 trường hợp và 7.715 bệnh nhân chết. Từ 1989 – 2003, bệnh dịch hạch có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là ở Châu Phi với số mắc là 31.273 trường hợp, chiếm tỉ lệ 82,5% tổng số mắc trên thế giới và số chết là 2.421, chiếm tỉ lệ 7,74%. Theo phát hiện mới nhất tháng 08/2009 tại thành phố Ziketan, tỉnh Thanh Hải, tây bắc Trung Quốc dịch hạch thể phổi đã bùng phát làm 3 người chết và 12 người bị nhiễm bệnh, 10.000 người đã bị cách ly để ngăn chặn dịch. Sau nhiều năm im lặng, việc xuất hiện lại bệnh dịch hạch trên người ở Ấn Độ 1994, ở Algeria vào năm 2003 và gần đây nhất là năm 2009 ở Trung Quốc đã cho 7 thấy rằng bệnh dịch hạch chưa được loại trừ hoàn toàn và là bệnh nguy hiểm có nguy cơ bùng phát bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi. 1.1.2 Tình hình dịch hạch ở Việt Nam [ 5, 6, 16 ] Từ đại dịch lần thứ III ở Hồng Kông, dịch hạch đã xâm nhập vào Việt Nam lần đầu tiên năm 1898. Trong suốt hơn một thế kỉ qua dịch hạch vẫn luôn tồn tại với những thời kì khác nhau và chưa được loại trừ hoàn toàn. Thời kì xâm nhập và lây lan nội địa ( 1898 – 1922 ) Xuất hiện lần đầu tiên tại Nha Trang ( 1898 ) dịch hạch tiếp tục lưu hành ở Sài Gòn ( 1906 ); Lạng Sơn ( 1909 ); Sóc Trăng ( 1907 ); Hà Nội, Phan Thiết và Huế (1908); Phan Rí , Đà Nẵng ( 1910 ). Thời kì lắng dịu và trở thành dịch hạch lưu hành tại địa phương ( 1923 – 1990 ) Thời kì này bệnh chỉ còn lưu hành ở một số tỉnh như: Phan Thiết, Sài Gòn. Từ hai nơi này có một số thời điểm dịch lan rộng như Lâm Đồng ( 1947, 1948, 1950 ), Bình Long và Tây Ninh ( 1955 – 1956). Thời kì bùng phát lan tràn và lưu hành trên diện rộng ( 1961 – 1990) + 1961 – 1975: dịch hạch bùng phát, lan tràn hầu hết các tỉnh thành ở miền Nam. Đặc biệt giai đoạn 1967 – 1971 dịch lớn xảy ra ở Việt Nam với số mắc là 21.716 bệnh nhân, chiếm 97,2% số mắc ở Châu Á và 89,2% số mắc trên toàn thế giới. + 1976 – 1990: dịch lây lan trên diện rộng ở các tỉnh phía bắc như Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Thái, Hà Sơn Bình, Hải Hưng, Hà Nam Ninh, Thanh Hóa và Nghệ Tĩnh. Thời kì thu hẹp và lưu hành dai dẳng tại một số ổ dịch ( từ 1991 đến nay ) Từ 1991 đến nay dịch hạch ở nước ta có xu hướng giảm xuống nhưng vẫn còn tồn tại ở một số tỉnh miền Trung, Đông Nam Bộ, nhiều nhất là ở các tỉnh Tây 8 Nguyên. Trong 4 năm ( 1999 – 2002 ) dịch chỉ còn ghi nhận tại 2 tỉnh Đắc Lắc với 194 bệnh nhân và Gia Lai 61 bệnh nhân. Nhìn chung, tình hình dịch hạch ở Việt Nam hiện nay đã được khống chế. Tuy nhiên vẫn tồn tại một số ổ dịch lẻ tẻ trong tự nhiên, chủ yếu là trên loài động vật gặm nhấm. Do đó công tác chẩn đoán huyết thanh và điều tra giám sát dịch tễ học vẫn cần tiến hành thường xuyên. 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH 1.2.1 Phân loại vi khuẩn dịch hạch Tại hội nghị quốc tế vi sinh vật học lần thứ 10 ( 1970 ) đã quyết định phân loại vi khuẩn dịch hạch như sau: Vi khuẩn dịch hạch thuộc giống Yersinia, loài pestis, họ Enterobacteriace . Giống Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài gây bệnh cho người: Yersinia pestis: gây bệnh dịch hạch Yersinia pseudotuberculosis: gây bệnh giả lao Yersinia enterocolitica: gây viêm ruột đại tràng 1.2.2 Hình thể và tính chất bắt màu [ 2, 19 ] Yersin (1894) là người đầu tiên mô tả hình thái vi khuẩn dịch hạch, tiếp theo là Gabritrevsky (1897), Allerecht và Ghon (1900) cũng mô tả tương tự. Vi khuẩn dịch hạch là trực khuẩn ngắn, hình bầu dục, tròn hai dầu, dài 1-2 μm, rộng 0,3-0,7 μm. Vi khuẩn không có lông, không di động, không sinh nha bào, nếu nuôi cấy ở 370C thì có vỏ. Chúng thường nằm riêng lẻ hay từng cặp, ít khi xếp thành đám. Vi khuẩn bắt màu lưỡng cực, Gram ( - ) rất rõ khi nhuộm bằng phương pháp Wayson. Trên các tiêu bản khác nhau, hình thể và cách sắp xếp của vi khuẩn dịch hạch có thể khác nhau. 9 Hình 1.1: Hình thể Yersinia pestis nằm riêng lẻ. 1.2.3 Tính chất nuôi cấy [ 2 ] Yersinia pestis là vi khuẩn hiếu khí. Sokkey (1938), Habbu (1943), Turnansky (1958) và những người khác cho rằng vi khuẩn dịch hạch có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ -20C - 450C , nhiệt độ thích hợp hơn là 270C - 280C; pH tối thích là 6,9 – 7,1. Vi khuẩn có thể sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường canh thang: Sau 24- 48 giờ vi khuẩn tạo thành những bông tuyết lơ lửng trong canh thang bám vào thành ống nghiệm, dưới đáy có lắng cặn nhưng canh thang vẫn trong. Trên bề mặt có thể tạo thành một váng mỏng khi thời gian nuôi cấy kéo dài, đây là cách mọc theo lối ngưng kết. Trên môi trường thạch đặc: Sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn dịch hạch tạo thành khuẩn lạc dạng R điển hình có kích thước 2-3mm, màu trắng trong, bờ dẹt. Nếu nhìn dưới kính hiển vi thấy ở giữa có các hạt màu nâu xám, bề mặt xù xì lồi cao, trong có hình răng cưa. Nếu để 10 khuẩn lạc tiếp tục phát triển ở giữa tối dần và lồi cao hơn, vùng răng cưa xung quanh giảm dần rồi mất hẳn. Dù là môi trường nào đi nữa, theo Girard: “ Tất cả các giống vi khuẩn nào làm đục môi trường thì không phải là trực khuẩn dịch hạch”. Tính chất sinh trưởng của Y.pestis trên môi trường nuôi cấy sẽ thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường và nhiệt độ. Nhiều tác giả đã nghiên cứu về nguyên nhân cũng như ý nghĩa thực tiễn của các yếu tố này. 1.2.4 Tính chất sinh hóa:[ 2, 27, 33 ] Thành phần sinh hóa của Yersinia pestis: Nước chiếm tỉ lệ từ 75-85% trọng lượng tế bào vi khuẩn. Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Thành phần khô của Yersinia pestis được tạo thành từ các chất vô cơ và hữu cơ, gồm: + Các chất khoáng (chiếm 3,5 - 4%): gồm phospho, kali, natri, magie, lưu huỳnh, canxi,clo và sắt. + Các chất hữu cơ gồm: protein chiếm khoảng 62-77%, acid nucleic 8-14,8% và glucid chiếm 2,5 - 20% phần khô của tế bào. Tính chất sinh vật hóa học: Yersinia pestis có khả năng tổng hợp các loại enzym cần cho quá trình trao đổi chất. Một số phản ứng sinh hóa trong quá trình trao đổi chất đã được dùng để chẩn đoán và phân chia giữa các loài VKDH từ các ổ dịch thiên nhiên khác nhau. Y. pestis có khả năng phân giải không sinh hơi các loại đường: glucose mannitol, levulose, galactose, mantose, không len men đường rhamnose, lactose và melibiose. Sản phẩm của sự phân giải này được Y. pestis sử dụng làm nguồn nguyên liệu và năng lượng để xây dựng tế bào. Ngoài ra, một số sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi glucid còn tham gia tích cực vào các phản ứng quan trọng khác của sự trao đổi chất. Hầu hết các chủng VKDH không sinh indol, H2S; không có khả năng 11 phân giải urê. Kết quả phản ứng khử nitrat và lên men glycerol khác nhau được sử dụng để phân chia các nhóm trực khuẩn dịch hạch. 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên [ 21, 26, 30, 32, 37, 38, 48, 50 ] Schiitre là người đầu tiên nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên của Y. pestis. Bằng phương pháp hấp phụ và kết tủa ông đã thu được kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân. Các nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc kháng nguyên của Y. pestis được mở ra khi các nhà khoa học sử dụng phương pháp kết tủa trong thạch. Allan và cs, Crumpton và Davies đã xác định thành phần của Y. pestis gồm: - Kháng nguyên vỏ - Kháng nguyên độc tố. - Kháng nguyên do các thành phần polysaccarit không đóng vai trò bảo vệ Số lượng kháng nguyên của VKDH được phát hiện nhiều nhưng chỉ có một số được nghiên cứu kĩ là KN F1, KN VW, KN độc tố, các chất và các men có hoạt tính kháng nguyên ( pesticine, congulase, fibrinolizine ). Kháng nguyên F1: KN F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có Y. pestis mới có KN F1. Các vi khuẩn nhóm khác không có KN này. William và cs đã nghiên cứu trên 300 chủng Y. pestis độc và không độc ( EV76) cho thấy tất cả các chủng đều có KN F1, bởi vậy KNF1 được dùng cho chẩn đoán dịch hạch. Khi nuôi cấy Y. pestis ở 370C, F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt tế bào. Còn khi nuôi cấy ở 280C, F1 chỉ được hình thành rất ít và nằm dưới dạng kết hợp với các thành phần khác. KN F1 có trọng lượng phân tử là 2.032.229 Da. Phân tử protein KN F1 có cấu trúc bậc 4 với kiểu tác dụng tương hỗ không hóa trị và kị nước. KNF1 dạng keo có cấu trúc bên trong theo kiểu hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm và kênh nhỏ xác định nó như một màng sinh học phụ thêm của thành phần tế bào. KN F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc biệt đã tạo cho nó có tính đề kháng cao với các nhân tố hóa lí. KN F1 bền với nhiệt, đun nóng 80-1000C trong 15 12 phút mới làm biến đổi các hapten của nó và chỉ bị phân hủy hoàn toàn khi nung nóng 1000C/1 giờ. KN F1 là yếu tố độc lực chủ yếu có khả năng chống lại thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân. KN F1 có tính sinh miễn dịch. KN F1 có khả năng kích thích tạo ra kháng thể chống lại nhiễm trùng ở động vật. Một tính chất quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh KN F1 trợ giúp cho Y. pestis trốn được thực bào. KN F1 có tính đa năng là một KN quan trọng nhất của Y. pestis, một nhân tố miễn dịch tích cực hàng đầu và có tính đặc hiệu cao duy nhất chỉ có ở Y. pestis. Do đó KN F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh bệnh dịch hạch. Kháng nguyên V và W: Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y. pestis nhờ kháng nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với KN F1. Những chủng không độc thiếu KN F1 có thể kháng thực bào nhờ các kháng nguyên này. Y. pestis sản sinh kháng nguyên V và W đồng thời chứ không tách biệt. Kháng nguyên W được tiết tự do vào môi trường xung quanh, kháng nguyên V liên kết chặt chẽ với tế bào vi khuẩn. Lawton và cs lần đầu tiên đã tách được kháng nguyên này dưới dạng tinh khiết và chỉ ra rằng KN V là protein có trọng lượng phân tử 90.000 Da và KN W là lipoprotein với trọng lượng phân tử 145.000 Da. Kháng nguyên độc tố: Y. pestis có 2 loại độc tố chính xác định khả năng gây bệnh là nội độc tố và ngoại độc tố. + Nội độc tố: Nội độc tố dịch hạch là một thành phần cấu trúc của vách tế bào và có liên quan chặt chẽ với lipopolisacarit (LPS) nội độc tố của các vi khuẩn gram (-) khác. Vào năm 1956, David đã mô tả thành phần hóa học của LPS được chiết xuất bằng phenol và nước từ Y. pestis. LPS có tất cả các đặc tính gây bệnh và tất cả những tính 13 chất sinh học như gây sốt lưỡng pha ở thỏ, choáng, gây chết ở động vật do sự hủy hoại mao mạch, hoại huyết ở thận, gan và các tổ chức khác. Ảnh hưởng sinh học khác của độc tố vi khuẩn dịch hạch có thể gây nhiễm cho con người đã được Walker chứng minh trên động vật thí nghiệm. Chúng ảnh hưởng đến sự trao đổi chất như làm giảm glycogen ở gan và máu, đồng thời tăng urê máu hoặc suy yếu chức năng của thận và trao đổi chất cacbon. + Ngoại độc tố: Ngoại độc tố dịch hạch là các enzym ngoại tiết của vi khuẩn. Ngoại độc tố là một dạng protein hòa tan gọi là độc tố murin rất độc đối với chuột nhắt nhưng ít gây chết đối với những động vật khác. Độc tố murin chỉ có ở màng tế bào vi khuẩn. Ngoại độc tố murin ức chế chức năng hô hấp của ti thể ở tế bào chuột nhưng không ức chế ti thể ở tế bào thỏ, khỉ và tinh tinh. Độc tố murin còn làm ti thể phồng lên và mất đi khả năng nhận dạng ion canxi và photpho vô cơ. Montie và cs đã phát hiện thêm murin có tác động đối kháng với AMP vòng. Việc tổng hợp munrin do plasmid Fral/Tox điều khiển. 