Xác định một số đặc điểm sinh hóa và so sánh protein màng của các chủng vi khuẩn vibrio spp phân lập từ cá chẽm (lates calcarifer)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ SO SÁNH PROTEIN MÀNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Vibrio spp. PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer) Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc Sinh viên thực hiện : Trần Đàn Mã số sinh viên : 53130024 Khánh Hòa, tháng 6 năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong 4 năm học tại trƣờng Đại học Nha Trang, tôi đã tiếp thu đƣợc rất nhiều kiến thức từ sự dạy bảo và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô và bạn bè. Với tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình làm đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn cô đã luôn luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em có thể học hỏi đƣợc nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý giá. Chị Nguyễn Minh Nhật đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc thực hành tại Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trƣờng Đại học Nha Trang. Quý thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ Sinh học đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản và chuyên ngành trong suốt 4 năm học. Tôi xin đƣợc cảm ơn những ngƣời bạn thân yêu của lớp 53CNSH, đặc biệt là bạn Nguyễn Anh Thƣ đã luôn quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt những năm qua. Cuối cùng, con xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến gia đình. Cảm ơn ba mẹ và mọi ngƣời trong gia đình đã tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần để con có thể hoàn thành khóa học một cách tốt nhất. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 06, năm 2015 Sinh viên thực hiện Trần Đàn ii TÓM TẮT Vibriosis là bệnh phổ biến thƣờng gặp ở các đối tƣợng thủy sản, trong đó có cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790). Cho đến nay, các phƣơng pháp mới đã không ngừng đƣợc nghiên cứu phát triển để chống lại vi khuẩn Vibrio nhằm trị bệnh cho thủy sản khi mà các phƣơng pháp truyền thống nhƣ sử dụng thuốc sát trùng hay kháng sinh không mang lại hiệu quả. Và protein màng ngoài đƣợc xem là một đối tƣợng rất tiềm năng trong phát triển các loại vaccine hay làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể chống lại vi khuẩn Vibrio. Mục đích của nghiên cứu này là xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa và so sánh protein màng của các chủng phân lập đƣợc. Một số đặc điểm sinh hóa cơ bản của các chủng đƣợc xác định bằng kit định danh sinh hóa API-20E, kết hợp với các phần mềm API, ABIS trực tuyến và khóa phân loại Bergey (1994) để định danh. Kết quả đã thu nhận đƣợc 7 chủng phân lập: NH1, NH2, NH3, NH4, VN1, VN2, NT1 có những đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng với các chủng tƣơng ứng là V. mimicus, V. anguillarum, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum và V. diazotrophicus. Phân tích protein màng của các chủng thu đƣợc bằng phƣơng pháp điện di SDSPAGE, kết quả cho thấy các protein màng có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 40 kDa xuất hiện ở tất cả các chủng. 160, 150, 62, 52, 38, 35 và 31 kDa là những protein xuất hiện ở đa số các chủng. Đặc biệt, protein màng có khối lƣợng phân tử là 58 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH1 và protein màng 36 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH3. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có thể làm cơ sở tham khảo cho việc phát triển một loại vaccine hay làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể chống lại nhiều chủng Vibrio gây bệnh trên thủy sản. iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. 1 TÓM TẮT........................................................................................................................ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. v DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. vi DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. vi LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 3 1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới ...................................................................... 3 1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam ...................................................................... 4 1.2 Một số đặc điểm của cá chẽm.................................................................................... 5 1.2.1 Đặc điểm phân loại và hình thái ............................................................................. 5 1.2.2 Đặc điểm phân bố ................................................................................................... 6 1.2.3 Vòng đời ................................................................................................................. 6 1.3 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chẽm ........................................................................... 6 1.3.1 Bệnh do virus .......................................................................................................... 6 1.3.2 Bệnh do vi khuẩn .................................................................................................... 7 1.3.3 Bệnh do nguyên sinh động vật kí sinh ................................................................... 8 1.4 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ............................ 10 1.4.1 Tổng quan về Vibrio spp. ..................................................................................... 10 1.4.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ....................................................... 11 1.4.2.1 Cơ chế gây bệnh ................................................................................................12 1.4.2.2 Đặc điểm dịch tễ ...............................................................................................12 1.4.3 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn gây ra ................................. 13 1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio ........ 13 1.6 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide ......................................................... 15 1.6.1 Sơ lƣợc về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide ................................................................................................. 15 1.6.2 Gel polyacrylamide .............................................................................................. 15 1.6.3 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................................ 16 iv 1.6.4 Nhuộm gel sau khi điện di .................................................................................... 17 1.6.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide ..................... 17 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 19 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 19 2.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 19 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu .............................................................................. 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 20 2.4.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn ........................................................................... 20 2.4.2 Định danh vi khuẩn .............................................................................................. 20 2.4.3 Phƣơng pháp tách chiết protein màng của vi khuẩn ............................................. 21 2.4.4 Phƣơng pháp điện di SDS - PAGE ....................................................................... 22 2.4.5 Phƣơng pháp Bradford ......................................................................................... 25 2.4.6 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................... 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 27 3.1 Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm ............. 27 3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .................................................................................... 27 3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .................................. 28 3.2 Kết quả xác định protein màng của các chủng vi khuẩn Vibrio theo phƣơng pháp điện di SDS - PAGE ...................................................................................................... 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 34 1 Kết luận....................................................................................................................... 34 2 Kiến nghị .................................................................................................................... 34 PHỤ LỤC A PHỤ LỤC B v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT APS Ammonium Persulphate cfu Colony Forming Unit cs Cộng sự h Giờ kDa Kilodalton NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth OD Optical Density OMP Outer membrane protein. PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Rpm Revolutions per minute SDS Sodium Dodecyl Sulphate TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar TEMED Tetramethylethylenediamine Tris Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) – aminomethane TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS – PAGE và phạm vi phân tách protein ......24 Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch điện di protein ...............................................24 Bảng 2.3. Nồng độ dung dịch BSA (µg/ml) .................................................................26 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ........27 Bảng 3.2. Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm...............................................................................................................................29 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sản lƣợng cá chẽm thế giới qua các năm ........................................................ 3 Hình 1.2. Hình thái bên ngoài của cá chẽm ..................................................................... 