a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: box cấy, nồi hấp, tủ lạnh, kính hiển vi, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, lam kính, micropippet.
Hóa chất và môi trƣờng: kit API-20E để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng, giấy tẩm Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử phản ứng Oxidase, H2O2 để thử phản ứng catalase, hóa chất nhuộm Gram, môi trƣờng tổng hợp bổ sung 2% NaCl (TSA, TSB, NA, NB).
b.Phƣơng pháp tiến hành
Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm Gram. Các chủng vi khuẩn Gram âm sẽ đƣợc tiếp tục kiểm tra bằng hai phản ứng catalase và oxidase.
Để kiểm tra hoạt tính catalase của vi khuẩn, nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạc đƣợc đặt sẵn trên lam kính.
Để kiểm tra hoạt tính oxidase của vi khuẩn, dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc của vi khuẩn miết lên miếng giấy đã tẩm sẵn thuốc thử oxidase (Tetramethyl-p- phenylenediamine hydrochloride).
Các chủng vi khuẩn Gram âm, hình que, dƣơng tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ đƣợc phân lập lại trên môi trƣờng TCBS nhằm thu đƣợc chủng vi khuẩn thuần khiết. Các chủng này đƣợc lƣu giữ trên thạch nghiêng TSA (2% NaCl) ở 4oC để định danh bằng kit API-20E hoặc ở -80oC trong môi trƣờng TSB bổ sung 2% NaCl và 20% glycerol để giữ chủng.
2.4.3 Phương pháp tách chiết protein màng của vi khuẩn
a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: máy ly tâm lạnh, bể ổn nhiệt, máy đo OD, eppendorf, micropipette
Hóa chất: Đệm ly giải (50 mM Tris-HCl pH 7,9; 50 mM EDTA; 15% (w/v) sucrose, và lysozyme (nồng độ cuối cùng 0,5 mg / ml), N-lauroylsarcosine 1%
b.Nguyên tắc
Dƣới tác dụng của lysozyme và quá trình ly tâm trong môi trƣờng đệm ly giải, màng tế bào sẽ bị phá vỡ đồng thời giải phóng các protein của tế bào. Quá trình ly lâm lần hai sẽ loại bỏ các protein hòa tan trong dịch tách chiết. Cặn thu đƣợc sẽ chứa các phân đoạn protein màng của tế bào.
c. Quy trình tách chiết protein màng vi khuẩn [21]
Cấy ria lại các chủng vi khuẩn đã phân lập đƣợc trên đĩa thạch NA bổ sung 2% NaCl ở 37o
C trong 24h
Lấy khuẩn lạc đơn nuôi tăng sinh trong 10ml môi trƣờng NB bổ sung 2% NaCl lắc ở 160 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24h
Hút 0,5 ml dịch vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa sẵn 0,5 ml PBS Tiến hành ly tâm thu cặn tế bào ở 8000 vòng/phút trong 15 phút
Hòa cặn trong 0,5 ml đệm ly giải lạnh chứa: 50 mM Tris-HCl (pH 7,9); 50 mM EDTA; 15% (w/v) sucrose và lysozyme (nồng độ cuối cùng là 0,5 mg/ml)
Ủ mẫu trên đá lạnh 30 phút
Ly tâm thu cặn ở 8000 vòng/phút trong 15 phút Hòa cặn trong 1ml N-lauroylsarcosine 1% (lạnh) Ly tâm thu dịch ở 8000 vòng/phút trong 15 phút Đo OD xác định hàm lƣợng protein
2.4.4 Phương pháp điện di SDS - PAGE
a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ : Thiết bị điện di protein (hình 2.2), máy ly tâm nhỏ, bể ổn nhiệt, máy đo OD, micropippet, đầu típ, cuvette, eppendorf.
Hóa chất : Monomer solution, 4X Resolving gel buffer, 4X Stacking gel buffer, SDS, Ammonium Persulfate, 2X treatment buffer, Tank buffer, TEMED, protein thang chuẩn, dung dịch nhuộm và rửa gel.
