- Kháng nguyên F1 do cơng ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt sản xuất Sodium phosphate 0,02M pH: 7,
2.2.3 Phƣơng pháp gây miễn dịch thỏ thu kháng thể và lấy máu
Phương pháp pha kháng nguyên dựa vào bộ đo độ đục chuẩn
- Từ huyền dịch vi khuẩn nuối cấy pha thành KN miễn dịch
- Lắc đều ống đo độ đục mẫu của bộ so độ đục viện Tarasevich –Liên Xơ.
- Hút 0,1ml KN từ huyền dịch vi khuẩn cho vào ống đo, thêm nước muối sinh lí vào từ từ cho đến lúc đạt cùng màu so với ống chuẩn ( ống đo chuẩn và ống thử cĩ màu sắc tương đương nhau).
- Từ đĩ tính được đậm độ kháng nguyên ban đầu và dựa trên kết quả độ đục này pha liều kháng nguyên cần để gây miễn dịch.
Đậm độ huyền dịch vi khuẩn = Đơn vị đo độ đục x Số lần pha lỗng
- Pha kháng nguyên cĩ đậm độ vi khuẩn là 100.106; 200.106; 400.106; 800.106; 109 tbvk/1ml.
- Tiến trình pha lỗng phải được thực hiện với nước muối sinh lí được làm lạnh.
Phương pháp gây miễn dịch thỏ
- Chuẩn bị sẵn kim tiêm với liều tiêm thích hợp, gịn tẩm cồn iod.
- Cho thỏ vào hộp gỗ, cố dịnh phần đầu thỏ ( tránh cử động làm sai lệch kim tiêm ). - Người phụ kỹ thuật dùng tay giữ chặt gốc tai, ngĩn trái và ngĩn trỏ giữ tĩnh mạch tai thỏ, búng mạnh vào tai để tĩnh mạch nổi rõ.
- Trước khi bơm kháng nguyên, người tiêm sát trùng nơi tiêm bằng cồn iod, sau đĩ đưa kim tiêm chích xác vào đường tĩnh mạch bơm kháng nguyên từ từ chảy vào tĩnh mạch tai, người giữ thả lỏng tay để kháng nguyên chảy vào dễ dàng.
- Sau khi bơm kháng nguyên hết, rút kim tiêm khỏi tĩnh mạch, đặt bơng sát cồn lên vết tiêm giữ chặt cho máu và KN khơng chảy ngược ra.
- Thời gian từ khi pha lỗng KN EV sống miễn dịch đến khi kết thúc gây miễn dịch cho thỏ khơng quá 2 giờ 30 phút.
Miễn dịch EV được tiến hành cụ thể như sau: Đường tiêm : tĩnh mạch
Khoảng cách tiêm: 1 tuần Phát đồ tiêm: + Mũi tiêm thứ nhất :100.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 2: 200.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 3: 400.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 4: 800.106 tbvk/1ml + Mũi tiêm thứ 5: 109 tbvk/1ml
Cho thỏ nghỉ 2 tuần nhắc lại mũi tiêm thứ 6 và mũi tiêm thứ 7 + Mũi tiêm thứ 6: 800.106
tbvk/ml + Mũi tiêm thứ 7: 109 tbvk/ml
Sau mũi tiêm thứ 7 cho thỏ nghỉ 7 ngày rồi lấy hết máu
Phương pháp lấy máu thỏ:
Thỏ sau khi được gây miễn dịch cho ăn uống đầy đủ, chăm sĩc cẩn thận. Đến ngày thứ 7 sau mũi tiêm cuối cùng lấy tồn bộ máu bằng cách lấy máu ở động mạch cổ.
- Chuẩn bị hộp Roux vơ trùng cĩ gắn kim tiêm , kéo inox vơ trùng.
- Đặt thỏ nằm ngửa và cột bốn chân thỏ vào 4 gĩc khay inox. Dùng cồn iod sát trùng vùng cổ, lấy kéo rạch lớp da bên ngồi để tìm động mạch cảnh. Buộc chặt động mạch cảnh để máu khơng lưu thơng về phía đầu thỏ, buộc hờ phía cịn lại hướng về phía ngực bằng dây nhợ trắng cĩ tẩm cồn iod.
- Dùng ngĩn tay trỏ nâng động mạch cảnh lên, cịn tay kia đưa kim gắn với dây silicon của hộp Roux vào động mạch cảnh. Giữ chặt và rút hết máu ở tim từ động mạch cảnh vào hộp Roux đặt nằm ngang phía bên dưới cho đến lúc máu ngừng chảy rồi đậy kín nắp hộp Roux.
- Sau khi máu đã đơng hồn tồn, đặt vào tủ lạnh 4 – 80C cho huyết thanh tách ra. Sau khi để bình Roux 48 giờ trong lạnh, hút tách lấy kháng huyết thanh ( trong phịng vơ trùng ) và đem kháng huyết thanh ly tâm để loại bỏ hồng cầu bị vỡ.
- Kiểm tra kháng huyết thanh thơ: kiểm tra vơ trùng trên mơi trường thioglycolate, tính đặc hiệu kháng thể bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên lam kính và hiệu giá kháng thể bằng phương pháp định lượng hiệu giá kháng thể trong ống nghiệm.
Hình 2.2: Lấy máu ở động mạch cảnh thu kháng huyết thanh
Hình 2.4: Kháng huyết thanh miễn dịch sau khi li tâm 2.2.4 Phƣơng pháp tinh chế kháng thể
2.2.4.1 Dùng metanol
Quá trình tinh chế IgG được tĩm tắt như sau:
- Dùng 1 thể tích ( V ) đệm phosphate M/15 pH 7,2 cho vào 2 thể tích ( V ) kháng huyết thanh và để ở nhiệt độ 40C trong 1 giờ 30 phút.