1.3 CÁC CON ĐƢỜNG LÂY TRUYỀN BỆNH DỊCH HẠCH Dịch hạch là bệnh chủ yếu của động vật hoang dại và chuột, người chỉ là vật chủ thứ yếu. Trong tự nhiên, bệnh lan truyền qua 4 con đường: ( trong đó chủ yếu lây qua đường máu ). + Đường máu: lây qua vết đốt côn trùng, chủ yếu là do bọ chét. Bọ chét hút máu làm lan truyền bệnh trong các giống chuột và từ chuột sang người. + Đường tiêu hóa: thực phẩm, nước bị ô nhiễm do chuột trực tiếp gieo rắc mầm bệnh vào, đường lây này trên thực tế ít nguy hiểm vì trực khuẩn dịch hạch dễ bị chết khi đun sôi nấu chín. + Đường hô hấp: từ bệnh nhân dịch hạch thể phổi có thể lây trực tiếp cho người xung quanh qua các giọt đờm, nước bọt bắn ra khi bệnh nhân ho, hắt hơi, nói chuyện (lây qua đường này rất nhanh) + Đường da, niêm mạc: qua tiếp xúc trực tiếp với vùng da tổn thương (hiếm gặp). 14 1.4 MIỄN DỊCH HỌC DỊCH HẠCH [ 47, 50 ] Sau khi xâm nhập qua da nơi vết đốt của bọ chét, Y. pestis bị sự tấn công bởi các globulin miễn dịch. Nhưng vi khuẩn được mang bởi bọ chét đã có sẵn một số kháng nguyên F1 có khả năng kháng thực bào, giúp vi khuẩn thích ứng với tình trạng ký sinh và phát triển nội bào. Cơ chế hoạt động kháng thực bào của KN F1 được làm rõ bởi R.C. Williams: hai yếu tố cần cho sự opsonins để tăng tính thực bào có hiệu quả là bổ thể C2 và C4 + C2 : gắn trên bề mặt đại thực bào, giúp đại thực bào tăng khả năng bắt giữ kháng nguyên. + C4 : góp phần ngưng tập bạch cầu đa nhân tạo ổ viêm sớm Tuy vậy C2 và C4 đã bị KN F1 hòa tan vào huyết thanh làm cho con đường hoạt hóa bổ thể bị gián đoạn. Do hoạt động kháng bổ thể cực mạnh của KN F1 nên ở giai đoạn ủ bệnh thế hệ sau trở nên đề kháng với sự thực bào và chúng được tung ra từ các hạch, lan rộng khắp cơ thể, điều này đã giải thích khả năng của Y. pestis giết được vật chủ mà nó ký sinh vào. 1.5 KHÁNG THỂ 1.5.1 Cấu trúc kháng thể [ 1 ] Các kháng thể ( antibody ) hay còn gọi là các globulin miễn dịch ( immunoglobulin ) có bản chất protein, do các tế bào lympho B cũng như các tương bào ( biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Phân tử globulin miễn dịch là một phân tử protein gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một: hai chuỗi nhẹ và hai chuỗi nặng nối với nhau bằng cầu disulfide và có độ đàn hồi nhất định. 15 Hình 1.2: Cấu trúc của một phân tử kháng thể Chuỗi nhẹ, kí hiệu L ( light chain ) Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử khoảng 23.000Da. Có 2 loại chuỗi nhẹ chung cho tất cả các lớp globulin miễn dịch: chuỗi nhẹ Kappa ( kí hiệu K), chuỗi nhẹ lambda (kí hiệu ). Tính kháng nguyên của hai loại chuỗi nhẹ này hoàn toàn khác nhau. Tỷ lệ mang chuỗi nhẹ K và của các phân tử globulin miễn dịch có khác nhau giữa các loài. Một phân tử globulin miễn dịch chứa chuỗi nhẹ K hoặc , không khi nào mang cả hai loại. Hai chuỗi nhẹ của phân tử globulin miễn dịch không những cùng loại mà còn hoàn toàn giống nhau về cấu trúc. Cho đến nay người ta thấy rằng chỉ có một chuỗi nhẹ K, nhưng có ít nhất 4 chuỗi nhẹ . Về cấu tạo chung, mỗi chuỗi nhẹ gồm 211- 221 axit amin và chia thành hai phần dài bằng nhau: + Phần hằng định, kí hiệu C (constant) tận cùng –COOH với trình tự axit amin tương đối hằng định và được kí hiệu là CK (cho typ Kappa ) và C ( cho typ lambda ). + Phần thay đổi, kí hiệu V ( variable ) tận cùng là - NH2. Trật tự axit amin trong phần này thay đổi theo từng nhóm một do đó nó khác nhau ngay cả trong một 16 cá thể, phần này được kí hiệu là VK ( cho typ Kappa ) và V ( cho typ lambda ). Trong phần này có những vị trí sắp xếp axit amin rất thay đổi. Chuỗi nặng, kí hiệu H ( Heavy chain ) Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 70.000 Da. Chúng được chia thành 5 lớp: , , , , . Các chuỗi nặng có tính đặc hiệu riêng và quyết định globulin miễn dịch thuộc lớp này. Tương ứng với mỗi lớp chuỗi nặng là một loại globulin miễn dịch, còn chuỗi nhẹ có thể là K hoặc . Chuỗi nặng có khoảng 440 axit amin và cũng chia thành 2 phần : + Phần hằng định ( C ) tận cùng bằng – COOH, có số axit amin nhiều gấp 3 lần số axit amin của phần hằng định chuỗi nhẹ, tức khoảng 330 axit amin. Do sự khác biệt về tính chất kháng nguyên ở vùng hằng định này mà một số lớp globulin miễn dịch còn được chia thành các lớp dưới như 1, 2, 3, 4 hoặc 1, 2. + Phần thay đổi: cũng giống như phần thay đổi của chuỗi nhẹ, vùng thay đổi chuỗi nặng ở phía tận cùng –NH2. Trong trật tự axit amin có một số đoạn cực kì thay đổi xen giữa những đoạn tương đối ổn định. Ở cả hai chuỗi nhẹ và chuỗi nặng, vùng cực kì thay đổi được xác định ở gần các axit amin 30, 50, 95. Những vùng cực kì thay đổi như thế tham gia trực tiếp vào việc hình thành vị trí kết hợp kháng nguyên. Các vùng hằng định không có vai trò nhận diện KN, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do đó phần “ chân của chữ Y” còn được gọi là Fc ( tức phần hoạt động sinh học của kháng thể ). Mỗi immunoglobulin có 4 vùng thay đổi ở đầu “ hai cánh tay của chữ Y”. Sự kết hợp của một vùng thay đổi trên chuỗi nặng ( VH ) và một vùng thay đổi trên chuỗi nhẹ (VL ) tạo nên vị trí nhận diện KN ( còn gọi là paratope ). Như vậy mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn KN. Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một KT có thể gắn được với 2 KN giống nhau. Hai “ cánh tay của chữ Y” còn gọi là Fab ( tức là phần nhận biết KN ). Nơi kháng nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope. 17 Hình 1.3: Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 1.5.2 Các lớp kháng thể Các kháng thể được chia thành 5 lớp là IgG, IgA, IgM, IgD và IgE, có thể tóm tắt một số đặc tính chính của các lớp kháng thể như sau: Vị trí chủ yếu Tỉ lệ ( tổng lượng KT/HT Trọng lượng phân tử (Da) Vai trò IgG Máu IgA Niêm nhầy các dịch tiết IgM Lympho máu IgD Lympho B 5 – 10% IgE Bạch cầu ái kiềm, tế bào mast < 1% 70 – 80% 10 – 15% 150.000 150.000 – 600.000 900.000 180.000 170.000 – 200.000 Trung hòa các độc tố, VK, virus Ngưng tụ, trung hòa VK, virus Ngưng tụ theo con đường cổ điển của bổ thể Dị ứng, trung hòa các ký sinh trùng Hoạt hóa các tế bào lympho B < 1% Bảng 1.1: Tóm tắt tính chất của các lớp globulin miễn dịch khác nhau 18 Hình 1.4: Cấu trúc một số lớp kháng thể 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN DỊCH HẠCH 1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng Là bước đầu tiên chính yếu trong công tác chẩn đoán dịch hạch đối với bất cứ người nào bị sốt, hạch rất đau, số lượng hạch nhiều, kích thước hạch lớn hơn hoặc bằng 0,1 cm, nghi ngờ mắc bệnh dịch hạch, sống trong vùng có dịch hạch lưu hành hoặc từ những vùng có dịch trở về. 1.6.2 Chẩn đoán vi sinh vật 1.6.2.1 Nhuộm soi Từ các bệnh phẩm và mẫu nghiệm làm tiêu bản và nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram và Wayson. Quan sát dưới kính hiển vi xác định hình thể và tính chất bắt màu của Y. pestis. 1.6.2.2 Nuôi cấy trực tiếp Trên môi trường thạch: Có thể sử dụng nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn dịch hạch: thạch máu, Hottinger, Brain heart infusion ( BHI). Cấy bệnh phẩm lên các môi trường này, ủ 280C, sau 24- 48 giờ, vi khuẩn dịch hạch phát triển tạo thành khuẩn lạc dạng R. 19 Trên môi trường lỏng: Cấy bệnh phẩm vào canh thang Hottinger hoặc BHI, ủ 280C, sau 24 - 48 giờ, VKDH mọc theo lối ngưng kết, không làm đục môi trường. 1.6.2.3 Tiêm truyền cho súc vật thí nghiệm Thường sử dụng chuột bạch hay chuột lang là súc vật nhạy cảm với vi khuẩn dịch hạch. Có thể tiêm dưới da, màng bụng hoặc xát da tùy theo mức độ tạp nhiễm của bệnh phẩm. Sau khi tiêm, chuột thường chết trong vòng 3- 10 ngày với các tổn thương xuất hiện ở gan, lách, hạch, phổi. Cấy các phủ tạng vào môi trường thạch, cấy máu tim vào canh thang và làm tiêu bản nhuộm soi. Tiếp tục quy trình như nuôi cấy trực tiếp. 1.6.3 Phƣơng pháp huyết thanh học [ 2, 3, 18, 26, 33, 35, 36, 40, 42, 45, 58 ] Trong thực tế điều tra giám sát dịch hạch, dùng phương pháp chẩn đoán vi sinh vật vẫn còn nhiều trường hợp không phát hiện được. Đặc biệt với các bệnh nhân đã được điều trị sớm với kháng sinh, những người sống trong các ổ dịch đã bị nhiễm khuẩn nhưng không phát bệnh, không có triệu chứng lâm sàng nhưng huyết thanh của họ có kháng thể kháng F1 hoặc trong trường hợp cần hồi cứu thì phương pháp huyết thanh học rất cần thiết. Một số kỹ thuật sau thường được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh dịch hạch. 1.6.3.1 Ngưng kết hồng cầu thụ động phát hiện kháng thể kháng F1 của Y. pestis Người đầu tiên mở ra triển vọng dùng hồng cầu làm yếu tố tạo ngưng kết chính là Salk ( 1944 ). Ông phát hiện thấy khi hồng cầu ở nồng độ thấp ( 2,5% ) nếu có chất làm chúng ngưng kết thì hồng cầu sẽ bao phủ đáy ống nghiệm màu hồng mờ hình cái dù. Nếu không có chất làm ngưng kết thì hồng cầu lắng xuống đáy hình tròn bờ đều rõ rệt. Tiếp theo, Boyden ( 1951 ) nhận thấy có thể gắn protein lên bề mặt các hồng cầu đã được xử lý bằng axit tannic, hồng cầu này bị ngưng kết bởi KHT đặc hiệu chống protein đó. Do kháng thể trong KHT kết hợp với KN là protein nên phản ứng 20 này được gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động. Ở đây hồng cầu đóng vai trò như chất chỉ thị vì vậy có thể đọc kết quả bằng mắt thường. Chen và Meyer ( 1966 ) đã hoàn thiện kĩ thuật và tiêu chuẩn thử nghiệm ngưng kết hồng cầu thụ động được các chuyên gia của tổ chức WHO chấp thuận ở hội nghị dịch hạch 1970 và được xem như là một quy trình để chẩn đoán huyết thanh dịch hạch. Cơ chế của phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Kháng nguyên F1 là KN hòa tan được gắn với HCC. Khi cho KN chẩn đoán gắn hồng cầu vào mẫu huyết thanh: - Nếu trong mẫu huyết thanh có kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, hồng cầu dàn đều đáy ống hình tán dù: phản ứng dương tính (+) - Ngược lại, hồng cầu tụ thành chấm ở đáy ống nghiệm: phản ứng âm tính ( - ) 1.6.3.2 Ngưng kết hạt Suzuki và cs ( 1967 ) đã cải tiến kỹ thuật gắn KN lên hạt polystyren để sử dụng cho phản ứng ngưng kết ở trên phiến hay chuẩn độ theo lối vi mô. Tác giả chứng minh thử nghiệm này có thể so sánh được với phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động. Thử nghiệm ngưng kết hạt có thể ưu việt hơn phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động nhờ tính bền vững của hạt polystyren. 