5 Hình 1.3. Quá trình polymer hóa của acrylamide ........................................................ 16 Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu .................................................................... 19 Hình 2.2. Bộ điện di SDS-PAGE (Bio-Rad) ................................................................. 22 Hình 2.3. Mô hình điện di SDS-PAGE ......................................................................... 23 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng TCBS ................................................. 27 Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trƣờng NA bổ sung 2% NaCl . 28 Hình 3.3. Nhuộm Gram vi khuẩn ................................................................................. 28 Hình 3.4. Kết quả phân tích protein màng của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bằng phƣơng pháp SDS-PAGE ........................................................................... 31 1 LỜI MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khi mà nền kinh tế Việt Nam đang có những bƣớc tăng trƣởng đáng kể, thì ngành nuôi trồng thủy sản cũng đã có những bƣớc tiến nhảy vọt và đang đƣợc coi là một trong những ngành mũi nhọn trong tiến trình phát triển nền kinh tế của nƣớc ta. Việt Nam đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với nhiều lợi thế trong nuôi trồng các đối tƣợng thủy sản, đặc biệt là cá biển. Trong số các loài cá biển đang đƣợc nuôi ở nƣớc ta thì cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) là một trong những đối tƣợng nuôi có giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao. Sản lƣợng và diện tích nuôi cá chẽm đã không ngừng tăng lên qua từng năm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc và xuất khẩu. Tuy nhiên, đi kèm với sự gia tăng nhanh chóng cả về số lƣợng và diện tích nuôi, đó là sự suy giảm chất lƣợng môi trƣờng do thiếu sự quản lý, quy hoạch cũng nhƣ ý thức bảo vệ môi trƣờng của ngƣời nuôi. Những yếu tố này làm cho dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều và gây ra những thiệt hại ngày càng lớn. Trong số các bệnh thƣờng gặp ở cá chẽm thì bệnh do các chủng vi khuẩn Vibrio là nguy hiểm và gây ra nhiều thiệt hại nhất. Chúng là những vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thƣớc 0,3 - 0,5 µm x 1,4 - 2,6 µm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một hoặc nhiều tiên mao mảnh [1]. Nhóm vi khuẩn này gây ra thiệt hại rất lớn đến nghề nuôi cá biển trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Vì vậy, việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn Vibrio để điều trị bệnh cho cá chẽm nói riêng và thủy sản nói chung là điều hết sức cần thiết. Hiện nay, các biện pháp phòng và trị bệnh chủ yếu trong thủy sản vẫn là sử dụng thuốc sát trùng, kháng sinh. Nhƣng thuốc sát trùng thƣờng để lại hậu quả nghiêm trọng cho môi trƣờng. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh cũng có nguy cơ phá vỡ cân bằng hệ vi sinh môi trƣờng và để lại dƣ lƣợng trong sản phẩm, gây nguy hại cho môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Trƣớc thực trạng đó, có rất nhiều phƣơng pháp chữa bệnh mới đã đƣợc nghiên cứu và phát triển nhƣ việc đƣa vaccine vào phòng bệnh cho thủy sản. Chính vì thế, những hiểu biết về protein màng ở vi khuẩn sẽ góp phần phát triển cũng nhƣ đem lại hiệu quả cho các phƣơng pháp chữa bệnh mới. 2 Mục tiêu của đề tài: Xác định một số đặc điểm sinh hóa và so sánh protein màng của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790). Các nội dung chính của đề tài: 1. Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio từ cá chẽm. 2. Phân tích protein màng của các chủng thu đƣợc. Những sai sót trong đồ án là điều không thể tránh khỏi do thời gian thực hiện đề tài có hạn, bên cạnh đó là những hạn chế về kiến thức và bƣớc đầu làm quen với phƣơng pháp nghiên cứu khoa học. Kính mong quý thầy cô cùng bạn đọc góp ý kiến để đồ án đƣợc hoàn thiện hơn. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới Cá chẽm là loài cá có giá trị kinh tế cao, dễ nuôi do cá có khả năng chịu đựng tốt với điều kiện môi trƣờng, với các loại thức ăn đa dạng nên là đối tƣợng nuôi thích hợp và thực tế đã đƣợc nuôi phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, đặc biệt là khu vực Châu Á - Thái Bình Dƣơng. Nghề nuôi cá chẽm đƣợc hình thành từ những năm đầu của thập niên 1970 ở Songkla - Thái Lan. Đến năm 1973, Thái Lan đã thành công trong việc kích thích cá nuôi vỗ cho sinh sản bằng phƣơng pháp điều chỉnh môi trƣờng. Từ đó, vòng đời của loài cá này đã đƣợc khép kín trong sản xuất giống nhân tạo. Đến năm 1985, mỗi năm Thái Lan sản xuất trên 100 triệu con giống và là nguồn cung cấp giống chủ yếu cho các trại nuôi cá biển trong nƣớc và cả các nƣớc trong khu vực. Từ đó nghề nuôi cá chẽm đƣợc nhân rộng ở các nƣớc Châu Á nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Singgapore, Indonesia, Malaysia và Việt Nam, đóng góp không nhỏ vào sản lƣợng cá thế giới [4]. Hình 1.1. Sản lượng cá chẽm thế giới qua các năm (Nguồn: FAO, 2013) 4 1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam Nuôi trồng thủy sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế ở Việt Nam và đã đƣợc FAO đánh giá là một phƣơng tiện xóa đói giảm nghèo hiệu quả. Năm 2014, với sản lƣợng nuôi trồng đạt 3,393 triệu tấn đã góp phần khẳng định thế mạnh của nƣớc ta trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản so với các nƣớc trong khu vực và thế giới. Mục tiêu đầy tham vọng của ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam năm 2015 là sản xuất ra 3,95 triệu tấn sản phẩm đã nhận đƣợc sự hỗ trợ to lớn cả về tài chính cũng nhƣ kỹ thuật từ Bộ Thủy Sản (Việt Nam) và một số tổ chức quốc tế khác. Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao và cá chẽm là một trong số đó. Cá chẽm phân bố dọc theo bờ biển từ Móng Cái đến Cà Mau trong tất cả các thủy vực từ nƣớc ngọt, nƣớc lợ đến nƣớc mặn. Vì vậy, diện tích nuôi phù hợp cho cá chẽm ở Việt Nam rất lớn. Hiện nay, cá chẽm đƣợc nuôi ở nhiều nơi trên khắp cả nƣớc nhƣ Đồng bằng sông Cửu Long, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Thừa Thiên Huế…. Việc chọn đối tƣợng nuôi có ý nghĩa rất quan trọng trong nghề nuôi cá biển. Đối tƣợng nuôi phải có giá trị kinh tế cao đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu dùng của thị trƣờng trong và ngoài nƣớc. Đặc biệt là phải chủ động nguồn giống cả về số lƣợng, chất lƣợng và tính mùa vụ. Cá chẽm đƣợc đƣa vào nghiên cứu, sản xuất giống nhân tạo ở các Viện Nghiên Cứu Thủy Sản I, II, Trƣờng Đại học Cần Thơ, Trƣờng Đại học Nha Trang từ những năm 1994. Năm 2000, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã nghiên cứu thành công và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nhân tạo giống cá chẽm khép kín từ quy trình thuần dƣỡng và nuôi cá bố mẹ thành thục trong bể xi măng, kích thích sinh sản, ƣơng nuôi cá bột thành cá giống đã góp phần to lớn phát triển ngành nuôi cá chẽm ở nƣớc ta [6]. 5 1.2 Một số đặc điểm của cá chẽm 1.2.1 Đặc điểm phân loại và hình thái Theo FAO (1974) cá Chẽm có hệ thống phân loại nhƣ sau: Ngành động vật có xƣơng sống Lớp cá xƣơng Chordata Osteichthyes Phân lớp cá vây tia Actianopteryga Phân bộ cá vƣợc Họ cá Sơn biển Giống cá chẽm Loài cá chẽm Percoidei Centropomidal Lates Lates calcarifer (Bloch, 1790) Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lƣng. Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dƣới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lƣng gồm có 2 vi: vi trƣớc có 7 - 9 gai cứng và vi sau có 10 - 11 tia mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lƣợc và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đƣờng bên [29]. Hình 1.2. Hình thái bên ngoài của cá chẽm Khi cá còn khoẻ, trên mặt lƣng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi sống trong môi trƣờng nƣớc biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trƣờng nƣớc ngọt. Khi cá ở giai đoạn trƣởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lƣng và màu vàng bạc ở mặt bụng. 6 1.2.2 Đặc điểm phân bố Cá chẽm là loài phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dƣơng và Ấn Độ Dƣơng, giữa kinh tuyến 500 Đông đến 1600 Tây, vĩ tuyến 260 Bắc đến 250 vĩ tuyến Nam. Cá chẽm rất rộng muối và có tính di cƣ xuôi dòng, cá lớn lên chủ yếu ở vùng nƣớc ngọt nhƣ sông, hồ. Khi thành thục (3 - 4 năm tuổi), chúng sẽ di cƣ ra vùng cửa sông, ven biển có độ mặn thích hợp từ 30 - 32 ‰ để sinh sản. Ấu trùng sau khi nở ra sẽ di cƣ vào vùng cửa sông, ven bờ và lớn lên, cá con sẽ dần dần di cƣ vào các thủy vực nƣớc ngọt sinh sống và phát triển thành cá thể trƣởng thành [6]. 1.2.3 Vòng đời Cá chẽm trải qua phần lớn thời gian sinh trƣởng (2 - 3 năm) trong các thủy vực nƣớc ngọt nhƣ: sông, hồ nơi nối liền với biển. Cá có tốc độ tăng trƣởng nhanh, thƣờng đạt cỡ 3 - 5 kg sau 2 - 3 năm. Cá trƣởng thành 3 - 4 tuổi di cƣ từ vùng nƣớc ngọt về vùng cửa sông và ra biển nơi có độ muối dao động 30 - 32‰ để phát triển tuyến sinh dục và đẻ trứng sau đó. Cá đẻ trứng theo chu kỳ trăng (thƣờng vào lúc khởi đầu của tuần trăng hay lúc trăng tròn) vào lúc buổi tối (6 - 8 giờ) và thƣờng cá đẻ đồng thời với thủy triều lên. Điều này giúp trứng và ấu trùng trôi vào vùng cửa sông. Nơi đó, ấu trùng sẽ phát triển và di chuyển ngƣợc dòng để lớn. Hiện tại, điều chƣa biết là cá trƣởng thành có đi ngƣợc dòng không hay chúng giữ giai đoạn còn lại cuối đời sống ở biển [6]. 