- Cho 3 thể tích CH3OH vào 4 thể tích H2O và cũng để ở tầng nước đá
2.2.5.4 Kiểm tra độ sạch bằng phương pháp điện di trên gel SDS polyacrylamide
Các bước tiến hành được tĩm tắt như sau:
- Chuẩn bị mẫu: dung dịch được hịa tan trực tiếp trong dung mơi pha mẫu sao cho cĩ nồng độ 0,5 – 1,5mg protein/ml, đun sơi cách thủy trong 5 phút, để nguội.
- Chuẩn bị dung dịch gel để điện di: trộn 5ml dung dịch acrylamide; 7,5ml đệm gel stacking; 0,3ml SDS 10%; 17,1ml nước với nhau. Cho vào một bình tam giác cĩ nhánh nối với một máy hút chân khơng, vừa hút vừa khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi hết bọt khí. Sau đĩ cho 150 μl Amonium Persulfate, 10 μl TEMED lắc nhẹ cho tan hết.
- Cho gel điện di vào khuơn đúc gel
- Chuẩn bị gel stacking: dung dịch acrylamide 1,32ml; đệm stacking 2,49ml; SDS 10% 99ml; nước 6,09ml. Khuấy từ và hút chân khơng để loại bọt khí. Sau đĩ cho 50,1ml Ammonium Persulfate và 4,95ml TEMED rồi lắc nhẹ cho tan hết.
- Điện di: đổ dung dịch phủ trên gel điện di ra và cho 0,5ml gel stacking để tráng bề mặt rồi đổ bỏ. Cho đầy gel stacking vào và đặt lược để thành các giếng, cố định trong 60 phút. Lấy lược ra khỏi gel, tráng lại giếng bằng dung dịch điện di rồi đổ bỏ. Đặt gel đúng vị trí trong hộp điện di, thêm dung dịch điện di vào hộp điện di, bơm 5 - 10
μl cĩ nồng độ khoảng 1 μg/ μl mẫu KHT đã được xử lí bằng dung dịch pha mẫu vào giếng. Đĩng điện và tiến hành điện di. Sau khoảng 1 giờ tắt điện và lấy gel ra nhuộm. - Nhuộm và đọc kết quả: đặt gel trong dung dịch cố định màu nhanh trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Chuyển gel qua dung dịch nhuộm protein trong vài giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ đến khi nào thấy các vệt màu hiện lên. Cuối cùng cho gel vào dung dịch tẩy màu, dung dịch này được thay 2 lần trong một ngày đến khi nào gel trong. Gel hồn tất cĩ thể được bảo quản trong acid acetic 7% hoặc nước.