1.6.3.3 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng F1 Nguyên lí của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. Kĩ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao được dùng để phát hiện kháng thể kháng F1 ở tất cả các mẫu huyết thanh có nguồn gốc khác nhau ( người, động vật ) mà không cần chất cộng hợp đặc trưng cho loài, đặc biệt phương pháp này có thể đo lường được các lớp KT đặc hiệu IgG, IgM và IgA. 1.6.3.4 Kháng thể kháng F1 gắn HCC đông khô phát hiện kháng nguyên F1 - Trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm chẩn đoán KT kháng F1 gắn HCC đông khô đã sử dụng trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động, đáng chú ý là một số công trình của: 21 Smuter, Baxôva, Kanatôf, Mensôf và một số tác giả khác đã bước đầu xây dựng quy trình sản xuất KT kháng F1 gắn HCC đông khô phát hiện KN F1 được đăng trên tài liệu Hội nghị Khoa học lần thứ VI chống dịch hạch vùng Trung Á – Kazắcttăng, Alma – Ata vào năm 1969. Mensôf đã hoàn thiện quy trình sản xuất hồng cầu chẩn đoán cho nghiên cứu huyết thanh học dịch hạch năm 1970 . Viện nghiên cứu khoa học chống dịch hạch Trung Á Alma – Ata đã sản xuất nhiều lô KT chẩn đoán phát hiện KN F1 với nồng độ rất nhỏ chỉ cần 0,000625 mcg và nếu trực khuẩn dịch hạch thì chỉ cần 15.625 tế bào. - Tại Việt Nam, chế phẩm chẩn đoán KT kháng F1 gắn HCC đông khô cũng được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều tra giám sát huyết thanh. Chế phẩm sử dụng chủ yếu là nhận từ các nước Liên Xô cũ. Gần đây tại Viện Vắc xin cơ sở II Đà Lạt bước đầu đã nghiên cứu và sản xuất thử chế phẩm KT kháng F1 gắn HCC đông khô. Chế phẩm này đạt các tiêu chuẩn về vật lí, vô trùng, tính đặc hiệu và độ nhạy. Kháng thể kháng F1 dịch hạch gắn HCC đông khô có thể nhận dạng được KN F1 của huyền dịch vi khuẩn chuẩn tới đậm độ 2,5. 105 tế bào và chế phẩm này cũng có thể nhận dạng được KN F1 của các chủng VKDH khảo sát. 1.6.3.5 Kháng thể gắn huỳnh quang phát hiện kháng nguyên F1 Phương pháp này chủ yếu dựa trên kỹ thuật hiển vi huỳnh quang. Hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến để nghiên cứu vật chất có thể làm cho phát huỳnh quang, hoặc dưới dạng tự nhiên ( gọi là sự tự phát huỳnh quang sơ cấp), hoặc sau khi xử lí với các hóa chất có khả năng huỳnh quang ( gọi là huỳnh quang thứ phát cấp). Hiển vi huỳnh quang là sáng chế vào đầu thế kỷ 19 của August Kor, Carl Reichert, Heinrich Lehmann và nhiều người khác. Tuy nhiên, tiềm năng của thiết bị này không được nhận ra trong nhiều thập kỉ. Kính hiển vi huỳnh quang hiện nay là một công cụ quan trọng trong ngành sinh học tế bào. 22 Cộng hợp kháng thể gắn huỳnh quang dùng để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của kháng nguyên đó. Kháng thể đặc hiệu được gắn với chất huỳnh quang ( Fluorescein Isothiocyanate: FITC ). Cộng hợp kháng thể huỳnh quang sẽ gắn chặt vào kháng nguyên tạo nên một phức hợp bền vững, không một kháng thể nào bị mất trong quá trình rửa, và kết quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang phải quan sát dưới nền tối, kháng nguyên gắn đặc hiệu với cộng hợp kháng thể huỳnh quang sẽ được phát hiện bởi ánh sáng màu xanh lá mạ. Đây là phương pháp kiểm tra có tính đặc hiệu cao để phát hiện Y. pestis, cho kết quả nhanh chỉ sau vài giờ và chính xác tới 98 – 99,4%. Cộng hợp kháng thể huỳnh quang được sử dụng để phát hiện rất nhiều loại vi khuẩn, virus như vi khuẩn dịch hạch, virus HIV, virus Dengue, virus dại .. Hình 1.5: Mẫu nhuộm huỳnh quang Yersinia. pestis, 2000x Trên thế giới kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang phát hiện KN F1 đã được sản xuất và sử dụng ở một số nước như Mỹ, Pháp, Đức, Anh. Ở Việt Nam, hiện vẫn chưa có nơi nào sản xuất bộ kít chẩn đoán này để phát hiện KN F1. 1.6.4 Phƣơng pháp sinh học phân tử - PCR (Polymerase Chain Reaction ) [8, 35] 23 Đây cũng là kỹ thuật rất đặc hiệu và có độ chính xác cao. Để thực hiện thử nghiệm này trước hết phải tổng hợp nên những primer tức là những đoạn ADN nhỏ bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN đặc hiệu. Nhờ đoạn ADN mồi này thực hiện phản ứng tổng hợp chuỗi để tổng hợp những đoạn ADN đặc hiệu ít ỏi của vi khuẩn gây bệnh nằm trong bệnh phẩm lên nhiều ngàn lần. Các cặp primer được sử dụng trong PCR để phát hiện ADN của vi khuẩn dịch hạch là F1- 1/2, Pst 3/5 là Rep 1/2 . Phương pháp PCR đã được áp dụng trong nghiên cứu chẩn đoán dịch hạch, tuy nhiên đây là kĩ thuật đòi hỏi máy móc và sinh phẩm đắt tiền phức tạp nên chưa được sử dụng rộng rãi ở các tuyến cơ sở. 1.7 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ 1.7.1 Sản xuất kháng thể đa dòng [ 13 ] Các KT đa dòng là một tập hợp các KT đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một KN cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, mỗi tế bào sinh KT tổng hợp và tiết một KT đơn nhận biết có ái lực cao với vùng riêng biệt trên KN miễn dịch ( epitope, quyết định KN ). Vì mỗi KN thường có vài epitope khác nhau nên có vài loại tế bào trong hệ miễn dịch mà mỗi loại sinh ra một KT khác nhau chống lại một trong nhiều epitope của KN. Các KT như vậy, đều phản ứng với cùng một KN, cấu thành một KT đa dòng. Hình 1.6: Các KT đa dòng, mỗi KT liên kết với một epitope khác nhau 24 Đối với các xét nghiệm chẩn đoán cụ thể, việc dùng KT đa dòng có hai hạn chế: + Số lượng KT khác nhau trong chế phẩm đa dòng có thể khác nhau giữa các lô sản xuất + KT đa dòng không thể dùng để phân biệt hai đích tương tự nhau, tức là khi sự khác nhau giữa dạng gây bệnh ( đích ) và dạng không gây bệnh ( không phải đích ) là một quyết định KN. Tuy có hạn chế nhưng KT đa dòng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán nhằm để xác định các tác nhân gây bệnh trên diện rộng. 1.7.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng [ 11 ] Kỹ thuật sản xuất KT đơn dòng đã được Kohler và Milstein miêu tả và sản xuất thành công từ năm 1975. Trong mấy chục năm qua kỹ thuật này đã có ảnh hưởng lớn tới nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau của miễn dịch học, vi sinh vật học, sinh hóa, sinh lí và sinh học tế bào. Cơ sở của kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng là phải thu được thể lai vừa có các đặc tính của tế bào lympho: sản xuất kháng thể và vừa có đặc tính của tế bào u tủy: nhân lên khi nuôi cấy dài ngày invitro. Phương pháp này đã tạo ra được KT đơn dòng từ một dòng tế bào của tế bào u lai nên KT rất tinh khiết chỉ phản ứng với một quyết định KN mà thôi. Các KT đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một KN cho sẵn. Hình 1.7: Các kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu 25 1.7.3 Tình hình sản xuất kháng thể trên thế giới và Việt Nam [ 9, 13, 26, 53, 54, 56 ] Tình hình sản xuất kháng thể trên thế giới Hiện nay trên thế giới việc sản xuất KT tinh sạch được tiến hành ở nhiều nước, đặc biệt là những nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển như Mỹ, Hà Lan, Nhật, Pháp….chủ yếu là dựa trên công nghệ sản xuất KT đơn dòng và đa dòng, tạo nên các hệ thuốc mới chữa trị các bệnh nguy hiểm cho con người và các bộ kít chẩn đoán của nhiều loại bệnh. Với sự phát minh phương pháp lai tế bào, KT được xem là tác nhân điều trị tiềm năng. Sau đây là một số KT đơn dòng đã được phép dùng cho người ở Hoa Kỳ và Liên minh Châu Âu. Năm phê Dạng duyệt kháng thể Mục đích điều trị Công ty 1986 Chuột Ortho Biotech Chống thải thận ghép cấp 1994 Khảm Centocor Chống cục máu đông 1997 Người hóa Chống thải thận ghép cấp 1998 Khảm Nhiễm virut hợp bào đường hô 1998 Khảm Protein Design Labs, Hoffmann- LaRoche Centocor, ScheringPlough Novartis 1998 Người hóa Genentech 1998 Người hóa Medimmune Bệnh Crohn và viêm khớp Chống thải thận ghép cấp Ung thư vú dương tính HER2 hấp ở trẻ em Ung thư bạch cầu đơn nhân tủy 2000 Người hóa 2001 Người hóa 2001 chờ duyệt Người hóa American Home Products, Celltech Millennium, Schering Pharmaceuticals, Genentech, Novartis, Tanox tái phát cấp Ung thư bạch cầu đơn nhân mạn Bệnh hen Bảng 1.2: Một số KT đơn dòng đã đƣợc phép dùng ở Hoa Kỳ và Châu Âu. 26 Theo Rechard Van den Broek, một chuyên gia phân tích của hãng dược phẩm Hambrecht & Quist của Mỹ thì tổng doanh thu của thị trường sử dụng KT chữa bệnh năm 1999 đạt 1,3 tỉ USD tăng 30% so với năm 1997 và 63,1% so với năm 1998. Đến năm 2002 đạt 3,1 tỉ USD với 19 loại sản phẩm khác nhau. - Năm 2004, các nhà khoa học Mỹ đã tạo ra được một kháng thể người có thể ngăn chặn sự lây lan của virus SARS trong phòng thí nghiệm. - Năm 2005 các nhà nghiên cứu Châu Âu đã tạo ra được kháng thể CD3 có thể điều trị bệnh tiểu đường type I.. - Năm 2007 các nhà nghiên cứu trường đại học Ghent Bỉ đã sản xuất thành công kháng thể chống virus viêm gan A. - Hiện nay rất nhiều bộ kít chẩn đoán dùng kháng thể để phát hiện các loại virus như virus dại, virus Dengue, virus HIV… đã được sản xuất và sử dụng ở các nước Mỹ, Anh, Pháp.. Công nghệ sản xuất kháng thể ngày càng được phát triển mạnh vì tính hiệu quả, an toàn và kinh tế của nó. Tình hình sản xuất kháng thể ở Việt Nam Do khả năng ứng dụng của việc sản xuất kháng thể mang lại nhiều hiệu quả trong điều trị bệnh và sản xuất các kít chẩn đoán nên các nhà khoa học Việt Nam cũng đã và đang tiến hành nghiên cứu và sản xuất nhiều loại KT để phục vụ cho đời sống. Vì vậy việc sản xuất KT ở Việt Nam cũng đạt một số thành tựu nhất định. - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Hà Nội từ những năm 1990 đã nghiên cứu và sản xuất thử KT đơn dòng kháng tả và bước đầu cho thấy có kết quả khả quan. - Năm 1994 Nguyễn Thị Kê chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước đã xây dựng công nghệ sản xuất KHT kháng dại tinh chế tại Nha Trang. - Năm 2001 đề tài nghiên cứu sản xuất KT đa giá phòng, trị bệnh Newcastle và Gumboro ở gà của tập thể tác giả thuộc phân viện Thú Y Nha Trang đã được hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đánh giá đạt loại xuất sắc. 27 - Năm 2008 đề tài nghiên cứu tạo KT đơn dòng virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ ( IHHNV ) ở tôm PENAEID của Bùi Thị Bích Hằng và Timothy W. Fleg, Đại học Cần Thơ đã thành công và được công bố. - Tại viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã sản xuất được rất nhiều loại kháng huyết thanh như: KHT Salmonella O-đa giá (Nhóm : A,B,C,D,E), KHT Salmonella OMA (Nhóm : A, B, D, E, L), Kháng huyết thanh Vi, Kháng huyết thanh H đa giá (a+b+c+d+i+g,m ), KHT Shigella, KHT Dysenteriae, KHT Flexneri, … - Tại phân viện Vắc xin Đà Lạt cũng đã sản xuất được một số loại kháng huyết thanh như: KHT lỵ trực khuẩn, KHT ho gà, KHT não mô cầu, KHT thương hàn, phó thương hàn. Tóm lại tại Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất các loại KHT, KT đã được tiến hành tại một số viện Pasteur. Tuy nhiên việc nghiên cứu và sản xuất KT đơn dòng ở nước ta chưa được phổ biến mà mới chỉ bước đầu đi vào nghiên cứu. Sản xuất kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện KN F1 dịch hạch ở Việt Nam chưa có nơi nào sản xuất, do đó đặt vấn đề nghiên cứu sản xuất, tinh chế IgG là cần thiết. 