1.3 Các bệnh thƣờng gặp trên cá chẽm 1.3.1 Bệnh do virus Bệnh bạch cầu Bệnh bạch cầu tìm thấy ở cá chẽm nuôi lồng, đặc biệt ở cá giống cỡ 4 - 7 cm, bệnh này xuất hiện ở mọi nhiệt độ trong môi trƣờng nƣớc có nồng độ muối cao. Dấu hiệu chính của bệnh là sự nở rộng các tế bào nằm ở tầng hạ bì của da cá, trông giống nhƣ bệnh hình hoa cải. Bệnh truyền nhiễm từ cá này sang cá khác. Bệnh này vẫn chƣa có thuốc trị đặc hiệu [1]. Bệnh hội chứng lở loét ở cá Rhabdovirus gây bệnh cho nhiều loài cá biển, trong đó có cá chẽm và ở nhiều vùng địa lý khác nhau. Virus lây nhiễm qua đƣờng tiêu hóa, xâm nhập qua vết thƣơng, qua mang, mắt và chủ yếu theo chiều ngang. Khi cá mắc bệnh thƣờng có những triệu 7 chứng sau: xuất huyết từng đám nhỏ trên thân, đầu, gốc vây và cuống đuôi dẫn đến cá bị hoại tử từng phần và chết sau 1 - 2 tuần nhiễm bệnh. Khi mổ xoang bụng thấy chứa nhiều chất nhờn có hiện tƣợng ruột bị viêm. Thời gian gây bệnh tùy theo sức đề kháng của cá, mùa vụ và chất lƣợng môi trƣờng nƣớc, tỷ lệ nhiễm 20 - 100%. Không có thuốc trị đặc hiệu [1]. Bệnh hoại tử thần kinh Bệnh truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi Nodavirus tác động vào hệ thần kinh, tỷ lệ chết có thể 90 - 100% trong vòng 10 ngày. Cá chẽm mắc bệnh có dấu hiệu thân sẫm màu, bơi vòng tròn mất phƣơng hƣớng, cá nổi lên bề mặt hoặc chìm. Bệnh lây lan qua niêm mạc mắt mũi, qua vết thƣơng trên da…lây từ cá bệnh sang cá khỏe hoặc lây gián tiếp qua vật trung gian, lây từ cá bố mẹ sang cá con, gây bệnh từ giai đoạn ấu trùng đến cá giống nhiều nhất là giai đoạn ấu trùng dƣới 20 ngày tuổi. Thời gian ủ bệnh khoảng 4 ngày, nhiệt độ gây bệnh rất rộng là 0 - 28oC [2]. 1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas sp. Aeromonas sp. là loài vi khuẩn sinh sản trong môi trƣờng nƣớc, chúng có thể hiện diện trong mô của cá con hoặc cá trƣởng thành bình thƣờng, nhƣng khi cá bị sốc môi trƣờng hoặc bị tổn thƣơng, Aeromonas sp. sẽ bộc phát gây bệnh xuất huyết trong với mức tử vong cao. Các yếu tố nhƣ: nhiệt độ, pH, CO2, O2 thay đổi bất lợi, NH3 tự do trong nƣớc cao…đƣợc coi là những nguyên nhân có thể gây sốc và gây ra sự tấn công của Aeromonas sp. vào cơ thể cá. Bệnh xuất hiện quanh năm, nếu kèm với nấm, bệnh sẽ nặng hơn, tỷ lệ chết 30 - 80% [18]. Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio Vi khuẩn Vibrio tấn công nhƣ là một trƣờng hợp điển hình của bệnh nhiễm trùng máu và gây chết. Cá bỏ ăn, bị sẫm màu toàn thân, các đặc trƣng của bệnh bao gồm: xung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể, xuất huyết lở loét trên mô da và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm. Gan, lá lách và thận bị xung huyết và thƣờng kèm theo sự hoại tử. Ruột, trực tràng có thể bị sƣng lên và có dịch nhờn trong suốt. Bệnh do vi khuẩn Vibrio ở cá con ít biểu hiện rõ triệu chứng lâm sàng, toàn thân phủ với một lớp chất nhờn, thỉnh thoảng xuất hiện những vết thƣơng nhỏ nhƣng chƣa lở loét, các vây đuôi và hậu môn bị sƣng đỏ. Cá con chết nhanh hơn 8 cá lớn. Cá trong bể ƣơng chết do bị nhiễm Vibrio thƣờng xuất hiện những đốm đỏ trên toàn thân, trƣờng hợp cấp tính cá chết khi chƣa có biểu hiện lâm sàng [18]. Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ Plexibacter columnaris gây ra thƣờng gặp ở cá chẽm nuôi ở nồng độ muối thấp vào suốt mùa mƣa và cả mùa nắng. Biểu hiện bệnh là xuất hiện những vết thƣơng dạng nhƣ cái yên ngựa ở giữa cơ thể cá. Vết thƣơng xuất hiện đối xứng hai bên cơ thể có dạng dĩa màu vàng nhạt và biến màu đen ăn sâu vào da cá. Đây có thể là bệnh mãn ác tính [1]. Bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus Chủ yếu là Streptococcus iniae, S. agalactiae..., có dạng hình cầu gây ra, bệnh xuất hiện gây tổn thất lớn, tỷ lệ chết 50 - 100% thƣờng xảy ra khi môi trƣờng nuôi không thuận lợi, ở những tháng có nhiệt độ cao và cũng có thể xảy ra bất cứ tháng nào trong năm. Cá giống và cá trƣởng thành đều dễ mắc bệnh này, nhất là cá dƣới 5 tháng tuổi. Vi khuẩn theo đƣờng thức ăn vào hệ tiêu hóa hoặc qua vết thƣơng ngoài da vào cơ thể cá, thời gian ủ bệnh 2 - 3 ngày có khi 7 ngày tùy số lƣợng vi khuẩn xâm nhập, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cá. Khi cá mắc bệnh có các biểu hiện: bơi không định hƣớng xoay vòng tròn, thân sẫm màu, bơi trên tầng mặt, mắt lồi, xuất huyết ở mắt và gốc vây, hậu môn và một số nơi trên cơ thể. Trong cơ quan nội tạng: xoang bụng chƣớng có dịch đặc, túi mật sƣng sẫm, lá lách sƣng xuất huyết, gan tái, thận sƣng viêm. Khi bệnh xuất hiện cùng với nấm sẽ làm cho bệnh nặng thêm [18]. Bệnh do nấm Đây là bệnh truyền nhiễm xảy ra riêng lẻ hoặc kết hợp với virus hay vi khuẩn hoặc kết hợp cả ba loại tác nhân gây bệnh làm cho bệnh trầm trọng hơn, rất khó điều trị triệt để. Chính vì thế, việc phòng bệnh luôn đƣợc đặt lên hàng đầu. 1.3.3 Bệnh do nguyên sinh động vật kí sinh Bệnh do ký sinh trùng Crytocaryon sp. Crytocaryon sp. là một loài ký sinh nƣớc mặn. Bề mặt của cá bị ký sinh trùng có những đốt mủ màu trắng hoặc nhiều túi nang nhỏ màu hơi xám, đó là những tổ của tiêm mao trùng nằm dƣới lớp biểu bì của cá. Ký sinh trùng sẽ sử dụng những tế bào dƣới lớp biểu mô của cá bị ký chủ và gây kích thích mạnh dẫn đến tình trạng cá tiết nhiều nhớt và cuối cùng gây hại hoàn toàn bề mặt hô hấp của các tia mang. Trên da, ký 9 sinh trùng gây ra những vết thƣơng lớn phá hoại cả một vùng rộng trên lớp biểu bì. Sự nhiễm trùng thứ cấp làm cho bệnh thêm trầm trọng và gây chết cá [18]. Bệnh do ký sinh trùng Trichodina sp. Đây là những nguyên sinh động vật ký sinh nhiều nhất, đặc biệt gây hại cho cá con. Chúng ký sinh trên mang cá và hơn 50% cá chẽm giống chết do bị nhiễm nặng loại ký sinh này. Chúng cũng gây nhiều trở ngại cho cá chẽm nuôi lồng ở mật độ cao. Cá bị bệnh ký sinh này tiết nhiều nhớt, da rƣớm máu, suy nhƣợc nhanh và da bị hoại tử. Khi cá bị nhiễm bệnh, vây bị rách tả tơi và có thể kèm theo sự biếng ăn hoặc bỏ ăn. Trƣờng hợp có quá nhiều ký sinh trùng bám vào mang, sẽ ảnh hƣởng đến hô hấp của cá [1]. Bệnh do ký sinh trùng Henneguya sp. Tiêm mao trùng hay trùng roi thƣờng ký sinh ở trên mang cá nuôi lồng. Trƣờng hợp bị nhiễm trùng bệnh nặng có thể ký sinh trên da cá. Dấu hiệu bị nhiễm ký sinh trùng đặc trƣng là lây lan nhanh; mang và cơ thể cá bị viêm dẫn đến hoại tử. Chu kì sống của trùng roi trải qua giai đoạn bào nang bơi tự do bằng 2 tiêm mao, khi bám vào vật chủ, trùng chuyển sang giai đoạn sinh trƣởng có dạng túi và có cơ chế ký sinh phức tạp, chúng hút dinh dƣỡng từ vật chủ và lớn lên rời ký chủ tìm các giá thể để đẻ trứng bào sát và tạo bào nang [1]. Bệnh do ký sinh trùng Epistylia sp. Nguyên sinh động vật Epistylia sp. này tìm thấy trên cá chẽm nuôi ở nƣớc ngọt. Epistylia sp. thƣờng là ngoại cộng sinh, đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh bám vào cá. Nguyên sinh động vật này có thể sống ở những nhiệt độ khác nhau và khi cá bị ký sinh nhiều, trên cơ thể sẽ thành từng nhóm bề mặt màu xám [1]. Bệnh do giun ký sinh Sán đơn chủ Diplectanum latersi thƣờng ký sinh trên mang cá và có thể ký sinh quanh năm ở cá nuôi trong lồng hay trong ao. Nhiệt độ giữ vai trò quan trọng trong việc dẫn đến sự bộc phát bệnh do sán lá đơn chủ. Trong các giai đoạn sinh trƣởng của cá thì giai đoạn cá con có tính mẫn cảm cao nhất với bệnh sán lá đơn chủ. Sán lá song chủ ký sinh trong ruột cá chẽm thƣờng là Pseudometadena celebesensis. Giun tròn có nhiều loài đƣợc phát hiện ở cá chẽm lớn, nhỏ và ấu trùng cá bột, cá con nhƣng chỉ có 1 vài loài đƣợc xem là mầm bệnh gây nguy hiểm cho cá. Giun tròn Cucullanus thƣờng thấy trong ruột cá lớn hơn là ruột cá nhỏ. 10 Giun đầu móc mặc dù có vòi với những hàng móc bám đáng sợ nhƣng không đƣợc xem là gây bệnh nguy hiểm cho cá. Phần lớn giun đầu móc ở cá chẽm thƣờng thấy ở ruột những con cá trƣởng thành [18]. Các loài giáp xác ký sinh Giáp xác Caligus sp. chúng bám vào mang cá, xoang miệng, xoang nắp mang, đôi khi trên da và vây của cá. Nếu mức độ bị ký sinh nặng có thể gây tử vong hàng loạt đặc biệt là ở cá con. Giáp xác Lernanthropus sp. thƣờng tìm thấy ở mang cá chẽm nuôi lồng, với số lƣợng lớn ký sinh trùng này có thể gây bệnh thiếu máu cho cá và dẫn đến cá chết. Giáp xác Aega sp. thƣờng thấy nhiều ở cá chẽm nuôi lồng, ký sinh trùng này bám vào mang cá, cá bị nhiễm bệnh biếng ăn thiếu máu và chậm lớn. Cá con bị nhiễm nặng có thể chết nhanh trong hai, ba ngày [18]. 1.4 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 1.4.1 Tổng quan về Vibrio spp.  Hệ thống phân loại: Khóa phân loại của Bergey (1994) Ngành : Proteobacteria Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Vibrionales Họ : Vibrionaceae Giống : Vibrio Loài: V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. anguillarum,…  Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thƣớc 0,3 - 0,5 µm x 1,4 - 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Vi khuẩn không phát triển trong môi trƣờng không muối (NaCl) và không sinh H2S. Phần lớn các loài Vibrio sống hoại sinh, chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho ngƣời. Một số chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống trong nƣớc ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nƣớc lợ ven biển. Vi khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng của tôm, cua… Đặc 11 trƣng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 - 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trƣờng acid [1], [10]. Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trƣờng nƣớc, đặc biệt là nƣớc biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu cầu cần thiết tuyệt đối. 1.4.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển Bệnh Vibriosis trên cá biển xảy ra ở khắp nơi trên thế giới ở cả môi trƣờng nƣớc mặn và các vùng gần cửa sông. Một khi đã bùng phát dịch Vibriosis thì tỷ lệ tử vong là rất cao và có thể lên đến trên 50 % đối với cá nuôi. Vibrio anguillarum là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibrio đƣợc phát hiện gây bệnh trên cá và nó đã đƣợc phân lập từ cá chình nuôi ở Địa Trung Hải bởi Canestrini vào năm 1883. Và những năm sau đó, ngƣời ta cho rằng các tác nhân gây bệnh Vibriosis chính là loài vi khuẩn này. Cho đến nay, có rất nhiều loài Vibrio đã đƣợc báo cáo là nguyên nhân gây bệnh trên cá biển bao gồm: V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. carchariae, V. damsela, V. harveyi…. Nghiên cứu của Austin B. và cs (2006) đã xác định V. harveyi là một tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trên cá biển và động vật không xƣơng sống. Đối với cá biển, V. harveyi gây ra các bệnh: viêm mạch, viêm dạ dày - ruột và tổn thƣơng mắt [7]. Một nghiên cứu khác của Sadok Khouadja và cs (2013) cho thấy độc lực của các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ cá chẽm bệnh ở các trang trại ở Tunisia là rất nguy hiểm với liều gây chết 50% (LD50) dao động từ 3,52 x 104 và 2,29 x 106 cfu/g cá [17]. Các dấu hiệu bệnh Vibriosis ở cá cũng tƣơng tự nhƣ những bệnh khác do vi khuẩn gây ra. Bệnh thƣờng bắt đầu với các dấu hiệu là cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, xung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể. Đặc biệt xuất huyết lở loét trên mô da và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm. Gan, lá lách và thận bị xung huyết và thƣờng kèm theo sự hoại tử. Ruột, trực tràng có thể bị sƣng lên và có dịch nhờn trong suốt. Sự quan tâm ngày càng nhiều đối với nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp cho vấn đề dịch bệnh đƣợc hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ thống nuôi và vai trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh. Tuy nhiên, qua quá trình tồn tại và phát triển, các loài vi khuẩn gây bệnh đã có sự biến đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc này đã dẫn đến hiện tƣợng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của nghề nuôi thủy sản nói chung và nuôi cá biển nói riêng. 