Hình 2.2. Bộ điện di SDS-PAGE (Bio-Rad)
b. Nguyên tắc
SDS là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này, protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2- mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối sulfite (S - S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, dƣới tác
động của điện trƣờng sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng. Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (Stacking gel): Thông thƣờng lớp gel này có nồng độ gel thấp vào khoảng 4 - 5%, và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu. Khi có tác động của điện trƣờng các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này. Nhờ đó, các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein.
Lớp gel phân tách (Resolving gel) (lớp dƣới): Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel gom, và nằm phía dƣới. Có tác dụng chính trong việc tạo ra các band protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu [6].
Hình 2.3. Mô hình điện di SDS-PAGE [31]
Kĩ thuật SDS - PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 - 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 Daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide nhỏ hơn 2,5%. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS - PAGE phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của protein mục tiêu trong mẫu nhƣ bảng 2.1 [28]:
Bảng 2.1. Tỷ lệ acrylamide trong gel SDS – PAGE và phạm vi phân tách protein
Acrylamide (%) Protein mục tiêu (kDa)
7 % 50 kDa – 500 kDa 10 % 20 kDa – 300 kDa 12 % 10 kDa – 200 kDa 15 % 3 kDa – 100 kDa
c. Phƣơng pháp tiến hành
Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
Lau các tấm kính bằng nƣớc cất, gắn vào giá đỡ
Lắp ráp các khuôn đổ gel theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Pha dung dịch Resolving gel 15%. Tải nhanh gel vào khuôn bằng micropippet 1ml một cách nhẹ nhàng (khoảng 4 - 5 ml/khuôn). Tải nƣớc cất hai lần lên lớp Resolving gel (giúp tránh tình trạng gel đông không tốt do bị oxi hóa và giúp bề mặt trơn láng). Đợi gel đông khoảng 30 - 45 phút.
Trong khi đợi Resolving gel trùng hợp tiến hành pha Stacking gel 5% acrylamide. Khi Resolving gel trùng hợp hoàn toàn, cho tiếp Stacking gel vào khuôn điện di cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lƣợc và để khoảng 30 - 45 phút.
Sau khi Stacking gel trùng hợp hoàn toàn, rút lƣợc nhẹ nhàng ra khỏi gel. Rửa sạch các giếng gel bằng Tank buffer. Sau đó, ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy Tank buffer vào hai máng trên và dƣới của buồng điện di để chuẩn bị cho điện di [3].
Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch điện di protein [28]
Thành phần Gel gom 5% (Stacking gel) Gel phân tách 15% (Resolving gel) Nƣớc cất 6,2 ml 3,6 ml Monomer solution 40% 1,3 ml 3,8 ml 4X Resolving gel buffer (pH 8,8) - 2,5 ml
4X Stacking gel buffer (pH 6,8) 2,5 ml - SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml APS 10% 50 µl 100 µl
Chuẩn bị mẫu để điện di
Lƣợng mẫu thích hợp để tải vào mỗi giếng trong SDS-PAGE là 50 µg/giếng. Dịch protein đƣợc hòa tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu 5X - Treatment buffer (tỉ lệ 4:1) trong eppendorf. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi trong 5 - 10 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong đƣợc giữ trong đá bào đến khi sử dụng.
Dùng micropippet hút trộn đều mẫu và tải mẫu từ từ vào giếng gel.
Chạy điện di
Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cắp điện Bật điện bộ nguồn, chỉnh cƣờng độ dòng điện ở mức 15 mA.
Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di đến khi vạch màu đến gần đáy của gel (khoảng 1,5 - 2 giờ).
Nhuộm gel và rửa gel
Lấy gel ra khỏi tấm kính
Ngâm gel trong thuốc nhuộm protein, lắc nhẹ cho đến khi thuốc nhuộm ngấm vào gel, thời gian ngâm từ 1 - 4 giờ hoặc ngâm qua đêm.