1.7.4 Tinh chế kháng thể [ 9, 13, 7 ] Mục đích của việc tinh chế kháng thể IgG là loại bỏ các albumin, protein và những kháng thể khác đồng thời cô đặc globulin miễn dịch đặc hiệu. Vì vậy trong sản xuất chúng ta phải chọn những phương pháp đơn giản mà cho một sản phẩm tinh khiết, có tỷ lệ cô đặc cao, có hiệu suất chấp nhận được và không làm thay đổi tính chất của kháng thể. Để tinh chế kháng thể người ta có thể dùng nhiều phương pháp vật lí, hóa học khác nhau. Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng. Trong điều kiện tiến hành luận văn hạn chế, chúng tôi tiến hành tinh chế IgG hằng hai phương pháp sau: 1.7.4.1 Dùng metanol Phương pháp tinh chế globulin miễn dịch bằng metanol lạnh hay còn gọi là phương pháp Cohn là một trong những phương pháp có tính chất công nghiệp được tổ chức Y tế thế giới nghiên cứu và sử dụng. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi 28 ở các nước Mỹ, Liên Xô, Đức. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự thay đổi điều kiện của sự trầm hiện của những phân tử có trong huyết tương như nồng độ dung môi, pH, lực ion, nhiệt độ và nồng độ protein. 1.7.4.2 Sắc kí ái lực Nguyên tắc của phương pháp sắc kí ái lực là dựa vào khả năng hấp phụ của globulin lên cột protein đã có sẵn. Sau đó dùng một dung dịch có lực đẩy mạnh hơn để tách globulin ra khỏi cột. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi ở các labo miễn dịch để tách các globulin. Naganath C., Sangupta D.N., ( 1987 ) đã dùng cột DEAE cellulose – DE 52 để tinh chế thu IgG từ kháng huyết thanh thỏ miễn dịch. IgG thu được có độ tinh khiết đạt đến 96% . 29 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Chủng giống Yersinia pestis EV 76 do viện Tarasevich ( Liên Xô ) cung cấp ở dạng đông khô. Y. pestis EV 76 bắt màu gram lưỡng cực, là chủng vi khuẩn được gây đột biến giảm độc lực, phát triển thích hợp ở 280C. 2.1.2 Môi trƣờng 2.1.2.1 Môi trường canh thang BHI ( Brain heart infusion) và thạch BHI Canh thang BHI - Dịch chiết tim bò 5,0g - Pepton 10,0g - NaCl 5,0g - Dextrose 2,0g - Dịch chiết não bê 12,5g - Na2HPO4. 12 H2O 2,5g - Nước cất 1000,0ml - pH 7,4 ± 0,2 Thạch BHI Thành phần giống canh thang BHI bổ sung thêm agar 2,5% 2.1.2.2 Môi trường Thioglycolate - Casein thủy ngân 15g - Cao nấm men 5g - Glucose 5g - L. Cystin 0,5g - NaCl 2,5g 30 - Acid thioglycolic 0,5g - Thạch 0,75g - Rezazurin 0,001g - pH 7,0 – 7,2 2.1.3 Hóa chất và nguyên liệu khác - Kháng nguyên F1 do công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt sản xuất. - Sodium phosphate 0,02M pH: 7,0 - Acid cittric 0,1M pH: 9,0 - CH3OH - Nước cất - Đệm PBS pH: 7,8 - Dung dịch acrylamide - Đệm gel phân tách - Đệm Stacking gel - Dung dịch SDS – 10% - Đệm điện di - n – butanol bão hòa nước - Dung dịch nhuộm protein - Dung dịch rửa màu - Dung dịch cố định màu nhanh Và một số hóa chất cần thiết khác 2.1.4 Súc vật thí nghiệm Thỏ trưởng thành, khỏe mạnh có trọng lượng 2,5- 3,0 kg 2.1.5 Các máy móc và dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thí nghiệm - Các loại ống nghiệm có đường kính 12mm, 18mm và 22mm - Pipette Pasteur và pipette 1ml, 5ml, 10ml - Lam kính, que cấy, đèn cồn, kẹp và kéo 31 - Giá đựng ống nghiệm - Kim tiêm, bơm tiêm - Hộp Roux và phao thủy tinh - Bình cầu 200ml - Hộp điện di Tất cả các dụng cụ đều được hấp, sấy và khử trùng trước khi dùng Các máy móc chuyên dùng - Lò sấy khô Milano –Pháp - Lò hấp ướt Hirayama – Nhật - Máy li tâm Hermile 6000 vòng/ phút – Đức - Bộ so độ đục chuẩn viện Tarasevich – Liên Xô (cũ ) - Máy đo pH – Đức - Cân điện prolabo – Pháp - Buồng cấy vô trùng Class Nuarie – Mỹ - Tủ lạnh âm ( - 400C ) – Hungari - Tủ ấm ( 370C ) – joan Pháp - Kính hiển vi Olympus – Nhật - Cột HiTrap protein A – Hãng Amersham, Mỹ - Máy điện di LKB - Mỹ - Máy quang phổ - Mỹ - Máy khuấy từ - Mỹ - Máy hút chân không - Mỹ 2.2 PHƢƠNG PHÁP 2.2.1 Phƣơng pháp pha chế môi trƣờng 2.2.1.1 Môi trường canh thang BHI và thạch BHI ( theo hướng dẫn của nhà sản xuất) 32 Môi trƣờng canh thang BHI: Hòa tan 37g bột môi trường BHI vào 1000ml nước cất, sau đó đun sôi phân vào trong các ống nghiệm 22mm, mỗi ống nghiệm 20ml môi trường. Hấp khử trùng ở 1100C/30 phút, pH= 7,4± 0,2. Môi trƣờng thạch BHI: Hòa tan 47g bột thạch BHI vào 1000ml nước cất, đun nhẹ để làm tan thạch. Phân vào mỗi hộp Roux 150ml. Hấp 1100C/30 phút, sau đó để ngửa hộp Roux cho môi trường thạch đông. Môi trường tốt sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 4 0C và dùng trong vòng 15 ngày. 2.2.1.2 Môi trường Thioglycolate Đun nóng cho tan hết các chất ( trừ glucose, acid thioglycolic, Resazurin). Riêng L.Cystin hòa ít nước cất có pha 5ml NaOH 10% rồi đổ vào hỗn hợp trên. Đun sôi 10 phút khuấy tan thạch, bù nước cho đủ thể tích ban đầu, sau đó thêm glucose và acid thioglycolic. Điều chỉnh pH đến 7,2 – 7,3, lọc 2 lần rồi thêm Resazurin. Phân vào ống nghiệm hấp 1100C/30 phút làm nguội nhanh ở 250C. Môi trường có màu hồng nhạt ở phía trên không quá 1,5cm là đạt ( nếu quá bị oxi hóa, phải đun và làm lại), dùng được 2 tuần. 2.2.2 Phƣơng pháp sản xuất kháng nguyên EV sống Sản xuất kháng nguyên EV sống theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn ở chai Roux. - Lấy 2ml canh thang BHI hòa tan vào ống chủng EV đông khô sau đó cấy vào 4 ống môi trường canh thang BHI, đặt vào tủ ấm 280C/24 giờ. Đồng thời kiểm tra vô trùng trong ống nghiệm có môi trường Thioglycolate. - Sau 24 giờ nhuộm Gram xem hình thể EV điển hình, cấy vào chai Roux. Mỗi chai Roux được cấy vào 2,0ml huyền dịch vi khuẩn từ canh thang BHI láng đều khắp mặt thạch ở chai Roux, đặt ngửa chai Roux trong tủ ấm nuôi cấy ở nhiệt độ 280C. 33 - Sau 48 giờ lấy ra kiểm tra tạp khuẩn, cho vào mỗi chai 15ml nước muối sinh lý và 2 phao thủy tinh để lắc làm bong hết những khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch. Thu huyền dịch vi khuẩn vào bình cầu và tiến hành đo đậm độ bằng bộ so độ đục chuẩn để xác định số tế bào vi khuẩn. Từ huyền dịch thu được điều chế thành kháng nguyên để gây miễn dịch. Tiến trình sản xuất kháng nguyên được trình bày tóm tắt qua sơ đồ sau: Chủng Y. pestis EV 76 đông khô Canh thang BHI 280C/24 giờ Kiểm tra: vô trùng, thuần khiết Thạch BHI ( Trong bình Roux ) 280C/48 giờ Kiểm tra: vô trùng, thuần khiết Gặt với nước muối sinh lí Kiểm tra: vô trùng, thuần khiết Độ đục Kháng nguyên EV sống miễn dịch Hình 2.1 : Sơ đồ nuôi cấy sản xuất kháng nguyên 34 2.2.3 Phƣơng pháp gây miễn dịch thỏ thu kháng thể và lấy máu Phương pháp pha kháng nguyên dựa vào bộ đo độ đục chuẩn - Từ huyền dịch vi khuẩn nuối cấy pha thành KN miễn dịch - Lắc đều ống đo độ đục mẫu của bộ so độ đục viện Tarasevich –Liên Xô. - Hút 0,1ml KN từ huyền dịch vi khuẩn cho vào ống đo, thêm nước muối sinh lí vào từ từ cho đến lúc đạt cùng màu so với ống chuẩn ( ống đo chuẩn và ống thử có màu sắc tương đương nhau). - Từ đó tính được đậm độ kháng nguyên ban đầu và dựa trên kết quả độ đục này pha liều kháng nguyên cần để gây miễn dịch. Đậm độ huyền dịch vi khuẩn = Đơn vị đo độ đục x Số lần pha loãng - Pha kháng nguyên có đậm độ vi khuẩn là 100.106; 200.106; 400.106; 800.106; 109 tbvk/1ml. - Tiến trình pha loãng phải được thực hiện với nước muối sinh lí được làm lạnh. Phương pháp gây miễn dịch thỏ - Chuẩn bị sẵn kim tiêm với liều tiêm thích hợp, gòn tẩm cồn iod. - Cho thỏ vào hộp gỗ, cố dịnh phần đầu thỏ ( tránh cử động làm sai lệch kim tiêm ). - Người phụ kỹ thuật dùng tay giữ chặt gốc tai, ngón trái và ngón trỏ giữ tĩnh mạch tai thỏ, búng mạnh vào tai để tĩnh mạch nổi rõ. - Trước khi bơm kháng nguyên, người tiêm sát trùng nơi tiêm bằng cồn iod, sau đó đưa kim tiêm chích xác vào đường tĩnh mạch bơm kháng nguyên từ từ chảy vào tĩnh mạch tai, người giữ thả lỏng tay để kháng nguyên chảy vào dễ dàng. - Sau khi bơm kháng nguyên hết, rút kim tiêm khỏi tĩnh mạch, đặt bông sát cồn lên vết tiêm giữ chặt cho máu và KN không chảy ngược ra. - Thời gian từ khi pha loãng KN EV sống miễn dịch đến khi kết thúc gây miễn dịch cho thỏ không quá 2 giờ 30 phút. Miễn dịch EV được tiến hành cụ thể như sau:  Đường tiêm : tĩnh mạch 35  Khoảng cách tiêm: 1 tuần  Phát đồ tiêm: + Mũi tiêm thứ nhất :100.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 2: 200.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 3: 400.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 4: 800.