12 1.4.2.1 Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh của các loài Vibrio ở cá có điểm khác biệt so với giáp xác. Vì trong thành phần máu cá có các tế bào hồng cầu, đây là nguồn cung cấp Fe++ cho vi khuẩn Vibrio sống trên cơ thể cá. Khi cá nuôi có sức đề kháng tốt, các yếu tố môi trƣờng ổn định, các đại thực bào có thể tăng sinh mạnh và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Trong trƣờng hợp cá có vấn đề về sức khỏe và điều kiện môi trƣờng thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn, số lƣợng đại thực bào không đủ để tiêu diệt vi khuẩn thì chúng sẽ có cơ hội tấn công vào hệ cơ, mô và các bộ phận khác làm thƣơng tổn và ảnh hƣởng xấu tới chức năng của các cơ quan này. Vi khuẩn lấy ion Fe++ từ máu cá để hình thành enzyme protease phục vụ cho quá trình tổng hợp protein của chúng. Từ đó chúng sẽ gây hoại tử mô cá, dần dần hình thành các vết loét trên cơ thể, tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân cơ hội khác xâm nhập. 1.4.2.2 Đặc điểm dịch tễ Đặc điểm phân bố Địa lý: bệnh do vi khuẩn Vibrio có thể quan sát đƣợc ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nƣớc lợ và nƣớc mặn. Ký chủ: hầu nhƣ các loài động vật thủy sản nuôi nƣớc lợ, nƣớc mặn đều có thể bị nhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis. Giai đoạn phát triển: bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu niên, cơ thể trƣởng thành…Tuy nhiên, tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có thể gây nặng ở giai đoạn này và nhẹ hơn ở giai đoạn kia. Con đƣờng lan truyền: trong hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn xâm nhập vào ao theo một số con đƣờng: nguồn nƣớc, dụng cụ dùng, đàn giống, thức ăn tƣơi sống…[1] Mùa vụ xuất hiện Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểm nuôi. Vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 - 40 ppt, lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa nóng). Phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7 - 9. Trong bể ƣơng lƣợng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt. Mật độ vi khuẩn tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nƣớc thủy triều [1]. 13 Tác hại của bệnh Bệnh do Vibrio gây ra có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính. Trong trƣờng hợp cấp tính, tỉ lệ chết có thể là 100% . 1.4.3 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn gây ra Để hạn chế rủi ro và đạt hiệu quả cao trong nuôi trồng thủy sản thì phòng bệnh là việc làm hết sức cần thiết. Do động vật thủy sản sống trong nƣớc nên vấn đề phòng và trị bệnh không giống nhƣ gia súc, gia cầm trên cạn. Các biện pháp trị bệnh không mang lại hiệu quả cao do phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố. Vì vậy, trong nuôi trồng thủy sản vấn đề phòng bệnh đƣợc đặt lên hàng đầu và nguyên tắc là “phòng bệnh là chính, chữa bệnh khi cần thiết” [1]. Ngăn chặn sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh:  Xử lý nguồn nƣớc trƣớc khi đƣa vào ao nuôi  Sử dụng đàn bố mẹ và đàn giống không mang mầm bệnh  Sử dụng thức ăn không mang mầm bệnh  Tiêu diệt các tác nhân gây bệnh có sẵn trong ao nuôi  Kìm hãm sự phát triển của tác nhân gây bệnh  Ngăn chặn sự xâm nhập và tiêu diệt các sinh vật là ký chủ trung gian, là các sinh vật mang tác nhân gây bệnh. Quản lý môi trƣờng nuôi thích hợp và ổn định:  Thiết kế xây dựng trại nuôi phải phù hợp với điều kiện phòng bệnh cho động vật thủy sản  Chống ô nhiễm hữu cơ xảy ra trong ao nuôi  Áp dụng các mô hình nuôi ghép, nuôi luân canh và nuôi tổng hợp Tác nhân gây bệnh luôn luôn tồn tại trong ao nuôi do đó các biện pháp phòng bệnh chỉ giúp giảm nguy cơ mắc bệnh. Một khi gặp điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh sẽ phát triển và gây bệnh cho vật nuôi. Hiện nay biện pháp chủ yếu dùng để tiêu diệt vi khuẩn trong ao nuôi là sử dụng thuốc kháng sinh. Một số loại kháng sinh đƣợc dùng để tiêu diệt vi khuẩn nhƣ Enrofloxacin, Oxytetracyline, Sulfamethazine. 1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio Phần lớn các nghiên cứu về protein màng ngoài của vi khuẩn Vibrio là nhằm mục đích phát triển vaccine chống lại chính các chủng vi khuẩn này để phòng ngừa dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. 14 Theo kết quả phân tích thành phần protein màng của các chủng Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thƣơng phẩm ở Khánh Hòa [4] cho thấy thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus là tƣơng tự nhau với các band protein có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 106; 92; 75; 73; 68; 62; 55; 45; 38; 36; 32; 30; 27,5; 16,4 và 15,5 kDa. Một kết quả nghiên cứu khác của Koga T. và Kawata T. (1983) khi phân tích protein màng ngoài tách chiết từ Vibrio parahaemolyticus nuôi cấy trong môi trƣờng dinh dƣỡng bổ sung 3% NaCl cho thấy có 5 protein với trọng lƣợng phân tử gần đúng lần lƣợt là 44; 36; 33,5; 26,5 và 22 kDa [11]. Nghiên cứu của Ningqiu L. và cs (2008) đã đƣa ra kết luận là các protein màng ngoài của Vibrio harveyi, cụ thể là OmpK có một vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác giữa vi khuẩn và ký chủ và là một “ứng cử viên” tiềm năng để phát triển vaccine chống lại V. harveyi [14]. Zanal Abiddin và cs (2010) đã nghiên cứu phân tử và đặc tính kháng nguyên của hai loài Vibrio (V. fluvialis và V. mimicus) phân lập từ cá chẽm châu Á. Kết quả của nghiên cứu cho thấy đối với V. fluvialis, các kháng nguyên protein màng ngoài quan trọng nhất của tế bào có trọng lƣợng phân tử 50, 60 và 75 kDa. Trong khi đó, đối với V. mimicus là 40 và 80 kDa. Những protein kháng nguyên này có thể gây đáp ứng miễn dịch tốt trong sản xuất vaccine chống lại bệnh nhiễm trùng Vibrio [27]. VhhP2 là một protein màng ngoài của V. harveyi đƣợc phân lập từ cá bệnh. Khi đƣợc sử dụng nhƣ một loại vaccine tiểu đơn vị, VhhP2 tái tổ hợp cho thấy khả năng bảo vệ cao chống lại sự xâm nhiễm của V. harveyi. Khi cá đƣợc tiêm VhhP2 sẽ có những biểu hiện của một số gen liên quan đến miễn dịch, đặc biệt là những gen mã hóa immunoglobulin M (IgM) [19]. Một kết quả nghiên cứu của Poornima M. và cs (2013) đã cho thấy típ huyết thanh O2a và O2b của V. anguillarum là tác nhân chính gây bệnh cho cá chẽm và Vibrio anguillarum cũng là một trong những tác nhân chủ yếu gây ra bệnh Vibriosis trên cá chẽm [16]. Một nghiên cứu khác của Yu L. P. và cs (2013) đã xác định 13 protein màng ngoài của V. harveyi và phân tích khả năng gây đáp ứng miễn dịch của 13 loại protein này trên cá Bơn Nhật Bản. Kết quả cho thấy cả 13 loại protein màng của V. harveyi 15 đều gây ra đáp ứng miễn dịch. Trong đó, Omp173 và Omp214 là 2 Omp có thể sản xuất kháng huyết thanh với tỷ lệ sống trên 70% [26]. 1.6 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 1.6.1 Sơ lược về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phương pháp điện di trên gel polyacrylamide Điện di là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nó cho phép phân tách trọng lƣợng của các phân tử sinh học, từ đó ta có thể xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử của chúng. Vào khoảng thập niên 1930 phƣơng pháp điện di đầu tiên trên gel đƣợc biết đến. Raymond và Winstraub lần đầu tiên giới thiệu về gel polyacrylamide vào năm 1959. Ornstein và Osborn (1964) thực hiện điện di trên gel polyacrylamide không liên tục. Beber và Osborn (1969) đã giới thiệu về tác nhân gây biến tính protein là sodium dodecyl sulfate. Laemmli (1970) phát triển phƣơng pháp SDS - PAGE trong phân tách thành phần của T4 – phage [4]. 1.6.2 Gel polyacrylamide Acrylamide là một đơn phân tử có cấu trúc: CH2=CH-CO-NH2 và bisacrylamide có cấu trúc: CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2. Acrylamide là một độc tố thần kinh mạnh, khi hít phải sẽ làm mê mệt. Nó có khả năng thấm qua da khi tiếp xúc trực tiếp. Hiệu quả độc tố sẽ tích tụ dần. Vì vậy khi thực hiện làm thí nghiệm với acrylamide nên đeo khẩu trang và găng tay. Tuy nhiên ở dạng đã đƣợc polymer hóa thành polyacrylamide thì lại không độc. Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân tử acrylamide và N,N’- methylene-bis-acrylamide. Kích thƣớc lỗ gel phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polymer và mức độ polymer hóa. Gel polyacrylamide đƣợc mô tả qua 2 đặc điểm: %C và %T.  Tổng lƣợng đơn phân tử acrylamide chứa trong gel (% T) %T= ổ ể í  Lƣợng bis-acrylamide chứa trong gel (% C) % C= 16 Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi Ammoniumpersulfate (APS), N,N,N’,N’- tetramethylethylenediamine (TEMED). Sử dụng gel polyacrylamide chạy điện di thì việc chuẩn bị phức tạp hơn so với chạy điện di trên gel agarose. Sự di chuyển của các phân tử sinh học trên gel phụ thuộc vào kích thƣớc của lỗ gel, điện tích của phân tử cần phân tách và điện trƣờng. Giới hạn trọng lƣợng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: Nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại nếu nồng độ gel cao sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc nhỏ [4]. Hình 1.3. Quá trình polymer hóa của acrylamide [31] 1.6.3 Phương pháp điện di SDS-PAGE Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn đƣợc gọi là phƣơng pháp điện di trên gel acrylamide không liên tục và mẫu protein đƣợc gây biến tính (discontinuous and denaturing). SDS là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này, protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2-mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối sulfite (S-S) của protein. Vì vậy, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, dƣới tác động của điện trƣờng sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử 17 tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng tạo ra sự phân tách giữa các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau [12]. 