Chuyển gel sang ngâm trong dung dịch rửa màu. Thay dung dịch rửa mới vài lần cho đến khi gel có màu trong suốt, lúc này sẽ thấy xuất hiện những vạch màu xanh lơ trên gel.
2.4.5 Phương pháp Bradford
a. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị: ống nghiệm, pipette, micropipette, cuvette, bình tia
Môi trƣờng và hóa chất: dung dịch chuẩn Bovine Serum Albumine, H3PO4 85%, Coomassie Brilliant Blue G-250, Ethanol 96%.
b.Nguyên tắc
Nguyên tắc của phƣơng pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250. Thuốc nhuộm này khi phản ứng với protein sẽ tạo màu xanh và làm thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại từ 465 nm sang 595 nm của phức thuốc nhuộm - protein. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm cũng nhƣ cƣờng độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch [3].
c. Dựng đƣờng chuẩn BSA
Bảng 2.3. Nồng độ dung dịch BSA (µg/ml) Ống ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dung dịch BSA (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nƣớc cất (µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hút 5 ml dung dịch thuốc thử Bradford lần lƣợt cho vào các ống có chứa 1ml dịch protein vừa pha ở trên, lắc đều. Sau 20 phút đem đo dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm. Tại mỗi nồng độ sẽ tiến hành đo 2 - 3 lần và xác định giá trị OD trung bình. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (µg/ml).
d. Xác định nồng độ protein bằng phƣơng pháp Bradford
Pha loãng dịch tách chiết protein đến nồng độ thích hợp để đo OD
Hút 1ml dịch protein đã pha loãng và thêm vào đó 5 ml thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bƣớc sóng 595 nm. Với mỗi mẫu đƣợc thực hiện 2 - 3 lần, lấy giá trị OD trung bình. Từ đƣờng chuẩn có đƣợc suy ra nồng độ protein trong mẫu phân tích nhƣ sau:
Nồng độ protein của mẫu = nồng độ tính toán * độ pha loãng
2.4.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Microsoft Word đƣợc sử dụng để đánh văn bản
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ mẫu cá chẽm (Lates calcarifer) có dấu hiệu bệnh lý Vibriosis. Trên môi trƣờng TCBS, sau 24h, ở 37oC vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc (hình 3.1) với các đặc điểm đƣợc mô tả trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường TCBS
Các khuẩn lạc rời trên môi trƣờng TCBS (hình 3.1) đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng NA bổ sung 2% NaCl (hình 3.2) để xác định các đặc điểm sinh hóa.
Đặc điểm NH1 NT1 NH2 VN1 VN2 NH3 NH4 Hình dáng Tròn Vòng không đều Tròn Vòng không đều Vòng không đều Tròn Vòng không đều
Bờ khuẩn lạc Trơn Nhăn Trơn Nhăn Nhăn Trơn Nhăn
Bề mặt Lồi, tâm
nhô Lồi Lồi Lồi, tâm nhô Lồi, tâm nhô Lồi, tâm nhô Lồi Kích thƣớc (mm) 1,5 1,5 0,5 0,5 3 2 2 Cảm quan Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường NA bổ sung 2% NaCl
3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được
Kết quả nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu đƣợc (hình 3.3) cho thấy chúng có dạng hình que thẳng hoặc hơi uốn cong và bắt màu đỏ hồng đặc trƣng của nhóm vi khuẩn Gram âm. Những đặc điểm này đều giống với đặc điểm của các chủng vi khuẩn đã đƣợc công bố [1], [24].
Hình 3.3. Nhuộm Gram vi khuẩn
Để định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, ngoài các đặc điểm về hình thái cần tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa. Đặc điểm sinh hóa của các chủng đƣợc xác định bằng một số thử nghiệm sinh hóa và kit định danh API-20E.
Hai phản ứng catalase và oxidase đƣợc tiến hành kiểm tra trên các đĩa khuẩn lạc thuần. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994), chỉ những chủng cho kết quả
dƣơng tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase mới đƣợc giữ lại để tiếp tục kiểm tra các đặc điểm sinh hóa.