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 5: 109 tbvk/1ml Cho thỏ nghỉ 2 tuần nhắc lại mũi tiêm thứ 6 và mũi tiêm thứ 7 + Mũi tiêm thứ 6: 800.106 tbvk/ml + Mũi tiêm thứ 7: 109 tbvk/ml Sau mũi tiêm thứ 7 cho thỏ nghỉ 7 ngày rồi lấy hết máu Phương pháp lấy máu thỏ: Thỏ sau khi được gây miễn dịch cho ăn uống đầy đủ, chăm sóc cẩn thận. Đến ngày thứ 7 sau mũi tiêm cuối cùng lấy toàn bộ máu bằng cách lấy máu ở động mạch cổ. - Chuẩn bị hộp Roux vô trùng có gắn kim tiêm , kéo inox vô trùng. - Đặt thỏ nằm ngửa và cột bốn chân thỏ vào 4 góc khay inox. Dùng cồn iod sát trùng vùng cổ, lấy kéo rạch lớp da bên ngoài để tìm động mạch cảnh. Buộc chặt động mạch cảnh để máu không lưu thông về phía đầu thỏ, buộc hờ phía còn lại hướng về phía ngực bằng dây nhợ trắng có tẩm cồn iod. - Dùng ngón tay trỏ nâng động mạch cảnh lên, còn tay kia đưa kim gắn với dây silicon của hộp Roux vào động mạch cảnh. Giữ chặt và rút hết máu ở tim từ động mạch cảnh vào hộp Roux đặt nằm ngang phía bên dưới cho đến lúc máu ngừng chảy rồi đậy kín nắp hộp Roux. - Sau khi máu đã đông hoàn toàn, đặt vào tủ lạnh 4 – 80C cho huyết thanh tách ra. Sau khi để bình Roux 48 giờ trong lạnh, hút tách lấy kháng huyết thanh ( trong phòng vô trùng ) và đem kháng huyết thanh ly tâm để loại bỏ hồng cầu bị vỡ. 36 - Kiểm tra kháng huyết thanh thô: kiểm tra vô trùng trên môi trường thioglycolate, tính đặc hiệu kháng thể bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên lam kính và hiệu giá kháng thể bằng phương pháp định lượng hiệu giá kháng thể trong ống nghiệm. Hình 2.2: Lấy máu ở động mạch cảnh thu kháng huyết thanh Hình 2.3: Máy li tâm lạnh Hermile Z300K để li tâm KHT 37 Hình 2.4: Kháng huyết thanh miễn dịch sau khi li tâm 2.2.4 Phƣơng pháp tinh chế kháng thể 2.2.4.1 Dùng metanol Quá trình tinh chế IgG được tóm tắt như sau: - Dùng 1 thể tích ( V ) đệm phosphate M/15 pH 7,2 cho vào 2 thể tích ( V ) kháng huyết thanh và để ở nhiệt độ 40C trong 1 giờ 30 phút. - Cho 3 thể tích CH3OH vào 4 thể tích H2O và cũng để ở tầng nước đá 40C trong 1 giờ 30 phút. - Trộn hai dung dịch trên và lắc đều ở 40C trong 30 phút, cứ 5 phút lắc một một lần. - Ly tâm lạnh 30 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. - Hút bỏ nước nổi thu kết tủa IgG và hòa tan IgG trong PBS pH : 7,8 cho bằng thể tích ban đầu 2.2.4.2 Sắc kí ái lực Quá trình tinh chế IgG bằng sắc kí ái lực được tóm tắt như sau: - Rửa cột protein A nhiều lần bằng nước cất - Cân bằng cột bằng đệm Sodium Phosphate 0,02 M 38 - Nạp mẫu từ từ cho chảy qua cột - Rửa cột bằng đệm Sodium phosphate 0,02 M - Tách IgG ra khỏi cột bằng acid citric 0,1 M - Cân bằng lại cột bằng đệm Sodium phosphate 0,02M - Mẫu thu được để ổn định pH, cho đệm Tris – HCl 1M, pH : 9,0 2.2.5 Phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng kháng thể 2.2.5.1 Kiểm tra tính chất vật lí Quan sát bằng mắt thường IgG tinh chế dưới ánh đèn huỳnh quang là chất lỏng có màu trắng, trong suốt, không lắng cặn là được. 2.2.5.2 Kiểm tra vô trùng Mẫu được cấy vào môi trường thioglycolate và chia làm 2 nhóm: + Nhóm 1: đưa vào tủ cấy 370C để kiểm tra vi khuẩn hiếu khí và kị khí + Nhóm 2: để ở nhiệt độ 22 – 250C để kiểm tra nấm mốc Theo dõi trong 14 ngày, mẫu được xem như vô trùng khi không có các vi sinh vật mọc. 2.2.5.3 Kiểm tra tính đặc hiệu bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên lam kính - Cấy chủng Y. pestis vào đĩa thạch dinh dưỡng, ủ ở 370C/24 giờ - Lấy khuẩn lạc điển hình làm ngưng kết trên phiến kính với kháng thể mẫu ( T ). Tiến hành: - Chuẩn bị 2 lam kính sạch cho mỗi mẫu Y. pestis - Nhỏ lần lượt một giọt: nước muối sinh lí, kháng thể mẫu T, kháng thể sau tinh chế bằng metanol ( A), kháng thể sau tinh chế bằng sắc kí ái lực ( B ) vào 2 lam kính. - Dùng que cấy đã khử trùng chọn vài khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn Y. pestis, tán đều vào giọt nước muối sinh lí. Sau đó khử trùng que cấy lại trên ngọn lửa đèn cồn và lấy một vài vi khuẩn này tán đều vào kháng thể mẫu T, A, B - Lắc nhẹ lam kính để ngưng kết xảy ra hoàn tất trong vòng 3 phút. - Xem kết quả trên nền đen hoặc gương lõm. 39 Đọc kết quả : - Nước muối sinh lí không tạo ngưng kết với vi khuẩn, chỉ tạo thành một hỗn dịch màu trắng đục. - Kháng thể mẫu tạo ngưng kết thành hạt Đánh giá kết quả: ( +++): tạo ngưng kết hạt rõ, nhiều và nhanh khoảng 1 phút ( ++ ) : tạo ngưng kết hạt khá rõ và chậm trong khoảng 2 – 3 phút ( + ) : tạo ngưng kết rất ít, chậm trong khoảng 3 phút. (-) : không tạo ngưng kết 2.2.5.4 Kiểm tra độ sạch bằng phương pháp điện di trên gel SDS- polyacrylamide Các bước tiến hành được tóm tắt như sau: - Chuẩn bị mẫu: dung dịch được hòa tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu sao cho có nồng độ 0,5 – 1,5mg protein/ml, đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội. - Chuẩn bị dung dịch gel để điện di: trộn 5ml dung dịch acrylamide; 7,5ml đệm gel stacking; 0,3ml SDS 10%; 17,1ml nước với nhau. Cho vào một bình tam giác có nhánh nối với một máy hút chân không, vừa hút vừa khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi hết bọt khí. Sau đó cho 150 μl Amonium Persulfate, 10 μl TEMED lắc nhẹ cho tan hết. - Cho gel điện di vào khuôn đúc gel - Chuẩn bị gel stacking: dung dịch acrylamide 1,32ml; đệm stacking 2,49ml; SDS 10% 99ml; nước 6,09ml. Khuấy từ và hút chân không để loại bọt khí. Sau đó cho 50,1ml Ammonium Persulfate và 4,95ml TEMED rồi lắc nhẹ cho tan hết. - Điện di: đổ dung dịch phủ trên gel điện di ra và cho 0,5ml gel stacking để tráng bề mặt rồi đổ bỏ. Cho đầy gel stacking vào và đặt lược để thành các giếng, cố định trong 60 phút. Lấy lược ra khỏi gel, tráng lại giếng bằng dung dịch điện di rồi đổ bỏ. Đặt gel đúng vị trí trong hộp điện di, thêm dung dịch điện di vào hộp điện di, bơm 5 - 10 40 μl có nồng độ khoảng 1 μg/ μl mẫu KHT đã được xử lí bằng dung dịch pha mẫu vào giếng. Đóng điện và tiến hành điện di. Sau khoảng 1 giờ tắt điện và lấy gel ra nhuộm. - Nhuộm và đọc kết quả: đặt gel trong dung dịch cố định màu nhanh trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Chuyển gel qua dung dịch nhuộm protein trong vài giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ đến khi nào thấy các vệt màu hiện lên. Cuối cùng cho gel vào dung dịch tẩy màu, dung dịch này được thay 2 lần trong một ngày đến khi nào gel trong. Gel hoàn tất có thể được bảo quản trong acid acetic 7% hoặc nước. 2.2.5.5 Định lƣợng protein tổng số bằng phƣơng pháp Lowry Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphovolphramat để xác định khối lượng protein. Các bước tiến hành được tóm tắt như sau: - Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm (có khoảng 0,2mg/ml protein ). Thêm vào 4 ml dung dịch ( gồm Na2CO3 2% hòa trong NaOH 0,1N và CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch Natri citrat 1% với tỉ lệ 49:1), lắc đều, để yên trong 10 phút. Sau đó thêm 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên từ 30 – 90 phút, màu của phản ứng sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh so màu trên máy quang phổ. Xác định trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. - Tính kết quả 2.2.5.6 Định lƣợng hiệu giá kháng thể Theo phương pháp định lượng hiệu giá kháng thể trong ống nghiệm của tổ chức Y tế thế giới: - Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đường kính 12mm, đánh số từ 1 đến 10 - Pha kháng huyết thanh có độ pha loãng 1/10 và kháng nguyên EV đậm độ 109 tbvk/ml - Dùng pipette 1ml cho 0,5ml nước muối sinh lí lần lượt vào các ống nghiệm từ 1 đến 10 ( 1 ). - Tiếp tục dùng pipette 1ml cho tiếp 0,5ml kháng huyết thanh có độ pha loãng 1/10 vào ống 1 lắc đều. Sau đó hút chuyền 0,5ml từ ống 1 sang ống thứ 2 rồi lại lắc đều. 41 Qúa trình được tiến hành cho đến ống thứ 9 và hút 0,5ml từ ống thứ 9 bỏ đi. Ống thứ 10 dùng làm ống đối chứng nên không cho kháng huyết thanh ( 2 ). - Dùng pipette 1ml cho 0,5ml kháng nguyên EV có đậm độ 109 tbvk/ml vào tất cả các ống từ 1 cho đến 10 và lắc đều cho kháng nguyên và kháng thể tiếp xúc với nhau (3). - Cuối cùng để tất cả các ống nghiệm trên vào nồi cách thủy ở nhiệt độ 500C/24 giờ - Đọc kết quả bằng cách dựa vào kết tủa hình dù ở đáy ống nghiệm. Hiệu giá kháng thể được tính đến độ pha loãng cao nhất mà vẫn cho kết tủa tạo thành hình dù ở đáy ống nghiệm. Ống thứ 10 đối chứng không được có kết tủa tạo đám ngưng kết. Hiệu giá kháng thể được kiểm tra theo sơ đồ sau: 0.5 ml kháng huyết thanh(2) 0.5ml hỗn dịch kháng nguyên (3) 0.5ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.5 ml nước muối sinh lí(1) 2.3 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU Tính trung bình nhân, trung bình cộng theo phương pháp thống kê trong nghiên cứu y sinh học. 42 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA KHÁNG NGUYÊN ĐẾN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến mức độ đáp ứng miễn dịch là bản chất kháng nguyên và dạng kháng nguyên đưa vào cơ thể. Để khảo sát sự ảnh hưởng của các dạng kháng nguyên khác nhau chúng tôi sử dụng 2 dạng kháng nguyên là KN F1 tinh khiết và KN EV sống. 3.1.1 Ảnh hƣởng của KN F1 tinh khiết đến đáp ứng miễn dịch Để khảo sát ảnh hưởng của KN F1 tinh khiết chúng tôi sử dụng KN F1 với tổng liều gây miễn dịch cho thỏ là 15mg. Tiêm 3 mũi, mỗi mũi tiêm 5mg. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần, kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.1: Bảng 3.1: Hiệu giá kháng thể đáp ứng miễn dịch với KN F1 tinh khiết Thí nghiệm Liều KN F1 gây miễn dịch ( mg ) NMSL HGKT TN1 15 (-) 1/320 TN2 15 (-) 1/320 TN3 15 (-) 1/640 Trung bình nhân HGKT: XGeo = 1/403 43 Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy: Đối với thí nghiệm 1 : HGKT thu được là 1/320 Đối với thí nghiệm 2 : HGKT thu được là 1/320 Đối với thí nghiệm 3 : HGKT thu được là 1/640 Trung bình nhân HGKT (XGeo ) của cả 3 lần thí nghiệm là 1/403 Chứng với NMSL : phản ứng ngưng kết âm tính Kháng nguyên khi xâm nhập vào bên trong cơ thể, cơ thể sẽ phản ứng lại bằng quá trình đáp ứng miễn dịch. Dạng kháng nguyên quyết định tính đáp ứng miễn dịch mạnh hay yếu. Vì vậy khi bắt đầu quá trình sản xuất kháng huyết thanh cần khảo sát để lựa chọn dạng kháng nguyên cho thích hợp. Theo trung tâm phòng chống bệnh CDC Hoa Kỳ khi gây miễn dịch với KN F1 thì nên sử dụng liều cao hơn 10mg, do đó chúng tôi lựa chọn liều KN gây miễn dịch 15mg để tiêm cho thỏ. Từ kết quả bảng 3.1 chúng tôi có nhận xét: Khi gây miễn dịch với KN F1 tinh khiết liều 15mg, trung bình nhân hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thu được là 1/403, kết quả này là có thể chấp nhận được. Tuy nhiên, trong sản xuất kháng huyết thanh cần phải tạo được đáp ứng miễn dịch mạnh để thu được nhiều kháng thể. Vì thế mà chúng tôi tiếp tục khảo sát một dạng kháng nguyên khác để gây miễn dịch. 44 3.1.2 Ảnh hƣởng của KN EV sống đến đáp ứng miễn dịch Để khảo sát ảnh hưởng của KN EV sống đến đáp ứng miễn dịch chúng tôi sử dụng chủng Yersinia pestis EV 76 do viện Tarasevich ( Liên Xô ) cung cấp ở dạng đông khô sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch BHI rồi xác định đậm độ kháng nguyên để gây miễn dịch theo phát đồ 5 mũi tiêm trên thỏ lần lượt là: 100.10 6, 200.106, 400.106, 800.106, 109 tbvk/ml. Sau mũi tiêm thứ 5 cho thỏ nghỉ 7 ngày lấy hết máu. Tiến hành các bước thu KHT và kiểm tra HGKT. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Hiệu giá kháng thể đáp ứng miễn dịch với KN EV sống Thí nghiệm KN gây miễn dịch NMSL HGKT TN1 EV sống (- ) 1/1280 TN2 EV sống (-) 1/640 TN3 EV sống (-) 1/1280 Trung bình nhân HGKT: XGeo = 1/1016 Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy: Đối với thí nghiệm 1 : HGKT thu được là 1/1280 Đối với thí nghiệm 2 : HGKT thu được là 1/640 Đối với thí nghiệm 3 : HGKT thu được là 1/1280 Trung bình nhân HGKT (XGeo ) của cả 3 lần thí nghiệm là 1/1016 Chứng với nước muối sinh lí: phản ứng ngưng kết âm tính 45 Theo Meyer chủng đột biến giảm độc lực EV đã được Girard và Robic ( 1936 ) tạo ra bằng cách cấy chuyền vi khuẩn dịch hạch nhiều năm liền trên môi trường thạch ở nhiệt độ 10 – 200C, chủng mất đi phần lớn khả năng gây độc nhưng nó vẫn giữ được tất cả các đặc tính sinh hóa và tính gây miễn dịch đối với động vật thí nghiệm [29]. Khi đưa EV sống vào trong cơ thể, EV có thể nhân lên, tồn tại kéo dài hơn và có khả năng tiếp xúc với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, nhờ thế mà kích thích tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh hơn và sinh được nhiều kháng thể. So sánh kết quả ở bảng 3.1 và 3.2 thì trung bình nhân ( XGeo ) HGKT của KHT gây miễn dịch với KN EV sống cao hơn hẳn trung bình nhân ( XGeo ) HGKT của KHT khi gây miễn dịch với KN F1 tinh khiết, số liệu thu được từ 2 khảo sát trên là hợp lí . Kết quả này được biểu hiện ở biểu đồ 3.1: 46 Trung bình nhân HGKT 1400 1200 1000 800 KN F1 600 KN EV sống 400 200 0 TN1 TN2 TN3 Loạt thí nghiệm Biểu đồ 3.1: So sánh HGKT của KHT khi gây miễn dịch với KNF1 tinh khiết và KN EV sống Từ kết quả của thí nghiệm trên cho thấy, đáp ứng miễn dịch của cơ thể mạnh hay yếu, sớm hay muộn phụ thuộc vào một số yếu tố trong đó có dạng kháng nguyên. Trong quá trình gây miễn dịch cho động vật người ta thường sử dụng kháng nguyên tinh chế hoặc dùng kháng nguyên sống đột biến giảm độc lực. Nhưng đối với các nhà sản xuất thì điều mà họ mong muốn là không chỉ thu được kết quả mà còn chú ý đến lợi ích kinh tế . Vì thế cần phải nghiên cứu để tìm ra một dạng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho hiệu giá kháng thể cao là 47 hết sức có ý nghĩa. Chen và Meyer đã dùng vắc xin EV gây miễn dịch chuột và xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động. Do đó trong đề tài này chúng tôi chọn hai dạng kháng nguyên khác nhau để so sánh. Vì là kháng nguyên sống nên chúng có khả năng tăng sinh tạo thành quần thể vi khuẩn và tồn tại lâu hơn. Do đó, chúng kích thích tạo được trí nhớ miễn dịch tốt hơn nhờ thế mà tạo được đáp ứng miễn dịch mạnh hơn. Trong khi đó KN F1 tinh khiết dễ bị chuyển hóa và bị đào thải nhanh nên có lẽ vì thế mà gây miễn dịch yếu hơn. Như vậy để thu được nhiều kháng thể thì chúng ta nên chọn phương pháp gây miễn dịch với KN EV sống sẽ đạt hiệu quả kinh tế cao hơn so với dùng KN F1 tinh khiết và kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Meyer [45]. 48 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHÁT ĐỒ GÂY MIỄN DỊCH 3.2.1 Ảnh hƣởng của liều KN EV sống đến đáp ứng miễn dịch Ngoài yếu tố là bản chất KN, dạng KN thì liều lượng KN cũng ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch. Để khảo sát liều lượng KN chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây miễn dịch trên thỏ bằng KN EV sống với liều 5 mũi tiêm và 7 mũi tiêm. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần với mỗi liều tiêm và kết quả được thể hiện ở bảng 3.3: Bảng 3.3: HGKT đáp ứng miễn dịch với KN EV sống liều 5 mũi tiêm và 7 mũi tiêm Thí HGKT nghiệm KN miễn dịch NMSL Liều 5 mũi Liều 7 mũi TN1 EV sống (-) 1/1280 1/2560 TN2 EV sống (-) 1/640 1/2560 TN3 EV sống (-) 1/1280 1/5120 1/1016 1/3226 Trung bình nhân HGKT ( XGeo ) Kết quả bảng 3.3 cho thấy: Đối với TN1: HGKT liều 5 mũi tiêm là 1/1280, liều 7 mũi tiêm là 1/2560 Đối với TN2: HGKT liều 5 mũi tiêm là 1/640, liều 7 mũi tiêm là 1/2560 Đối với TN3: HGKT liều 5 mũi tiêm là 1/1280, liều 7 mũi tiêm là 5120 Trung bình nhân HGKT ( XGeo ) của 3 lần thí nghiệm với liều 5 mũi tiêm là 1/1016, liều 7 mũi tiêm là 1/3226. 49 Chứng với nước muối sinh lí: phản ứng ngưng kết âm tính Khi gây miễn dịch trên động vật, ngoài bản chất của KN, dạng KN thì liều lượng của kháng nguyên cũng quyết định tính đáp ứng miễn dịch mạnh hay yếu. Trong quá trình gây miễn dịch, cơ thể sẽ tạo đáp ứng miễn dịch mạnh khi nhận được liều lượng kháng nguyên thích hợp. Nếu thừa kháng nguyên sẽ làm tổn thương hệ thống miễn dịch hoặc nếu thiếu kháng nguyên thì không đủ kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch. Do đó khi bắt đầu quá trình sản xuất kháng huyết thanh thì cần phải nghiên cứu để lựa chọn một liều kháng nguyên phù hợp đủ để kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể. Đối với kháng nguyên EV sống của vi khuẩn dịch hạch chúng tôi sử dụng hai liều gây miễn dịch là 5 mũi tiêm và 7 mũi tiêm. Từ kết quả ở bảng 3.3 chúng tôi có nhận xét: - Với liều miễn dịch 5 mũi tiêm qua 3 lần thí nghiệm chúng tôi thu được kháng huyết thanh có trung bình nhân hiệu giá kháng thể là 1/1016. - Với liều miễn dịch 7 mũi tiêm qua 3 lần thí nghiệm chúng tôi thu được kháng huyết thanh có trung bình nhân hiệu giá kháng thể là 1/3226. Chứng tỏ khi gây miễn dịch liều 7 mũi tiêm thì động vật đáp ứng miễn dịch mạnh hơn, KHT thu được có HGKT cao hơn, điều này được thể hiện qua biểu đồ 3.2: 50 6000 Trung bình nhân HGKT 5000 4000 3000 Liều 5 mũi tiêm Liều 7 mũi tiêm 2000 1000 0 TN1 TN2 TN3 Loạt thí nghiệm Biểu đồ 3.2: So sánh HGKT của KHT khi gây miễn dịch với KN EV sống liều 5 mũi tiêm và 7 mũi tiêm Như vậy ngoài bản chất KN, dạng kháng nguyên ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch thì liều lượng của kháng nguyên cũng ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch. Từ kết quả của các thí nghiệm và biểu đồ 3.2 so sánh HGKT của KHT khi gây miễn dịch với cùng một loại KN EV sống đã làm giảm độc lực với liều 5 mũi tiêm và 7 mũi tiêm cho thấy HGKT của KHT khi gây miễn dịch trên thỏ với liều 7 mũi tiêm thì cao hơn hẳn so với liều 5 mũi tiêm. Điều đó chứng tỏ khi gây miễn dịch trên động vật với liều lượng thích hợp thì sẽ cho KHT thu được có HGKT cao. Kết quả thu được phù hợp với các công trình nghiên cứu những năm trước của phân viện Vắc xin Đà Lạt về một số loại kháng huyết thanh [ 3, 9 ]. 51 3.2.2 Ảnh hƣởng của thời gian đến đáp ứng miễn dịch Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây miễn dịch trên thỏ với liều 7 mũi tiêm và thu KHT tại các thời điểm là 5 ngày, 7 ngày và 10 ngày sau mũi tiêm cuối cùng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thể hiện ở bảng 3.4: Bảng 3.4: HGKT đáp ứng miễn dịch với KN EV sống tại thời điểm 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày sau mũi tiêm cuối Thí KN gây miễn dịch Hiệu giá kháng thể nghiệm (liều 7 mũi tiêm) NMSL 5 ngày 7 ngày 10 ngày TN1 EV sống (-) 1/1280 1/2560 1/2560 TN2 EV sống (-) 1/1280 1/2560 1/5120 TN3 EV sống (-) 1/1280 1/5120 1/2560 1/1280 1/3226 1/3226 Trung bình nhân HGKT : XGeo Kết quả bảng 3.4 cho thấy:  Tại thời điểm 5 ngày sau khi kết thúc gây miễn dịch: + Cả 3 thí nghiệm HGKT của KHT đều đạt 1/1280. + Trung bình nhân HGKT ( XGeo ) là: 1/1280.  Tại thời điểm 7 ngày sau khi kết thúc gây miễn dịch: + Thí nghiệm 1 và 2: HGKT của KHT đều đạt 1/2560 + Thí nghiệm 3: HGKT của KHT đạt 1/5120 + Trung bình nhân HGKT ( XGeo ) là: 1/3226 52  Tại thời điểm 10 ngày sau khi kết thúc gây miễn dịch: + Thí nghiệm 1 và 3: HGKT của KHT đều đạt 1/2560 + Thí nghiệm 2: HGKT của KHT đạt 1/5120 + Trung bình nhân HGKT ( XGeo ) là: 1/3226  Chứng với nước muối sinh lí: phản ứng ngưng kết âm tính Khi đưa kháng nguyên vào bên trong cơ thể động vật, cơ thể sẽ phản ứng lại bằng quá trình đáp ứng miễn dịch. Theo trung tâm phòng chống bệnh CDC Hoa Kỳ khi gây miễn dịch trên động vật thì thời gian kết thúc sau khi gây miễn dịch ở các thời điểm khác nhau sẽ có lượng kháng thể hình thành khác nhau . Nếu thời gian quá ngắn sẽ làm cho cơ thể động vật đáp ứng miễn dịch chưa đủ, điều này có thể làm cho lượng kháng thể hình thành ít. Nếu thời gian đủ dài sẽ làm tăng trí nhớ miễn dịch và lượng kháng thể sẽ được hình thành nhiều hơn. Tại thời điểm lấy máu thu KHT là 5 ngày sau mũi tiêm cuối cùng thì chưa đủ để cơ thể đáp ứng miễn dịch mạnh do vậy mà HGKT chưa cao nhưng tại thời điểm là 7 ngày sau mũi tiêm cuối cùng thì KHT thu được có HGKT cao chứng tỏ kháng nguyên đủ thời gian để tiếp xúc với hệ thống miễn dịch, kích thích cơ thể đáp ứng nên đã tạo được lượng kháng thể cao. Tuy nhiên đến một thời điểm nhất định thì lượng kháng thể sẽ đạt mức tối đa và sẽ không tăng lên nữa. Từ kết quả ở bảng 3.4 chúng tôi có nhận xét: Hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh khi gây miễn dịch với KN EV sống tại thời điểm là 5 ngày sau mũi tiêm cuối cùng thì thấp hơn hẳn hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh khi gây miễn dịch với KN EV sống tại thời điểm là 7 ngày và 10 ngày sau mũi tiêm cuối cùng. Trong khi đó, tại thời điểm lấy máu thu KHT là 7 ngày và 10 ngày sau mũi tiêm cuối cùng đều cho kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể như nhau. Chứng tỏ khi gây miễn dịch với phát đồ miễn dịch giống nhau nhưng tại các thời điểm thu kháng huyết thanh khác nhau thì kết quả hiệu giá kháng thể thu 53 được là khác nhau. Có nghĩa là khi gây miễn dịch với KN EV sống thì nên chọn thời điểm lấy máu thu KHT là 7 ngày sau mũi tiêm cuối cùng sẽ cho kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể cao nhất mà không cần phải đợi thời gian dài hơn để lấy máu thu kháng huyết thanh, vì tại thời điểm này hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh đã đạt đến đỉnh điểm. Kết quả này được biệu hiện ở biểu đồ 3.3: 6000 Trung bình nhân HGKT 5000 4000 3000 5 ngày 7 ngày 10 ngày 2000 1000 Loạt thí nghiệm 0 TN1 TN2 TN3 Biểu đồ 3.3: So sánh HGKT của KHT khi gây miễn dịch với KN EV sống , tại thời điểm là 5 ngày, 7 ngày và 10 ngày sau mũi tiêm cuối cùng 54 Như vậy khi tiến hành gây miễn dịch trên động vật, để thu được KHT có HGKT cao, chúng ta cần chú ý tới 3 yếu tố: + Dạng kháng gây miễn dịch + Liều kháng nguyên gây miễn dịch + Thời điểm lấy máu thu KHT Cả 3 yếu tố trên đều cần phải xác định khi gây miễn dịch trên động vật. Trong trường hợp gây miễn dịch trên thỏ với kháng nguyên của vi khuẩn dịch hạch ta nên dùng KN EV sống đã bị làm giảm độc lực với liều kháng nguyên gây miễn dịch là 7 mũi tiêm và thời điểm lấy máu là 7 ngày sau mũi tiêm cuối cùng thì mới đủ để động vật đáp ứng miễn dịch mạnh cho kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể cao. 55 3.3 KẾT QUẢ TINH CHẾ KHÁNG THỂ IgG 3.3.1 Kết quả tinh chế IgG với metanol Bảng 3.5: Kết quả chất lƣợng của IgG tinh chế với metanol Kết quả Loạt thí nghiệm Vật lí Tính đặc hiệu Thời gian ngƣng kết ( phút) ( ++ ) 3 ( ++±) 2 ( ++ ) 3 Dung dịch TN1 có màu trắng hơi TN2 đục, có một ít kết tủa TN3 trắng ngà Từ kết quả bảng 3.5 cho thấy: Vật lí: Cả 3 thí nghiệm IgG thu được là một dung dịch màu trắng hơi đục và có một ít kết tủa trắng ngà. Tính đặc hiệu: + Thí nghiệm 1 và 3: sản phẩm IgG thu được tạo ngưng kết với kháng nguyên EV khi thực hiện phản ứng ngưng kết trên lam kính, hạt ngưng kết thấy được rõ bằng mắt thường, mức độ tạo hạt không nhiều ( ++ ) và xuất hiện chậm trong khoảng thời gian 3 phút. + Thí nghiệm 2: sản phẩm IgG thu được tạo ngưng kết với KN EV nhiều hơn ( ++± ) và nhanh hơn trong khoảng thời gian 2 phút và có thể thấy rõ bằng mắt thường. 