1.6.4 Nhuộm gel sau khi điện di Sau khi điện di, để thấy đƣợc sự phân tách của các band protein trên gel chúng ta cần phải tiến hành nhuộm gel. Sự lựa chọn phƣơng pháp nhuộm gel đƣợc xác định trên nhiều yếu tố bao gồm độ nhạy, giải nhuộm, tính kinh tế, thiết bị nhuộm, thiết bị đọc sẵn có. Nhuộm bằng Coomassie Brillant Blue R-250 là phƣơng pháp nhuộm phổ biến nhất thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện protein trên gel polyacrylamide. Rất dễ phát hiện khi có khoảng 0,1 - 1 µg protein trên band. Dung dịch nhuộm bao gồm các thành phần: 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v), 40% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v). Tùy theo hàm lƣợng protein mà ta có thể thay đổi tỉ lệ thành phần các chất cũng nhƣ chất nhuộm Nếu trên gel chứa polypeptide có trọng lƣợng phân tử thấp thì ta có thể nhuộm trong hỗn hợp dung dịch: 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v), 40% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v) khoảng một giờ. Ngoài ra chúng cũng có thể đƣợc nhuộm với 0,025% Coomassie Brilliant Blue G-250 (w/v) trong methanol và acid acetic từ 12 giờ [8]. 1.6.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide Hệ đệm điện di và các tác nhân gây biến tính protein Hệ đệm quyết định nhu cầu về năng lƣợng và ảnh hƣởng đến sự phân tách protein. Hệ đệm bao gồm đệm dùng để pha gel và đệm dùng để chạy điện di. Hệ đệm của gel không liên tục đầu tiên đƣợc phát triển bởi Ornstein (1964) và Davis (1964) và đã đƣợc ứng dụng để phân tách protein nguyên thể, tức là những protein chƣa bị biến tính. Hệ đệm mà các nhà khoa học sử dụng gồm 4 yếu tố: gel gom dùng đệm Tris HCl pH 6,8; gel phân tác dùng đệm Tris - HCl pH 8,8; đệm điện di Tris - glycine pH 8,3; mẫu cần phân tách dùng đệm Tris - HCl pH 6,8. Nhƣng với hệ đệm đƣợc sử dụng nhƣ vậy thì trong mô hình này, không thể tiến hành phân tách đƣợc một khoảng rộng về trọng lƣợng protein. Dựa trên mô hình và hệ đệm của Ornstein và Davis, Laemmli đã phát triển trong việc sử dụng thêm tác nhân khử cầu nối disulfite và SDS. Nhờ đó, việc phân tách protein trên gel chỉ phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử của protein. Do đó, việc phân tách protein trở nên dễ thực hiện hơn và không bị phụ thuộc vào điện tích của các phân 18 tử sinh học. Tuy nhiên mô hình của ông cũng gặp một số khó khăn. Nhiều protein không đƣợc phân tách theo mong muốn khi sử dụng SDS-PAGE. Hiện tƣợng này xảy ra là do: cấu trúc disulfite của protein không bị tác động, và protein không bị âm tính hóa bão hòa bởi SDS; những glycoprotein và lypoprotein trong mẫu không bị âm tính hóa bão hòa bởi SDS, bởi vì thành phần không phải protein của chúng không tƣơng tác với SDS [6]. Điều kiện năng lƣợng Năng lƣợng cung cấp trong điện di là điện năng. Có rất nhiều thiết bị nguồn điện khác nhau đƣợc sản xuất phục vụ cho điện di. Một số thiết bị cho phép chạy tự động sau khi ta chỉnh các thông số mong muốn và cũng có một số thiết bị đòi hỏi phải có sự giám sát về thời gian. Giới hạn chính của các mô hình điện di là khả năng làm thất thoát năng lƣợng khi điện năng chuyển hóa thành năng lƣợng điện trƣờng. Theo Wooolley (1987) thì sự thất thoát là do một phần năng lƣợng đã đƣợc chuyển hóa thành nhiệt năng. Nhiệt năng này có thể gây ra một số ảnh hƣởng xấu đến kết quả điện di nhƣ: band protein bị méo, cong, tăng sự khuếch tán, sự hoạt động trở lại của enzyme trong mẫu, sự biến tính protein. Do đó một thiết bị điện di tốt phải đảm bảo đƣợc sự chuyển nhiệt từ gel ra môi trƣờng ngoài. Thông thƣờng, điện di nên chỉnh hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện sao cho quá trình điện di xảy ra nhanh chóng mà vẫn đảm bảo đƣợc sự phân tách protein mẫu [6]. 19 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu  Thời gian thực hiện đề tài: từ ngày 02/02/2015 đến ngày 07/06/2015.  Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Thí nghiệm – Thực hành, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang. 2.2 Vật liệu nghiên cứu Cá chẽm (Lates calcarifer) có các dấu hiệu bệnh lý do vi khuẩn Vibrio gây ra: xung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể, đặc biệt xuất huyết lở loét trên mô da và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm đƣợc thu từ các trại giống và lồng nuôi trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa. 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Phân lập các chủng vi khuẩn Vibrio từ cá chẽm Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập đƣợc Tách chiết protein màng của các chủng phân lập đƣợc Phân và so củacứu các Hình tích 2.1 Sơ đồ sánh khối protein nội dungmàng nghiên chủng bằng phƣơng pháp SDS - PAGE Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn a. Dụng cụ và hóa chất  Thiết bị và dụng cụ: tủ ấm, nồi hấp, tủ sấy, que cấy đầu tròn, bông, kéo, pank, túi nylon, đĩa petri.  Hóa chất và môi trƣờng: môi trƣờng tổng hợp bổ sung 2% NaCl (TSA, TSB, NA, NB), TCBS, Ethanol. b. Thu mẫu Cá chẽm đƣợc nuôi ở các trang trại Australis (Ninh Hòa), Marine (Vạn Ninh) có dấu hiệu bệnh lý do vi khuẩn Vibrio gây ra: xung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể, đặc biệt xuất huyết lở loét trên mô da và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm… đƣợc vớt bằng vợt và chứa trong thùng xốp hoặc túi nylon có sục khí. Mẫu đƣợc vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm để phân tích. c. Phân lập vi khuẩn Các thông tin của mẫu cá phân lập nhƣ: kích thƣớc, cân nặng, ngày tuổi, nơi thu mẫu và các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài đƣợc ghi lại. Sử dụng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và lau sạch để tránh sự tạp nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài. Dùng dao đã tiệt trùng mở khoang bụng cá. Dùng que cấy vòng lấy mẫu bệnh phẩm từ gan và thận cấy lên môi trƣờng NA (bổ sung 2% NaCl) và môi trƣờng TCBS. Ủ đĩa trong tủ ấm ở 37oC. Sau 24 - 48h, quan sát các đĩa thạch, ghi nhận màu sắc, hình dạng và kích thƣớc khuẩn lạc. Các khuẩn lạc rời tiếp tục đƣợc cấy chuyền cho đến khi đạt đĩa cấy thuần [3]. 2.4.2 Định danh vi khuẩn a. Dụng cụ và hóa chất  Thiết bị và dụng cụ: box cấy, nồi hấp, tủ lạnh, kính hiển vi, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, lam kính, micropippet.  Hóa chất và môi trƣờng: kit API-20E để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng, giấy tẩm Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử phản ứng Oxidase, H2O2 để thử phản ứng catalase, hóa chất nhuộm Gram, môi trƣờng tổng hợp bổ sung 2% NaCl (TSA, TSB, NA, NB). 21 b. Phƣơng pháp tiến hành Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm Gram. Các chủng vi khuẩn Gram âm sẽ đƣợc tiếp tục kiểm tra bằng hai phản ứng catalase và oxidase. Để kiểm tra hoạt tính catalase của vi khuẩn, nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạc đƣợc đặt sẵn trên lam kính. Để kiểm tra hoạt tính oxidase của vi khuẩn, dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc của vi khuẩn miết lên miếng giấy đã tẩm sẵn thuốc thử oxidase (Tetramethyl-pphenylenediamine hydrochloride). Các chủng vi khuẩn Gram âm, hình que, dƣơng tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ đƣợc phân lập lại trên môi trƣờng TCBS nhằm thu đƣợc chủng vi khuẩn thuần khiết. Các chủng này đƣợc lƣu giữ trên thạch nghiêng TSA (2% NaCl) ở 4oC để định danh bằng kit API-20E hoặc ở -80oC trong môi trƣờng TSB bổ sung 2% NaCl và 20% glycerol để giữ chủng. 2.4.3 Phương pháp tách chiết protein màng của vi khuẩn a. Dụng cụ và hóa chất  Thiết bị và dụng cụ: máy ly tâm lạnh, bể ổn nhiệt, máy đo OD, eppendorf, micropipette  Hóa chất: Đệm ly giải (50 mM Tris-HCl pH 7,9; 50 mM EDTA; 15% (w/v) sucrose, và lysozyme (nồng độ cuối cùng 0,5 mg / ml), N-lauroylsarcosine 1% b. Nguyên tắc Dƣới tác dụng của lysozyme và quá trình ly tâm trong môi trƣờng đệm ly giải, màng tế bào sẽ bị phá vỡ đồng thời giải phóng các protein của tế bào. Quá trình ly lâm lần hai sẽ loại bỏ các protein hòa tan trong dịch tách chiết. Cặn thu đƣợc sẽ chứa các phân đoạn protein màng của tế bào. c. Quy trình tách chiết protein màng vi khuẩn [21]  Cấy ria lại các chủng vi khuẩn đã phân lập đƣợc trên đĩa thạch NA bổ sung 2% NaCl ở 37oC trong 24h  Lấy khuẩn lạc đơn nuôi tăng sinh trong 10ml môi trƣờng NB bổ sung 2% NaCl lắc ở 160 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24h  Hút 0,5 ml dịch vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa sẵn 0,5 ml PBS  Tiến hành ly tâm thu cặn tế bào ở 8000 vòng/phút trong 15 phút 22  Hòa cặn trong 0,5 ml đệm ly giải lạnh chứa: 50 mM Tris-HCl (pH 7,9); 50 mM EDTA; 15% (w/v) sucrose và lysozyme (nồng độ cuối cùng là 0,5 mg/ml)  Ủ mẫu trên đá lạnh 30 phút  Ly tâm thu cặn ở 8000 vòng/phút trong 15 phút  Hòa cặn trong 1ml N-lauroylsarcosine 1% (lạnh)  Ly tâm thu dịch ở 8000 vòng/phút trong 15 phút  Đo OD xác định hàm lƣợng protein 2.4.4 Phương pháp điện di SDS - PAGE a. Dụng cụ và hóa chất  Thiết bị và dụng cụ : Thiết bị điện di protein (hình 2.2), máy ly tâm nhỏ, bể ổn nhiệt, máy đo OD, micropippet, đầu típ, cuvette, eppendorf.  Hóa chất : Monomer solution, 4X Resolving gel buffer, 4X Stacking gel buffer, SDS, Ammonium Persulfate, 2X treatment buffer, Tank buffer, TEMED, protein thang chuẩn, dung dịch nhuộm và rửa gel. Hình 2.2. Bộ điện di SDS-PAGE (Bio-Rad) b. Nguyên tắc SDS là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này, protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối sulfite (S - S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, dƣới tác 23 động của điện trƣờng sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng. Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (Stacking gel): Thông thƣờng lớp gel này có nồng độ gel thấp vào khoảng 4 - 5%, và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu. Khi có tác động của điện trƣờng các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này. Nhờ đó, các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein. Lớp gel phân tách (Resolving gel) (lớp dƣới): Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel gom, và nằm phía dƣới. Có tác dụng chính trong việc tạo ra các band protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu [6]. Hình 2.3. Mô hình điện di SDS-PAGE [31] Kĩ thuật SDS - PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 - 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 Daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide nhỏ hơn 2,5%. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS - PAGE phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của protein mục tiêu trong mẫu nhƣ bảng 2.1 [28]: 24 Bảng 2.1. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS – PAGE và phạm vi phân tách protein Acrylamide (%) Protein mục tiêu (kDa) 7% 50 kDa – 500 kDa 10 % 20 kDa – 300 kDa 12 % 10 kDa – 200 kDa 15 % 3 kDa – 100 kDa c. Phƣơng pháp tiến hành  Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di  Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất  Lau các tấm kính bằng nƣớc cất, gắn vào giá đỡ  Lắp ráp các khuôn đổ gel theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.  Pha dung dịch Resolving gel 15%. Tải nhanh gel vào khuôn bằng micropippet 1ml một cách nhẹ nhàng (khoảng 4 - 5 ml/khuôn). Tải nƣớc cất hai lần lên lớp Resolving gel (giúp tránh tình trạng gel đông không tốt do bị oxi hóa và giúp bề mặt trơn láng). Đợi gel đông khoảng 30 - 45 phút.  Trong khi đợi Resolving gel trùng hợp tiến hành pha Stacking gel 5% acrylamide. Khi Resolving gel trùng hợp hoàn toàn, cho tiếp Stacking gel vào khuôn điện di cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lƣợc và để khoảng 30 - 45 phút.  Sau khi Stacking gel trùng hợp hoàn toàn, rút lƣợc nhẹ nhàng ra khỏi gel. Rửa sạch các giếng gel bằng Tank buffer. Sau đó, ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy Tank buffer vào hai máng trên và dƣới của buồng điện di để chuẩn bị cho điện di [3]. Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch điện di protein [28] Gel gom 5% Gel phân tách 15% (Stacking gel) (Resolving gel) Nƣớc cất 6,2 ml 3,6 ml Monomer solution 40% 1,3 ml 3,8 ml 4X Resolving gel buffer (pH 8,8) - 2,5 ml 4X Stacking gel buffer (pH 6,8) 2,5 ml - SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml APS 10% 50 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl Thành phần 25  Chuẩn bị mẫu để điện di  Lƣợng mẫu thích hợp để tải vào mỗi giếng trong SDS-PAGE là 50 µg/giếng.  Dịch protein đƣợc hòa tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu 5X - Treatment buffer (tỉ lệ 4:1) trong eppendorf. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi trong 5 - 10 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong đƣợc giữ trong đá bào đến khi sử dụng.  Dùng micropippet hút trộn đều mẫu và tải mẫu từ từ vào giếng gel.  Chạy điện di  Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cắp điện  Bật điện bộ nguồn, chỉnh cƣờng độ dòng điện ở mức 15 mA.  Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di đến khi vạch màu đến gần đáy của gel (khoảng 1,5 - 2 giờ).  Nhuộm gel và rửa gel  Lấy gel ra khỏi tấm kính  Ngâm gel trong thuốc nhuộm protein, lắc nhẹ cho đến khi thuốc nhuộm ngấm vào gel, thời gian ngâm từ 1 - 4 giờ hoặc ngâm qua đêm.  Chuyển gel sang ngâm trong dung dịch rửa màu. Thay dung dịch rửa mới vài lần cho đến khi gel có màu trong suốt, lúc này sẽ thấy xuất hiện những vạch màu xanh lơ trên gel. 2.4.5 Phương pháp Bradford a. Dụng cụ và hóa chất  Dụng cụ và thiết bị: ống nghiệm, pipette, micropipette, cuvette, bình tia  Môi trƣờng và hóa chất: dung dịch chuẩn Bovine Serum Albumine, H3PO4 85%, Coomassie Brilliant Blue G-250, Ethanol 96%. b. Nguyên tắc Nguyên tắc của phƣơng pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250. Thuốc nhuộm này khi phản ứng với protein sẽ tạo màu xanh và làm thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại từ 465 nm sang 595 nm của phức thuốc nhuộm - protein. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm cũng nhƣ cƣờng độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch [3]. c. Dựng đƣờng chuẩn BSA Pha loãng dung dịch BSA (100 µg/ml) theo bảng 2.3 26 Bảng 2.3. Nồng độ dung dịch BSA (µg/ml) Ống Dung dịch BSA (µl) Nƣớc cất (µl) Nồng độ BSA (µg/ml) ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hút 5 ml dung dịch thuốc thử Bradford lần lƣợt cho vào các ống có chứa 1ml dịch protein vừa pha ở trên, lắc đều. Sau 20 phút đem đo dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm. Tại mỗi nồng độ sẽ tiến hành đo 2 - 3 lần và xác định giá trị OD trung bình. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (µg/ml). d. Xác định nồng độ protein bằng phƣơng pháp Bradford  Pha loãng dịch tách chiết protein đến nồng độ thích hợp để đo OD  Hút 1ml dịch protein đã pha loãng và thêm vào đó 5 ml thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bƣớc sóng 595 nm. Với mỗi mẫu đƣợc thực hiện 2 - 3 lần, lấy giá trị OD trung bình. Từ đƣờng chuẩn có đƣợc suy ra nồng độ protein trong mẫu phân tích nhƣ sau: Nồng độ protein của mẫu = nồng độ tính toán * độ pha loãng 2.4.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu  Microsoft Word đƣợc sử dụng để đánh văn bản  Microsoft Excel đƣợc sử dụng để phân tích, xử lý số liệu và vẽ đồ thị 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm 3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ mẫu cá chẽm (Lates calcarifer) có dấu hiệu bệnh lý Vibriosis. Trên môi trƣờng TCBS, sau 24h, ở 37oC vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc (hình 3.1) với các đặc điểm đƣợc mô tả trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Đặc điểm NH1 Hình dáng Tròn Trơn Lồi, tâm Bề mặt nhô 1,5 Kích thƣớc (mm) Bóng Cảm quan mịn Xanh Màu sắc Bờ khuẩn lạc NT1 Vòng không đều Nhăn NH2 Lồi Lồi 1,5 Bóng mịn Vàng 0,5 Bóng mịn Vàng Tròn Trơn VN1 VN2 NH3 NH4 Vòng Vòng Vòng không không Tròn không đều đều đều Nhăn Nhăn Trơn Nhăn Lồi, tâm Lồi, tâm Lồi, tâm Lồi nhô nhô nhô 0,5 3 2 2 Bóng Bóng Bóng Bóng mịn mịn mịn mịn Vàng Vàng Vàng Xanh Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường TCBS Các khuẩn lạc rời trên môi trƣờng TCBS (hình 3.1) đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng NA bổ sung 2% NaCl (hình 3.2) để xác định các đặc điểm sinh hóa. 28 Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường NA bổ sung 2% NaCl 3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu đƣợc (hình 3.3) cho thấy chúng có dạng hình que thẳng hoặc hơi uốn cong và bắt màu đỏ hồng đặc trƣng của nhóm vi khuẩn Gram âm. Những đặc điểm này đều giống với đặc điểm của các chủng vi khuẩn đã đƣợc công bố [1], [24]. Hình 3.3. Nhuộm Gram vi khuẩn Để định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, ngoài các đặc điểm về hình thái cần tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa. Đặc điểm sinh hóa của các chủng đƣợc xác định bằng một số thử nghiệm sinh hóa và kit định danh API-20E. Hai phản ứng catalase và oxidase đƣợc tiến hành kiểm tra trên các đĩa khuẩn lạc thuần. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994), chỉ những chủng cho kết quả 29 dƣơng tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase mới đƣợc giữ lại để tiếp tục kiểm tra các đặc điểm sinh hóa. Bảng 3.2. Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm Đặc điểm Chủng vi khuẩn NH1 NT1 NH2 VN1 VN2 NH3 NH4 Nhuộm Gram - - - - - - - Hình dạng tế bào Que Que Que Que Que Que Que Di động + + + + + + + TCBS G Y Y Y Y Y G Sinh catalase + + + + + + + Sinh oxidase + + + + + + + Sinh β - galactosidase - + + + + - + Arginine - - + + + - - Lysine + + - - + + + Ornithine + - - - - - + Sử dụng Citrate - - + + + + - Sinh H2S - - - - - - - Sinh Urease - - - - - - - Tryptophan Deaminase - - - - - - - Sinh Indole + + + + + + + Voges-Proskauer - + + + - - - Gelatinaza + + + + - - + D-Glucose + - + + + + + D-Mannitol + + - + + - + Inositol - - - + - + - D-Sorbitol - - + - - + - L-Rhamnose - - + + - - - Sucrose - + + + + + - Melibiose - - - - - + - Amygdaline + + - - + + + L-Arabinnose - - - + - + - NO2 + + + + + + Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính; Y= màu vàng; G= Màu xanh + 30 Qua bảng 3.3 cho thấy, các vi khuẩn phân lập đƣợc là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, phản ứng dƣơng tính với oxidase và catalase. Tất cả đều phát triển trên môi trƣờng TCBS, không sinh H2S, Urease và Tryptophan Deaminase. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập bằng kit định danh API-20E và phần mềm ABIS trực tuyến [30] cho thấy các chủng có đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng cao với các chủng vi khuẩn Vibrio đã đƣợc công bố. Cụ thể nhƣ sau: NH1 tƣơng đồng với V. mimicus (92%), NH2 tƣơng đồng với V. anguillarum (91%), NH3 tƣơng đồng với V. harveyi (76%), NH4 tƣơng đồng với V. parahaemolyticus (94%), NT1 tƣơng đồng với V. alginolyticus (81%), VN1 tƣơng đồng với V. anguillarum (79%) và VN2 tƣơng đồng với V. diazotrophicus (86%). Khi so sánh kết quả định danh sinh hóa của chủng NT1 với chủng V. alginolyticus đƣợc phân lập từ cá chẽm nuôi lồng bè thƣơng phẩm bị lở loét tại Khánh Hòa [4], chúng tôi nhận thấy có sự tƣơng đồng cao. Tuy nhiên vẫn có những khác biệt ở một số đặc điểm sinh hóa: sinh β - galactosidase, sử dụng citrate, phản ứng VogesProskauer, sinh gelatinase và sử dụng sorbitol. Theo những kết quả định danh sinh hóa V. alginolyticus đã công bố thì vẫn có những khác biệt ở một vài đặc điểm sinh hóa tùy theo từng chủng cụ thể. Một so sánh khác cũng cho thấy sự tƣơng đồng rất cao giữa chủng NH4 với V. parahaemolyticus đƣợc phân lập từ cá bớp bị lở loét tại trại thực nghiệm nƣớc lợ Khoa Thủy Sản – Đại học Cần Thơ khi giữa hai chủng chỉ khác nhau ở thử nghiệm sinh β - galactosidase [5]. Khi so sánh kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phần mềm ABIS trực tuyến và khóa phân loại Bergey (1994) dựa vào một số đặc điểm sinh hóa đã đƣợc xác định bằng kit định danh API-20E, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt ở một số đặc điểm sinh hóa nhất định: chủng VN2 khi định danh bằng kít API-20E cho kết dƣơng tính với Glucose và âm tính với Arabinose nhƣng khi định danh theo khóa phân loại Bergey thì VN2 âm tính với Glucose và dƣơng tính với Arabinose. Tuy có sự khác biệt giữa hai phƣơng pháp ở một số đặc điểm sinh hóa nhƣng kết quả của hai phƣơng pháp vẫn khẳng định sự tƣơng đồng cao của các chủng Vibrio phân lập đƣợc với các chủng Vibrio đã đƣợc công bố. 31 3.2 Kết quả xác định protein màng của các chủng vi khuẩn Vibrio theo phƣơng pháp điện di SDS - PAGE Để xác định thành phần protein màng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành phƣơng pháp điện di SDS - PAGE. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.4: VN1 NH2 NH1 M M NT1 VN2 NH3 NH4 175 kDa 80 kDa 58 kDa 46 kDa 30 kDa Hình 3.4. Kết quả phân tích protein màng của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bằng phương pháp SDS-PAGE Kết quả hình 3.4 cho thấy thành phần protein của 7 chủng phân lập có sự tƣơng đồng rất cao. Tất cả các chủng đều xuất hiện các band protein có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 40 kDa. Đa số các chủng xuất hiện các band 160, 150, 62, 52, 38, 35, 31 kDa. Bên cạnh những band tƣơng đồng thì cũng có một số band khác biệt giữa các chủng. Band 58 kDa bắt màu rất đậm chỉ xuất hiện ở chủng NH1 và band 36 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH3. Hai chủng NH2 và VN1 không xuất hiện 2 band protein ở vị trí 160 và 150 kDa. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 52, 48, 43, 38 và 35 kDa là phổ biến ở 5/7 chủng, trong đó có chủng NH3 (nghi ngờ là V.harveyi). Kết quả này có tính tƣơng đồng cao với nghiên cứu của Yingxue Q. và cs (2007) khi phân tích kháng nguyên của vi khuẩn V.harveyi, chủng TS-628 cho thấy có 5 band protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 52, 47, 43, 38, 35 kDa [25]. Một nghiên 32 cứu khác của Wang Q. và cs (2011) khi xác định và đánh giá khả năng sản xuất vaccine của một protein màng OmpU từ V. harveyi cho thấy protein màng OmpU có trọng lƣợng phân tử 35 kDa có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao ở cá bơn [21]. Đây có thể là một ứng cử viên cho việc phát triển vaccine hay kháng thể chống lại nhiều chủng Vibrio. Kết quả điện di SDS - PAGE chủng NT1 (nghi ngờ là V. alginolyticus) của chúng tôi cho thấy có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thoa và cs (2011) khi xác định thành phần protein của các chủng vi khuẩn V. alginolyticus phân lập từ cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa ở các band protein khoảng 75, 68, 62, 55, 38, 32 kDa [4]. Chủng NT1 cũng cho kết quả tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Ding và cs (2011) khi họ kết luận protein có khối lƣợng phân tử 47 và 38 kDa là phổ biển trong thành phần Omp của V.alginolyticus [9]. Một nghiên cứu của Ningqiu Li và cs (2010) đã cho thấy OmpK có trọng lƣợng phân tử trong khoảng 28 - 31 kDa là phổ biến ở các loài Vibrio [15]. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy sự tƣơng đồng cao với kết quả của nghiên cứu này khi có 6/7 chủng là VN1, NH1, NT1, VN2, NH3, NH4 có band protein ở vị trí khoảng 31 kDa. Nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy chủng NH3 có xuất hiện 1 band protein ở vị trí khoảng 38 kDa. Kết quả này có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của Wang SY và cs (2003) khi phân tích vai trò của protein màng ngoài của V. anguillarum trong kháng mật và hình thành màng sinh học. Họ đã xác định một Omp đƣợc tổng hợp với một lƣợng lớn có trọng lƣợng phân tử 38 kDa [22]. Tuy nhiên, trong kết quả của chúng tôi, band này còn xuất hiện ở NH1, NT1, VN2 và NH4. Protein này có thể là một ứng cử viên cho sản xuất vaccine chống lại V. mimicus, V. alginolyticus, V. diazotrophicus và V. parahaemolyticus. Một kết quả khác trong nghiên cứu của chúng tôi là chủng NH1 xuất hiện một band protein khoảng 58 kDa với cƣờng độ màu rất đậm. Band này cũng xuất hiện ở NH3 và VN2 nhƣng bắt màu rất nhạt. Trong phạm vi tìm hiểu của chúng tôi thì chƣa thấy kết quả này tƣơng đồng với các báo cáo về protein màng của V. mimicus đã đƣợc công bố. Do đó, chúng tôi cần có những nghiên cứu sâu hơn trƣớc khi đƣa ra kết luận về protein này. Khi quan sát kết quả SDS - PAGE của chủng NH3 (nghi ngờ là V. harveyi), chúng tôi nhận thấy có một band protein khoảng 36 kDa bắt màu tƣơng đối đậm và 33 không xuất hiện ở các chủng còn lại. Kết quả này có sự khác biệt lớn với kết quả nghiên cứu của Tang Xiao-Qian và cs (2009) khi họ kết luận Omp 36 kDa là phổ biến ở 6 loài: V. anguillarum, V. ichthyoenteri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi và V. vulnificus [20]. Một nghiên cứu khác của Wei-ni Z và cs (2008) cũng khẳng định Omp 36 kDa đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu nhận dạng cho các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio [23]. Sự khác biệt này có thể do sự phân tách protein chƣa tốt trong thí nghiệm của chúng tôi hoặc do chƣa xác định rõ ràng giữa band 36 và 35 kDa. Chúng tôi cần thực hiện một số nghiên cứu tiếp theo mới có thể đƣa ra kết luận về protein này. Nhìn chung thành phần protein màng của các chủng phân lập có tính tƣơng đồng rất cao. Có nhiều band xuất hiện ở tất cả hoặc đa số các chủng với sự sai khác cƣờng độ màu không đáng kể nhƣ các band 80, 78, 52, 43, 38, 35 và 31 kDa. Với kết quả này, một phần nào đó có thể cho thấy triển vọng lớn trong việc phát triển một loại vaccine từ protein màng chống lại nhiều chủng Vibrio hay ít nhất là 7 chủng mà chúng tôi đã phân lập đƣợc hoặc cũng có thể tách chiết các protein này để làm kháng nguyên sản xuất kháng thể tăng sức đề kháng với Vibrio cho động vật thủy sản. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận  Đã phân lập, định danh sinh hóa và lƣu giữ đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa gồm: NH1, NH2, NH3, NH4, VN1, VN2, NT1 có các đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng cao với các chủng tƣơng ứng là: V. mimicus, V. anguillarum, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. diazotrophicus và V. alginolyticus.  Thành phần protein màng của 7 chủng có sự tƣơng đồng rất cao ở các band protein có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 52, 46, 43, 40, 38, 35 và 31 kDa. Tuy nhiên, vẫn có một số khác biệt ở một vài band có khối lƣợng phân tử khoảng 160, 150, 58, 36 kDa. 2 Kiến nghị  Định danh di truyền các chủng vi khuẩn đã phân lập để xác định chính xác từng chủng vi khuẩn.  Khảo sát các phƣơng pháp tách chiết protein màng để thu đƣợc protein màng tinh khiết với hàm lƣợng cao hơn.  Nghiên cứu so sánh protein màng giữa các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bệnh với các chủng Vibrio chuẩn để kết quả tin cậy hơn.  Nghiên cứu tách chiết những protein màng có tiềm năng nhƣ protein 78, 43, 38 và 31 kDa để làm vaccine hoặc làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể trong phòng trị bệnh cho thủy sản. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 2. Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008). Các loại bệnh thƣờng gặp trên cá biển nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trƣờng Đại học Nha Trang, trang 16 - 24. 3. Ngô Thị Giang (2013). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm. Đồ án Đại học, Trƣờng Đại học Nha Trang. 4. Nguyễn Thị Thoa (2011). Độc lực và thành phần protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Nha Trang. 5. Nguyễn Thị Thúy An (2013). Phân lập vi khuẩn Vibrio trên cá bớp (Rachycentron canadum) bị lở loét. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Cần Thơ. 6. Viên Đại Phúc (2011). Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hòa. Tài liệu tiếng Anh 7. Austin B., Zhang X. H. (2006). Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates. Lett Appl Microbiology, 43(2): 119-124. 8. Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254. 9. Ding T., Tian-long L., Bin-fu X. (2011). Comparative Characteristics of Outer Membrane Proteins in Bacteria V. vulnificus and V. alginolyticus. Fisheries Science (Biotechnology Institute, the Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China). 10. Holt J. G., N.R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (1994). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition. William & Wilkins. 11. Koqa T., Kawata T. (1983). Isolation and characterization of the outer membrane from Vibrio parahaemolyticus. Journal of General Microbiology, 129(10): 3185-3196. 36 12. Laemmli U. K. (1970). Cleavage of structural protein during the assembly of the head of Bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685. 13. McCarter L. L., Silverman M. (1987). Phosphate regulation of gene expression in Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, 169(8): 3441-3449. 14. Ningqiu L., Junjie B., Shuqin W., Xiaozhe F., Haihua L., Xing Y., Cunbin S. (2008). An outer membrane protein, OmpK, is an effective vaccine candidate for Vibrio harveyi in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Fish Shellfish Immunology, 25(6): 829-833. 15. Ningqiu L., Zhihui Y., Junjie B., Xiaozhe F., Lihui L., Cunbin S., Shuqin W. (2010). A shared antigen among Vibrio species: outer membrane protein-OmpK as a versatile sis vaccine candidate in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Fish & Shellfish Immunology, 28(5): 952-956. 16. Poornima M., Vijaya Kumar R., Santiago T. C., Arasu, A. R. T. (2013). Recombinant outer membrane protein, Omp26la of Vibrio anguillarum is an effective vaccine candidate. Journal of Aquatic Biology and Fisheries, 2, pp. 436-440. 17. Sadok Khouadja, Faouzi Lamari, Amina Bakhrouf (2013). Characterization of Vibrio parahaemolyticus isolated from farmed sea bass (Dicentrarchus labrax ) during disease outbreaks. International Aquatic Research, 5(1): 13. 18. Sobhana, K. S. (2009). Diseases of seabass in cage culture and control measures. National training on cage culture of seabass, pp. 87-93. 