Bảng 3.2. Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm
Đặc điểm Chủng vi khuẩn
NH1 NT1 NH2 VN1 VN2 NH3 NH4
Nhuộm Gram - - - - Hình dạng tế bào Que Que Que Que Que Que Que
Di động + + + + + + + TCBS G Y Y Y Y Y G Sinh catalase + + + + + + + Sinh oxidase + + + + + + + Sinh β - galactosidase - + + + + - + Arginine - - + + + - - Lysine + + - - + + + Ornithine + - - - + Sử dụng Citrate - - + + + + - Sinh H2S - - - - Sinh Urease - - - - Tryptophan Deaminase - - - - Sinh Indole + + + + + + + Voges-Proskauer - + + + - - - Gelatinaza + + + + - - + D-Glucose + - + + + + + D-Mannitol + + - + + - + Inositol - - - + - + - D-Sorbitol - - + - - + - L-Rhamnose - - + + - - - Sucrose - + + + + + - Melibiose - - - + - Amygdaline + + - - + + + L-Arabinnose - - - + - + - NO2 + + + + + + +
Qua bảng 3.3 cho thấy, các vi khuẩn phân lập đƣợc là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, phản ứng dƣơng tính với oxidase và catalase. Tất cả đều phát triển trên môi trƣờng TCBS, không sinh H2S, Urease và Tryptophan Deaminase. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập bằng kit định danh API-20E và phần mềm ABIS trực tuyến [30] cho thấy các chủng có đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng cao với các chủng vi khuẩn Vibrio đã đƣợc công bố. Cụ thể nhƣ sau: NH1 tƣơng đồng với V. mimicus (92%), NH2 tƣơng đồng với V. anguillarum (91%), NH3 tƣơng đồng với V. harveyi (76%), NH4 tƣơng đồng với V. parahaemolyticus (94%), NT1 tƣơng đồng với
V. alginolyticus (81%), VN1 tƣơng đồng với V. anguillarum (79%) và VN2 tƣơng đồng với V. diazotrophicus (86%).
Khi so sánh kết quả định danh sinh hóa của chủng NT1 với chủng V. alginolyticus đƣợc phân lập từ cá chẽm nuôi lồng bè thƣơng phẩm bị lở loét tại Khánh Hòa [4], chúng tôi nhận thấy có sự tƣơng đồng cao. Tuy nhiên vẫn có những khác biệt ở một số đặc điểm sinh hóa: sinh β - galactosidase, sử dụng citrate, phản ứng Voges- Proskauer, sinh gelatinase và sử dụng sorbitol. Theo những kết quả định danh sinh hóa
V. alginolyticus đã công bố thì vẫn có những khác biệt ở một vài đặc điểm sinh hóa tùy theo từng chủng cụ thể.
Một so sánh khác cũng cho thấy sự tƣơng đồng rất cao giữa chủng NH4 với V. parahaemolyticus đƣợc phân lập từ cá bớp bị lở loét tại trại thực nghiệm nƣớc lợ - Khoa Thủy Sản – Đại học Cần Thơ khi giữa hai chủng chỉ khác nhau ở thử nghiệm sinh β - galactosidase [5].
Khi so sánh kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phần mềm ABIS trực tuyến và khóa phân loại Bergey (1994) dựa vào một số đặc điểm sinh hóa đã đƣợc xác định bằng kit định danh API-20E, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt ở một số đặc điểm sinh hóa nhất định: chủng VN2 khi định danh bằng kít API-20E cho kết dƣơng tính với Glucose và âm tính với Arabinose nhƣng khi định danh theo khóa phân loại Bergey thì VN2 âm tính với Glucose và dƣơng tính với Arabinose. Tuy có sự khác biệt giữa hai phƣơng pháp ở một số đặc điểm sinh hóa nhƣng kết quả của hai phƣơng pháp vẫn khẳng định sự tƣơng đồng cao của các chủng Vibrio phân lập đƣợc