56 Dùng metanol để tinh chế protein là một phương pháp phổ biến, rẻ tiền và dễ thực hiện ở mọi phòng thí nghiệm. Do vậy mà phương pháp này được sử dụng khá nhiều và trong giới hạn của luận văn này chúng tôi đã dùng metanol lạnh để tinh chế KHT dịch hạch thu IgG. Tuy nhiên trong quá trình thực hiện tinh chế, IgG thu được lại chưa đạt yêu cầu còn một số hạn chế về chất lượng. Nguyên nhân dẫn đến chất lượng IgG tinh chế không đạt yêu cầu có thể là do trong quá trình tinh chế, metanol đã làm biến tính protein nên IgG thu được không phải là chất lỏng trong suốt màu trắng tinh mà là một dung dịch màu trắng ngà, hơi đục, bị biến tính một phần và không tan hết trong dung dịch đệm. Chính vì thế mà chúng tôi không tiến hành đánh giá các chỉ tiêu khác như hàm lượng protein ,độ tinh khiết và HGKT của IgG. Từ các kết quả ở bảng 3.5 chúng tôi có nhận xét: Tinh chế IgG bằng metanol lạnh có thu được kháng thể IgG có tính đặc hiệu tuy nhiên kháng thể thu được chưa đạt yêu cầu vật lí do trong dung dịch có màu trắng hơi đục, IgG tinh chế bị biến tính một phần, không tan hết trong dung dịch hoàn nguyên. Do vậy chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh chế KHT thu IgG bằng một phương pháp khác nhằm đạt chất lượng cao hơn. 57 3.3.2 Kết quả tinh chế IgG bằng sắc ký ái lực Bảng 3.6: Kết quả chất lƣợng của IgG tinh chế bằng sắc ký ái lực Loạt thí Kết quả nghiệm Vật lí Tính đặc hiệu Thời gian ngƣng kết Tinh khiết ( phút ) Dung TN1 dịch IgG ( +++ ) 1 Một dải ngưng kết có màu trắng trong suốt, TN2 ( +++ ) không 0,5 Một dải ngưng kết có cặn Từ kết quả bảng 3.6 cho thấy: Vật lí: Cả 2 lần thí nghiệm đều thu được dung dịch kháng thể tinh chế có màu trắng trong suốt, không có cặn. Tính đặc hiệu: + Thí nghiệm 1: dung dịch kháng thể tạo ngưng kết đặc hiệu với KN EV, hạt ngưng kết thấy được rõ ràng bằng mắt thường trong thời gian 1 phút. + Thí nghiệm 2: tạo được ngưng kết đặc hiệu với KN EV giống như thí nghiệm 1, tuy nhiên thời gian tạo ngưng kết có nhanh hơn khoảng 30 giây. Độ tinh khiết: 58 Cả 2 lần tinh chế thử nghiệm kháng thể IgG thu được tạo một dải ngưng kết khi điện di trên SDS – page. Hình 3.1 Hình ảnh điện di SDS – PAGE của kháng thể do chúng tôi sản xuất Trên hình 3.1 cho thấy: IgG tạo vạch ngưng kết rõ trên thạch điện di. Chứng tỏ IgG do chúng tôi sản xuất đạt yêu cầu về độ tinh khiết. Khi tiến hành tinh chế IgG bằng phương pháp sắc kí ái lực có lợi thế rất lớn, phương pháp này giúp chúng ta tiến hành tách chiết hết sức tinh vi. Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Các phân tử cần được tách chiết sẽ được hấp phụ lên cột sau đó chúng sẽ được rửa ra khỏi cột. Trong suốt quá trình tinh chế không có phản ứng hóa học nào xảy ra do các chất hấp phụ không có tương tác hóa học nào, không phân cực và có tính chọn lọc, 59 chính điều này đã làm IgG không bị biến tính, phân tử IgG thu được có độ tinh khiết cao. Phân tử IgG tinh khiết nên có độ đặc hiệu cao nhưng HGKT có thấp hơn so với HGKT của KHT thô vì trong KHT thô có nhiều lớp kháng thể chứ không riêng gì kháng thể IgG. 60 3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG IgG SẢN XUẤT Bảng 3.7: Kết quả các chỉ tiêu chất lƣợng IgG KẾT QUẢ Loạt thí nghiệm Vật lí Vô trùng Đặc Tinh Hàm lƣợng khiết protein Một dải 12,18 HGKT hiệu Dung TN1 dịch có Đạt ( +++ ) 1/1280 ngưng kết màu trắng trong suốt, TN2 không Đạt có cặn ( +++ ) 1/1280 Một dải 12,58 ngưng kết Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy: Vật lí: Cả 2 lần thí nghiệm đều thu được dung dịch kháng thể tinh chế có màu trắng trong suốt, không có lắng cặn. Vô trùng: Kiểm tra trên môi trường thioglycolate ở nhiệt độ 22 – 250C và 370C sau 14 ngày cả 2 lần thí nghiệm đều không thấy có vi sinh vật mọc. 61 Tính đặc hiệu: + Thí nghiệm 1: dung dịch kháng thể tạo ngưng kết đặc hiệu với KN EV sống, hạt ngưng kết thấy được rõ ràng bằng mắt thường trong thời gian 1 phút. + Thí nghiệm 2: tạo được ngưng kết đặc hiệu với KN EV sống giống như thí nghiệm 1, tuy nhiên thời gian tạo ngưng kết có nhanh hơn khoảng 30 giây. Hiệu giá kháng thể: Cả 2 lần thí nghiệm IgG tinh chế đều có HGKT là 1/1280 Độ tinh khiết: Cả 2 lần tinh chế thử nghiệm kháng thể IgG thu được tạo một dải ngưng kết khi điện di trên SDS – page. Hàm lượng protein: + Thí nghiệm 1: IgG tinh chế có hàm lượng protein là 12,18 mg/ml. + Thí nghiệm 2: IgG tinh chế có hàm lượng protein là 12,58 mg/ml. Sắc ký ái lực (affinity chromatography) sử dụng ái lực giữa cấu tử gắn (ligand) và protein cần tách. Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách sẽ gắn với giá thể trong khi các protein khác sẽ rửa trôi ra khỏi cột. Sau khi rửa sạch tạp chất, protein cần tách được phản hấp phụ bằng các chất cạnh tranh như cấu tử tự do, hay bằng các chất có khả năng phá vỡ tương tác. Trong quá trình tinh chế IgG kháng dịch hạch, những phân tử IgG sẽ gắn đặc hiệu lên cột, do đó những phân tử còn lại sẽ chạy qua cột. Vì vậy khi rửa cột, kết quả thu được chỉ có các phân tử IgG và kết quả này phù hợp với công trình của một số tác giả đã công bố trước đây [ 24 ]. Từ các kết quả ở bảng 3.7 chúng tôi có nhận xét: IgG mà chúng tôi tinh chế bằng phương pháp sắc kí ái lực đạt các tiêu chuẩn vật lí, vô trùng, độ đặc hiệu, hàm lượng protein, hiệu giá kháng thể và độ tinh khiết. 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN  Ảnh hưởng của các loại kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch: Khi dùng kháng nguyên của vi khuẩn dịch hạch để gây miễn dịch cho động vật thì cả hai loại KN F1 tinh khiết và KN EV sống đều có khả năng gây miễn dịch nhưng dùng KN EV sống sẽ thu được kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể cao hơn.  Liều lượng kháng nguyên gây miễn dịch: Dùng KN EV sống với liều tiêm 7 mũi cho kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể cao hơn so với liều tiêm 5 mũi.  Phát đồ gây miễn dịch: + Mũi tiêm thứ nhất :100.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 2: 200.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 3: 400.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 4: 800.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 5: 109 tbvk/1ml Cho thỏ nghỉ 2 tuần nhắc lại mũi tiêm thứ 6 và mũi tiêm thứ 7 + Mũi tiêm thứ 6: 800.106 tbvk/ml + Mũi tiêm thứ 7: 109 tbvk/ml Phát đồ gây miễn dịch với 7 mũi tiêm là phù hợp  Thời gian lấy máu thu kháng huyết thanh: Trong sản xuất kháng huyết thanh dịch hạch nên chọn thời điểm lấy máu thu KHT là 7 ngày sau mũi tiêm cuối cùng thì sẽ thu được kháng huyết thanh có hiệu giá kháng thể cao.  Tinh chế IgG: + Tinh chế IgG bằng phương pháp dùng metanol thu được kháng thể chưa tinh khiết và có một phần IgG bị biến tính. 63 + Tinh chế IgG bằng phương pháp sắc kí ái lực thu được kháng thể tinh khiết Khi tiến hành tinh chế kháng thể sử dụng phương pháp sắc kí ái lực thu được hiệu quả tốt hơn dùng phương pháp tủa bằng metanol.  Đánh giá chất lượng IgG sản xuất: IgG mà chúng tôi tinh chế bằng phương pháp sắc kí ái lực đạt yêu cầu vật lí, vô trùng, độ đặc hiệu, độ tinh khiết, hiệu giá kháng thể và hàm lượng protein. II. KIẾN NGHỊ: - Tiếp tục hoàn thiện phương pháp tinh chế IgG để thu được IgG tinh khiết, có chất lượng cao. - Dùng thử IgG sản xuất được để nghiên cứu tạo bộ kít kháng thể gắn huỳnh quang phát hiện KN F1 của vi khuẩn dịch hạch. 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. VŨ TRIỆU AN, JEAN CLAUDE HOMBERG Miễn dịch học Nhà xuất bản Y học, Hà Nội - 1997, tr.17-40. 2. PHAN BỔN Xây dựng quy trình sản xuất kháng nguyên F1 gắn hồng cầu cừu đông khô để chuẩn đoán dịch hạch tại Việt Nam Luận án phó tiến sĩ khoa học y dược Hà Nội- 1996 3. PHAN BỔN, ĐÀO XUÂN VINH Bước đầu nghiên cứu sản xuất kháng thể kháng F1 dịch hạch gắn hồng cầu cừu đông khô Tạp chí Y học thực hành số 523- Bộ Y tế xuất bản – 2005, tr 9 – 11 4. HOÀNG MINH CHÂU ( Chủ biên ) Cơ sở phân tích hóa học Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, Hà Nội – 2007, tr 368 – 369 5. NGUYỄN DŨNG, LÊ VIẾT LÔ, ĐINH THỊ NGỌC TUYẾT, HOÀNG LÊ THÚY Bệnh dịch hạch khu vực các tỉnh miền Trung Hội thảo khoa học nhân kỉ niệm 100 năm thành lập Viện Pasteur Nha Trang - 1995, tr.74-88. 6. ĐẶNG TUẤN ĐẠT, PHẠM VĂN HẬU Tình hình bệnh dịch hạch hiện nay trên thế giới và Việt Nam - Bệnh dịch hạch, dịch tễ học, giám sát và phòng chống. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội- 2003, tr. 16-30 7. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG 65 Kỹ thuật sinh hóa Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh – 2003, tr. 60 - 90 8. PHẠM THÀNH HỔ Phương pháp PCR Di truyền học - Nhà xuất bản giáo dục - 2002, tr 405 - 408. 9. NGUYỄN THỊ KÊ và cộng sự Ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật xây dựng công nghệ sản xuất huyết thanh kháng dại tinh chế Chương trình NCKH cấp nhà nước - Viện Vắc xin Nha Trang – 1994, tr.17 10. BẠCH PHƢƠNG LAN Vi sinh vật y học và miễn dịch học Đại học Đà Lạt - 1992, tr.35-87 11. HOÀNG THỦY LONG Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất bản văn hóa, Hà Nội -1991, tr.275 - 278; 360 - 364; 371 - 377. 12. NGUYỄN VĂN MẪN, ĐẶNG ĐỨC TRẠCH, HOÀNG THỦY LONG Hình ảnh hiển vi điện tử của vi khuẩn dịch hạch Công trình nghiên cứu khoa học 1976-1980, Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội, Nhà xuất bản Y học , Hà Nội - 1981, tr.72-73. 13. BERNARD R. GLICK, JACK J. PASTERNAK - Đỗ Lê Thăng, ...[và những người khác] dịch Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp Công nghệ sinh học phân tử - Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội – 2007.tr. 270 – 273; 312 – 322. 14. DƢƠNG ĐÌNH THIỆN (Chủ biên) và các tác giả khác Thực hành dịch tễ học Nhà xuất bản Y học, Hà Nội - 1996, tr.15-25. 15. LÊ HÀ THU 66 Hoàn thiện quy trình tách chiết và tinh chế kháng nguyên F1 của vi khuẩn dịch hạch Y.pestis Luận văn thạc sĩ khoa học ngành sinh học , Đà Lạt - 2006. 16. ĐỖ THUNG, PHAN ĐỨC NHUẬN VÀ CS Tóm lược lịch sử và đặc điểm của dịch hạch ở vùng duyên hải miền Trung Công trình NCKH 1975-1980, Viện Pasteur Nha Trang- 1980, tr.101-103 17. ĐẶNG ĐỨC TRẠCH, NGUYỄN ĐÌNH HƢỜNG, PHẠM MẠNH HÙNG, PONDMAN K.W, WRIGH P.E Miễn dịch học Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội - 1987, tr.71-78; 306-312 18. ĐỖ THUNG, LÊ VIẾT LÔ, ĐINH THỊ NGỌC TUYẾT Phối hợp nhiều phương pháp chuẩn đoán phòng thí nghiệm, nâng cao mức chính xác trong việc xác nhận bệnh dịch hạch Hội nghị khoa học kỹ thuật lần thứ 6, Viện Pasteur Nha Trang - 1982 , tr.176 - 185 19. ĐÀO XUÂN VINH Đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn dịch hạch (Y.pestis) phân lập ở Tây Nguyên Luận án phó tiến sĩ y học , Đại học Y , Hà Nội - 1989. 