19. Sun K., Zhang W. W., Hou J. H., Sun L. (2009). Immunoprotective analysis of VhhP2, a Vibrio harveyi vaccine candidate. Vaccine, 27(21): 2733-2740. 20. Tang Xiao-Qian, Zhan Wen-Bin, Zhou Li, Sheng Xiu-Zhen (2009). Characterization of 36 kDa Outer Membrane Proteins of Six Pathogenic Species. Periodical of Ocean University of China (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China). 21. Wang Q., Chen J., Liu R., Jia J. (2011). Identification and evaluation of an outer membrane protein OmpU from a pathogenic Vibrio harveyi isolate as vaccine candidate in turbot (Scophthalmus maximus). Letter Appl Microbiology, 53(1): 22-29. 37 22. Wang S. Y., Lauritz J., Jass J., Milton D. L. (2003). Role for the major outermembrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation. Microbiology, 149(4): 1061-1071. 23. Wei-ni Z., Li Z., Jing X., Wen-bin Z. (2008). Structural comparison of major outer membrane proteins of aquatic animal Vibrio sp. Marine Fisheries Research (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China). 24. West P. A., Brayton P. R., Bryant T. N., Colwell R. R. (1986). Numerical Taxonomy of Vibrios Isolated from Aquatic Environments. International Journal Of Systematic Bacteriology, 36: 531-543. 25. Yingxue Q, Jun W, Shifeng W, Qingpi Y (2007). Antigenicity analysis of Vibrio harveyi TS-628 strain. Frontiers of Biology in China, 2(3): 263-267. 26. Yu L. P., Hu Y. H., Sun B. G., Sun L. (2013). Immunological study of the outer membrane proteins of Vibrio harveyi: insights that link immunoprotectivity to interference with bacterial infection. Fish & Shellfish Immunology, 35(4): 1293-1300. 27. Zanal Abiddin, Siti Zubaidah and Mohd Yusoff, Sabri Md, Shamsudin, Shahirudin (2010). Molecular and antigenicity characterisation of sp. isolates from Asian seabass (Lates Calcarifer), 5th Proceedings of the Seminar on Veterinary Sciences. Serdang, Selangor, 5-8 January 2010. University Putra Malaysia. Tài liệu internet 28. http://www.assay-protocol.com/molecular-biology/electrophoresis/denaturing-page 29. http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en 30. http://www.tgw1916.net/bacteria_.html 31. https://www.lifetechnologies.com PHỤ LỤC A Dựng đƣờng chuẩn Albumin (BSA) và xác định hàm lƣợng protein trong dịch tách chiết. 1. Bảng kết quả đo OD595 cho BSA chuẩn Lần 1 Kết quả OD595 Lần 2 0 1,330 10 Nồng độ BSA (µg/ml) Lần 3 Trung bình OD ΔOD 1,328 1,342 1,333 0,000 1,361 1,361 1,361 1,361 0,028 20 1,391 1,394 1,405 1,396 0,063 30 1,433 1,420 1,444 1,432 0,099 40 1,467 1,452 1,473 1,464 0,131 50 1,498 1,487 1,487 1,490 0,157 60 1,517 1,528 1,528 1,524 0,191 70 1,538 1,522 1,546 1,535 0,202 80 1,551 1,553 1,551 1,551 0,218 90 1,612 1,601 1,627 1,613 0,280 100 1,660 1,665 1,637 1,654 0,321 2. Đồ thị đƣờng chuẩn BSA với OD595 Đồ thị đƣờng chuẩn BSA 0.35 0.3 0.25 OD 0.2 y = 0,003x + 0,001 R² = 0,987 0.15 0.1 0.05 0 0 50 100 Nồng độ protein (µg/ml) 150 3. Bảng kết quả đo OD xác định hàm lƣợng protein màng với OD595 Kết quả OD595 OD Trung bình ΔOD 1,197 1,184 0 1,872 1,793 1,832 0,648 NT1 1,433 1,526 1,479 0,295 NH2 1,485 1,945 1,715 0,531 VN1 2,033 2,016 2,024 0,840 VN2 1,441 1,561 1,501 0,317 NH3 1,954 1,931 1,942 0,758 NH4 1,642 1,755 1,698 0,514 Chủng Lần 1 Lần 2 ĐC 1,171 NH1 PHỤ LỤC B Cách pha các dung dịch hóa chất cho nghiên cứu 1. Monomere solution( 40%) Acrylamide (FW 71,08) : 10g Bis-acrylamide (FW 154,2) : 0,2g Nƣớc cất cho đến 25ml Giữ đƣợc 3 tháng trong tối ở 4oC (Acrylamide là chất độc thần kinh, khi thao tác phải cẩn thận) 2. 4X Resolving gel buffer (0,5M Tris HCl, pH 8,8) Tris base (FW 121,1) : 1,815g Nƣớc cất thêm 7,5ml Chỉnh pH 8,8 với HCl đậm đặc Thêm nƣớc cất đến 10ml Giữ đƣợc 3 tháng trong tối ở 4oC 3. 4X Stacking gel buffer (0,5 Tris HCl, pH 6,8) Tris base (FW 121,1) : 1,5g Nƣớc cất thêm 20 ml Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Thêm nƣớc cất đến 25ml Giữ đƣợc 3 tháng trong tối ở 4oC 4. SDS 10% SDS 2,5g Nƣớc cất cho đến 25ml Giữ đƣợc 6 tháng ở nhiệt độ phòng 5. Ammonium persulfate Ammonium persulfate 0,2g Nƣớc cất cho đến 2ml Pha để dùng ngay không để lại 6. 2X Treatment buffer 4X Stacking gel buffer 2,5ml SDS 10% 4ml Glycerol 2ml Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0,31g Bromophenol Blue 0,002g Thêm nƣớc cất cho đến 10ml Chia nhỏ thành các thể tích 0,5 ml giữ đƣợc trong 6 tháng ở -20oC 7. Tank buffer (0,025M Tris HCl; 0,192M Glycine; 0,1% SDS; pH 8,3) Tris (FW 121,1) 3,028g Glycine 14,413g SDS 1g Nƣớc cất cho đến 1 lít Giữ đƣợc 1 tháng ở nhiệt độ phòng 8. Resolving gel 15% Monomere 40% 3,8 ml 4X Resolving gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nƣớc cất 3,6 ml APS 10% 100 µl TEMED 10 µl 9. Stacking gel 5% Monomere 40% 1,3 ml 4X Stacking gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nƣớc cất 6,2 ml APS 10% 50 µl TEMED 10 µl 10. Dung dịch nhuộm gel (Staining solution) Coomassie Brilliant Blue G- 250: 0,025g Methanol: 40 ml Acid acetic : 10 ml Bổ sung nƣớc cất vừa đủ 100 ml 11. Dung dịch rửa màu Methanol : 40 ml Acid acetic : 10 ml Nƣớc cất vừa đủ 100 ml 12.Thuốc thử Bradford Hòa tan 0,01g Coomassive Brilliant Blue G-250 vào 5 ml ethanol 96%, sau đó thêm 10 ml H3PO4 85% rồi định mức lên đến 100 ml bằng nƣớc cất. [...]... uốn cong và bắt màu đỏ hồng đặc trƣng của nhóm vi khuẩn Gram âm Những đặc điểm này đều giống với đặc điểm của các chủng vi khuẩn đã đƣợc công bố [1], [24] Hình 3.3 Nhuộm Gram vi khuẩn Để định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, ngoài các đặc điểm về hình thái cần tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa Đặc điểm sinh hóa của các chủng đƣợc xác định bằng một số thử nghiệm sinh hóa và kit định danh... cơ thể, đặc biệt xuất huyết lở loét trên mô da và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và vi m đƣợc thu từ các trại giống và lồng nuôi trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Phân lập các chủng vi khuẩn Vibrio từ cá chẽm Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập đƣợc Tách chiết protein màng của các chủng phân lập đƣợc Phân và so củacứu các Hình... Microsoft Excel đƣợc sử dụng để phân tích, xử lý số liệu và vẽ đồ thị 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm 3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ mẫu cá chẽm (Lates calcarifer) có dấu hiệu bệnh lý Vibriosis Trên môi trƣờng TCBS, sau 24h, ở 37oC vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc (hình 3.1) với các. .. mịn mịn Vàng Vàng Vàng Xanh Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường TCBS Các khuẩn lạc rời trên môi trƣờng TCBS (hình 3.1) đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng NA bổ sung 2% NaCl (hình 3.2) để xác định các đặc điểm sinh hóa 28 Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường NA bổ sung 2% NaCl 3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả nhuộm Gram các chủng vi khuẩn. .. catalase, hóa chất nhuộm Gram, môi trƣờng tổng hợp bổ sung 2% NaCl (TSA, TSB, NA, NB) 21 b Phƣơng pháp tiến hành Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm Gram Các chủng vi khuẩn Gram âm sẽ đƣợc tiếp tục kiểm tra bằng hai phản ứng catalase và oxidase Để kiểm tra hoạt tính catalase của vi khuẩn, nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạc... không muối (NaCl) và không sinh H2S Phần lớn các loài Vibrio sống hoại sinh, chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho ngƣời Một số chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc Chúng sống trong nƣớc ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nƣớc lợ ven biển Vi khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng của tôm, cua… Đặc 11 trƣng của loài Vibrio là khả... cứu khác của Sadok Khouadja và cs (2013) cho thấy độc lực của các chủng V parahaemolyticus phân lập từ cá chẽm bệnh ở các trang trại ở Tunisia là rất nguy hiểm với liều gây chết 50% (LD50) dao động từ 3,52 x 104 và 2,29 x 106 cfu/g cá [17] Các dấu hiệu bệnh Vibriosis ở cá cũng tƣơng tự nhƣ những bệnh khác do vi khuẩn gây ra Bệnh thƣờng bắt đầu với các dấu hiệu là cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, xung huyết các vây,... triển vaccine chống lại chính các chủng vi khuẩn này để phòng ngừa dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 14 Theo kết quả phân tích thành phần protein màng của các chủng Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thƣơng phẩm ở Khánh Hòa [4] cho thấy thành phần protein của 4 chủng V alginolyticus là tƣơng tự nhau với các band protein có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 106; 92;... một vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác giữa vi khuẩn và ký chủ và là một “ứng cử vi n” tiềm năng để phát triển vaccine chống lại V harveyi [14] Zanal Abiddin và cs (2010) đã nghiên cứu phân tử và đặc tính kháng nguyên của hai loài Vibrio (V fluvialis và V mimicus) phân lập từ cá chẽm châu Á Kết quả của nghiên cứu cho thấy đối với V fluvialis, các kháng nguyên protein màng ngoài quan trọng nhất của. .. sinh trùng này bám vào mang cá, cá bị nhiễm bệnh biếng ăn thiếu máu và chậm lớn Cá con bị nhiễm nặng có thể chết nhanh trong hai, ba ngày [18] 1.4 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 1.4.1 Tổng quan về Vibrio spp  Hệ thống phân loại: Khóa phân loại của Bergey (1994) Ngành : Proteobacteria Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Vibrionales Họ : Vibrionaceae Giống : Vibrio Loài: V parahaemolyticus, ... điểm sinh hóa so sánh protein màng chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) Các nội dung đề tài: Phân lập xác định số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn Vibrio từ cá. .. chống lại vi khuẩn Vibrio Mục đích nghiên cứu xác định số đặc điểm sinh hóa chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm nuôi Khánh Hòa so sánh protein màng chủng phân lập đƣợc Một số đặc điểm sinh hóa chủng. .. cứu Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá chẽm Xác định đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hóa chủng phân lập đƣợc Tách chiết protein màng chủng phân lập đƣợc Phân so củacứu Hình tích 2.1 Sơ đồ sánh