20. SUNTSOV V.V,SUNTSOVA N.I Dịch hạch nguồn gốc và quá trình tiến hóa của hệ thống dịch động vật Nhà xuất bản Y học, Hà Nội - 2005, tr.15-16. TIẾNG ANH 21. DAVIES D.A.L., Aspecific polysaccharide of Pasteurella pestis Biochem .J. 63 - 1956, pp. 105 – 116. 22. STEIN B., AND DOSOWITZ R. S., 67 The measurement of antibody in human malaria by a formolized tauned sheep cell heamagglutination test Bull. WHO.1964. 30, pp. 45 – 49. 23. KILONZO B.S., Plague epidemiology and control in eastern and southern Africa during the period 1978 – 1997 Cent. Afr. J. Med., 45 ( 3 ) .1999, pp. 70 – 76. 24. NAGANATH C., SANGUPTA D.N., Manual . Royal tropical Institute Amsterdam. 1987 25. ROBERT D.P., AND JACQUELINE D.F., Yersinia pestis – Etilogic Agent of Plague Journal Microbiology Reviews .1997, pp. 35 – 65. 26. WILLIAMS J.E., GENTRY M.K., BRODEN C.A., TYNDAL G.L., ALTIERI P.L., BERMAN S., ROBINSON D.M , A monoclonal antibody for the specific dianogsis of plague Bull. WHO.1988. 66, pp. 77 – 82. 27. ALONSO J.M., MAZIGHD AND H.H MOLEARET Laboratory management of plague Bacterial ecology Unit, Department of bacteriology and micrologie of Institute Pasteur, Paris . 1985, pp. 7- 23. 28. ROLAND KONTERMANN, STEFAN DUBEN ( eds ) Antibody engineering Springer – Berlin; New York . 2001.pp. 252 – 255, 302 – 305, 330 - 332 29. MEYER K.F., Effectiveness of live or killed plague vaccines in man Bull. WHO.1970. 42, pp. 653 – 666. 30. MEYER K.F., HIGHTTOWER J.A., AND MC CRUMB F.R Plague immunization VI. Vaccination with the fraction I antigen of Yersinia pestis 68 J. Infect diseases. 1974. 129, pp. 41 – 45. 31. ROSE LJ., et al., 2003 Survival of Yersinia pestis on environmental surfaces Applied and Environmental Microbiology. 2003; 69 ( 4 ): 2166 - 2171 32. CRUMPTON M.J., DAVIES D A.L., An antigen analysis of Pasteurella pestis by diffusion of antigen and antibodies in agar Proc. Roy. Soc. 1956. 145, pp. 109 – 134. 33. Chu M.C., Laboratory manual of Plague diagnostic tests CDC AND WHO, 3rd edition . 2000, pp. 12 – 15, 67 – 89. 34. RAO M.S., The nutritional requirements of the plague bacillus Indian J. Med. Res. 1939.27, pp. 75. 35. NORKINA O.V., et al., Development of a diagnostic test for Yersinia pestis by the polymerase chain reaction. . Journal of Applied Biotechnology. 1994; 76: 240 - 245. 36. KISSLING R.E., The fluorescent antibody test in rabies In “ Natural history of rabies” 37. ALLAN R. LARABEE, JOHN D. MARSHALL AND DAW CROZIER Isolation of antigen of Pasteurella pestis J. Bacteriol.1965- 90, pp. 116 – 119 38. WALKER R., Plague toxins A critical review. Current topics in microbiol and immunil. 1967. 41, pp. 23 – 42. 39. TENGERDY R.P., HILLAM R.P., 69 Quantitative differentiation of Yersinia pestis strains by their murine toxin and fraction I contents Bull. WHO.1973. 48, pp. 279 – 287. 40. BOYDEN S.J., Exp. Med .1951, pp. 93 – 107. 41. SUZUKI S., SAKAKIBARA H., HOTTA S., Latex agglutination test for measurement of antiplague antibodies Journal of clinical microbiology. 1977. 6, pp. 332 – 336. 42. CHANTEAU S., et al., 2000 Early diagnosis of bubonic plague using F1 antigen capture ELISA assay and rapid immunog old dipstick. International Journal of Medical Microbiology. 2000; 290: 279 - 283 43. MICHAEL SHEPEL., MAXWELL R.KLUGEREMAN Effect of adjuvants on antibody response of rabbits inoculated with Venezeulan equine encephalonelitis virus Journal of bacteriology, volume 85. May. 1963, Number 5, pp. 1150 – 1152. 44. MONTIE T.C., MONTIE D.B., J. Exp. Med.1964. 124, pp. 1271 45. CHEN T.H., MEYER K.F An evaluation of Pasteurella pestis fraction-1 specific antibody the confirmation of plague infections Bull. WHO.1966. 34, pp. 911 – 918. 46. CHEN T.H., Studies on imunization against plague. IV. The method of the hemagglutination test and some observation on the antigen J. Immunol. 1952. 69, pp. 587. 47. BUTLER.T., Plague ADN other Yersinia infections 70 International center for diarrhoel research Dhaka, Banglerdesh, University cleveland, Ohio .1983, pp. 163 – 168. 48. BURROWS T.W., BACON G.A., The basis of virulence in Pasteurella pestis the development of resistance to phagotocytosis in vitro. J. Exp. Pathol. 1956. 53, pp. 286 – 299. 49. DU Y., et al., Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis. Infection and Immunity. 2002; 70: 1453 - 1460. 50. JANSSEN W.A., SURGALLA M.J, Plague bacillus survival within host phagocytes Sciense. 1969. 163, pp. 952 51. WHO Human plague in 2002 and 2003 Weekly epidemiological Record. 79, pp.301 – 308 TÀI LIỆU TRÊN MẠNG 52. http://www.ivac.com.vn/ (Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế): Các sản phẩm Vacxin và huyết thanh 53. http://www.pasteur-hcm.org.vn/vacxin_sp/vacxin_sp.htm (Viện Pastuer tp HCM) Sản phẩm Kháng nguyên 54. http:// www.nihe.org.vn Viện vệ sinh dịch tễ trung ương 55. http://nicvb.org.vn/default.asp Viện kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế 56. http://www.bionity.com/antibodies/ a database of over 170.000 antibodies from 20 different manufacturers and vendors 57. http://www.who.int/en 71 World health organization 58. http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/plague/lab-test-criteria.htm Center for Disease and Prevention (CDC) - Laboratory test criteria for Diagnosis of Plague [...]... Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất các loại KHT, KT đã được tiến hành tại một số viện Pasteur Tuy nhiên việc nghiên cứu và sản xuất KT đơn dòng ở nước ta chưa được phổ biến mà mới chỉ bước đầu đi vào nghiên cứu Sản xuất kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện KN F1 dịch hạch ở Việt Nam chưa có nơi nào sản xuất, do đó đặt vấn đề nghiên cứu sản xuất, tinh chế IgG là cần thiết 1.7.4 Tinh chế kháng thể [... nghị Khoa học lần thứ VI chống dịch hạch vùng Trung Á – Kazắcttăng, Alma – Ata vào năm 1969 Mensôf đã hoàn thiện quy trình sản xuất hồng cầu chẩn đoán cho nghiên cứu huyết thanh học dịch hạch năm 1970 Viện nghiên cứu khoa học chống dịch hạch Trung Á Alma – Ata đã sản xuất nhiều lô KT chẩn đoán phát hiện KN F1 với nồng độ rất nhỏ chỉ cần 0,000625 mcg và nếu trực khuẩn dịch hạch thì chỉ cần 15.625 tế bào... đang tiến hành nghiên cứu và sản xuất nhiều loại KT để phục vụ cho đời sống Vì vậy việc sản xuất KT ở Việt Nam cũng đạt một số thành tựu nhất định - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Hà Nội từ những năm 1990 đã nghiên cứu và sản xuất thử KT đơn dòng kháng tả và bước đầu cho thấy có kết quả khả quan - Năm 1994 Nguyễn Thị Kê chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước đã xây dựng công nghệ sản xuất KHT kháng dại tinh... globulin miễn dịch khác nhau 18 Hình 1.4: Cấu trúc một số lớp kháng thể 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN DỊCH HẠCH 1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng Là bước đầu tiên chính yếu trong công tác chẩn đoán dịch hạch đối với bất cứ người nào bị sốt, hạch rất đau, số lượng hạch nhiều, kích thước hạch lớn hơn hoặc bằng 0,1 cm, nghi ngờ mắc bệnh dịch hạch, sống trong vùng có dịch hạch lưu hành hoặc từ những vùng có dịch trở... chẩn đoán dùng kháng thể để phát hiện các loại virus như virus dại, virus Dengue, virus HIV… đã được sản xuất và sử dụng ở các nước Mỹ, Anh, Pháp Công nghệ sản xuất kháng thể ngày càng được phát triển mạnh vì tính hiệu quả, an toàn và kinh tế của nó Tình hình sản xuất kháng thể ở Việt Nam Do khả năng ứng dụng của việc sản xuất kháng thể mang lại nhiều hiệu quả trong điều trị bệnh và sản xuất các kít... cặp primer được sử dụng trong PCR để phát hiện ADN của vi khuẩn dịch hạch là F1- 1/2, Pst 3/5 là Rep 1/2 Phương pháp PCR đã được áp dụng trong nghiên cứu chẩn đoán dịch hạch, tuy nhiên đây là kĩ thuật đòi hỏi máy móc và sinh phẩm đắt tiền phức tạp nên chưa được sử dụng rộng rãi ở các tuyến cơ sở 1.7 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ 1.7.1 Sản xuất kháng thể đa dòng [ 13 ] Các KT đa dòng là một tập hợp các KT đặc... các nhóm trực khuẩn dịch hạch 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên [ 21, 26, 30, 32, 37, 38, 48, 50 ] Schiitre là người đầu tiên nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên của Y pestis Bằng phương pháp hấp phụ và kết tủa ông đã thu được kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân Các nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc kháng nguyên của Y pestis được mở ra khi các nhà khoa học sử dụng phương pháp kết tủa trong thạch Allan và cs, Crumpton... 1.7: Các kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu 25 1.7.3 Tình hình sản xuất kháng thể trên thế giới và Việt Nam [ 9, 13, 26, 53, 54, 56 ] Tình hình sản xuất kháng thể trên thế giới Hiện nay trên thế giới việc sản xuất KT tinh sạch được tiến hành ở nhiều nước, đặc biệt là những nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển như Mỹ, Hà Lan, Nhật, Pháp….chủ yếu là dựa trên công nghệ sản xuất KT... dòng đã được Kohler và Milstein miêu tả và sản xuất thành công từ năm 1975 Trong mấy chục năm qua kỹ thuật này đã có ảnh hưởng lớn tới nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau của miễn dịch học, vi sinh vật học, sinh hóa, sinh lí và sinh học tế bào Cơ sở của kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng là phải thu được thể lai vừa có các đặc tính của tế bào lympho: sản xuất kháng thể và vừa có đặc tính của tế bào... năm 2002 đạt 3,1 tỉ USD với 19 loại sản phẩm khác nhau - Năm 2004, các nhà khoa học Mỹ đã tạo ra được một kháng thể người có thể ngăn chặn sự lây lan của virus SARS trong phòng thí nghiệm - Năm 2005 các nhà nghiên cứu Châu Âu đã tạo ra được kháng thể CD3 có thể điều trị bệnh tiểu đường type I - Năm 2007 các nhà nghiên cứu trường đại học Ghent Bỉ đã sản xuất thành công kháng thể chống virus viêm gan A ... NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH Mục tiêu đề tài: - Sản xuất IgG kháng dịch hạch - Đánh giá chất lượng IgG sản xuất Các nội dung đề tài cần tiến hành: - Nghiên cứu ảnh hưởng kháng nguyên đến... việc nghiên cứu sản xuất KT đơn dòng nước ta chưa phổ biến mà bước đầu vào nghiên cứu Sản xuất kháng thể gắn huỳnh quang để phát KN F1 dịch hạch Việt Nam chưa có nơi sản xuất, đặt vấn đề nghiên cứu. .. khuẩn dịch hạch, để có nguồn nguyên liệu IgG sản xuất kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang đáp ứng nhu cầu giám sát dịch tễ học dịch hạch nước, tiến hành đề tài sau: BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT