0
Tải bản đầy đủ (.pdf) (50 trang)

Kết quả phân lập vi khuẩn

Một phần của tài liệu XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ SO SÁNH PROTEIN MÀNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VIBRIO SPP PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER) (Trang 35 -35 )

Phân lập đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ mẫu cá chẽm (Lates calcarifer) có dấu hiệu bệnh lý Vibriosis. Trên môi trƣờng TCBS, sau 24h, ở 37oC vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc (hình 3.1) với các đặc điểm đƣợc mô tả trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường TCBS

Các khuẩn lạc rời trên môi trƣờng TCBS (hình 3.1) đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng NA bổ sung 2% NaCl (hình 3.2) để xác định các đặc điểm sinh hóa.

Đặc điểm NH1 NT1 NH2 VN1 VN2 NH3 NH4 Hình dáng Tròn Vòng không đều Tròn Vòng không đều Vòng không đều Tròn Vòng không đều

Bờ khuẩn lạc Trơn Nhăn Trơn Nhăn Nhăn Trơn Nhăn

Bề mặt Lồi, tâm

nhô Lồi Lồi Lồi, tâm nhô Lồi, tâm nhô Lồi, tâm nhô Lồi Kích thƣớc (mm) 1,5 1,5 0,5 0,5 3 2 2 Cảm quan Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn Bóng mịn

Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường NA bổ sung 2% NaCl

3.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được

Kết quả nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu đƣợc (hình 3.3) cho thấy chúng có dạng hình que thẳng hoặc hơi uốn cong và bắt màu đỏ hồng đặc trƣng của nhóm vi khuẩn Gram âm. Những đặc điểm này đều giống với đặc điểm của các chủng vi khuẩn đã đƣợc công bố [1], [24].

Hình 3.3. Nhuộm Gram vi khuẩn

Để định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, ngoài các đặc điểm về hình thái cần tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa. Đặc điểm sinh hóa của các chủng đƣợc xác định bằng một số thử nghiệm sinh hóa và kit định danh API-20E.

Hai phản ứng catalase và oxidase đƣợc tiến hành kiểm tra trên các đĩa khuẩn lạc thuần. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994), chỉ những chủng cho kết quả

dƣơng tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase mới đƣợc giữ lại để tiếp tục kiểm tra các đặc điểm sinh hóa.

Bảng 3.2. Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá chẽm

Đặc điểm Chủng vi khuẩn

NH1 NT1 NH2 VN1 VN2 NH3 NH4

Nhuộm Gram - - - - Hình dạng tế bào Que Que Que Que Que Que Que

Di động + + + + + + + TCBS G Y Y Y Y Y G Sinh catalase + + + + + + + Sinh oxidase + + + + + + + Sinh β - galactosidase - + + + + - + Arginine - - + + + - - Lysine + + - - + + + Ornithine + - - - + Sử dụng Citrate - - + + + + - Sinh H2S - - - - Sinh Urease - - - - Tryptophan Deaminase - - - - Sinh Indole + + + + + + + Voges-Proskauer - + + + - - - Gelatinaza + + + + - - + D-Glucose + - + + + + + D-Mannitol + + - + + - + Inositol - - - + - + - D-Sorbitol - - + - - + - L-Rhamnose - - + + - - - Sucrose - + + + + + - Melibiose - - - + - Amygdaline + + - - + + + L-Arabinnose - - - + - + - NO2 + + + + + + +

Qua bảng 3.3 cho thấy, các vi khuẩn phân lập đƣợc là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, phản ứng dƣơng tính với oxidase và catalase. Tất cả đều phát triển trên môi trƣờng TCBS, không sinh H2S, Urease và Tryptophan Deaminase. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập bằng kit định danh API-20E và phần mềm ABIS trực tuyến [30] cho thấy các chủng có đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng cao với các chủng vi khuẩn Vibrio đã đƣợc công bố. Cụ thể nhƣ sau: NH1 tƣơng đồng với V. mimicus (92%), NH2 tƣơng đồng với V. anguillarum (91%), NH3 tƣơng đồng với V. harveyi (76%), NH4 tƣơng đồng với V. parahaemolyticus (94%), NT1 tƣơng đồng với

V. alginolyticus (81%), VN1 tƣơng đồng với V. anguillarum (79%) và VN2 tƣơng đồng với V. diazotrophicus (86%).

Khi so sánh kết quả định danh sinh hóa của chủng NT1 với chủng V. alginolyticus đƣợc phân lập từ cá chẽm nuôi lồng bè thƣơng phẩm bị lở loét tại Khánh Hòa [4], chúng tôi nhận thấy có sự tƣơng đồng cao. Tuy nhiên vẫn có những khác biệt ở một số đặc điểm sinh hóa: sinh β - galactosidase, sử dụng citrate, phản ứng Voges- Proskauer, sinh gelatinase và sử dụng sorbitol. Theo những kết quả định danh sinh hóa

V. alginolyticus đã công bố thì vẫn có những khác biệt ở một vài đặc điểm sinh hóa tùy theo từng chủng cụ thể.

Một so sánh khác cũng cho thấy sự tƣơng đồng rất cao giữa chủng NH4 với V. parahaemolyticus đƣợc phân lập từ cá bớp bị lở loét tại trại thực nghiệm nƣớc lợ - Khoa Thủy Sản – Đại học Cần Thơ khi giữa hai chủng chỉ khác nhau ở thử nghiệm sinh β - galactosidase [5].

Khi so sánh kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phần mềm ABIS trực tuyến và khóa phân loại Bergey (1994) dựa vào một số đặc điểm sinh hóa đã đƣợc xác định bằng kit định danh API-20E, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt ở một số đặc điểm sinh hóa nhất định: chủng VN2 khi định danh bằng kít API-20E cho kết dƣơng tính với Glucose và âm tính với Arabinose nhƣng khi định danh theo khóa phân loại Bergey thì VN2 âm tính với Glucose và dƣơng tính với Arabinose. Tuy có sự khác biệt giữa hai phƣơng pháp ở một số đặc điểm sinh hóa nhƣng kết quả của hai phƣơng pháp vẫn khẳng định sự tƣơng đồng cao của các chủng Vibrio phân lập đƣợc với các chủng Vibrio đã đƣợc công bố.

3.2 Kết quả xác định protein màng của các chủng vi khuẩn Vibrio theo phƣơng pháp điện di SDS - PAGE pháp điện di SDS - PAGE

Để xác định thành phần protein màng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành phƣơng pháp điện di SDS - PAGE. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.4:

Hình 3.4. Kết quả phân tích protein màng của các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bằng phương pháp SDS-PAGE

Kết quả hình 3.4 cho thấy thành phần protein của 7 chủng phân lập có sự tƣơng đồng rất cao. Tất cả các chủng đều xuất hiện các band protein có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 40 kDa. Đa số các chủng xuất hiện các band 160, 150, 62, 52, 38, 35, 31 kDa. Bên cạnh những band tƣơng đồng thì cũng có một số band khác biệt giữa các chủng. Band 58 kDa bắt màu rất đậm chỉ xuất hiện ở chủng NH1 và band 36 kDa chỉ xuất hiện ở chủng NH3. Hai chủng NH2 và VN1 không xuất hiện 2 band protein ở vị trí 160 và 150 kDa.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 52, 48, 43, 38 và 35 kDa là phổ biến ở 5/7 chủng, trong đó có chủng NH3 (nghi ngờ là

V.harveyi). Kết quả này có tính tƣơng đồng cao với nghiên cứu của Yingxue Q. và cs (2007) khi phân tích kháng nguyên của vi khuẩn V.harveyi, chủng TS-628 cho thấy có 5 band protein có trọng lƣợng phân tử khoảng 52, 47, 43, 38, 35 kDa [25]. Một nghiên

175 kDa 80 kDa 58 kDa 46 kDa 30 kDa VN1 NH2 NH1

M

M NT1 VN2 NH3 NH4

cứu khác của Wang Q. và cs (2011) khi xác định và đánh giá khả năng sản xuất vaccine của một protein màng OmpU từ V. harveyi cho thấy protein màng OmpU có trọng lƣợng phân tử 35 kDa có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao ở cá bơn [21]. Đây có thể là một ứng cử viên cho việc phát triển vaccine hay kháng thể chống lại nhiều chủng Vibrio.

Kết quả điện di SDS - PAGE chủng NT1 (nghi ngờ là V. alginolyticus) của chúng tôi cho thấy có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thoa và cs (2011) khi xác định thành phần protein của các chủng vi khuẩn V. alginolyticus phân lập từ cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa ở các band protein khoảng 75, 68, 62, 55, 38, 32 kDa [4]. Chủng NT1 cũng cho kết quả tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Ding và cs (2011) khi họ kết luận protein có khối lƣợng phân tử 47 và 38 kDa là phổ biển trong thành phần Omp của V.alginolyticus [9].

Một nghiên cứu của Ningqiu Li và cs (2010) đã cho thấy OmpK có trọng lƣợng phân tử trong khoảng 28 - 31 kDa là phổ biến ở các loài Vibrio [15]. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy sự tƣơng đồng cao với kết quả của nghiên cứu này khi có 6/7 chủng là VN1, NH1, NT1, VN2, NH3, NH4 có band protein ở vị trí khoảng 31 kDa.

Nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy chủng NH3 có xuất hiện 1 band protein ở vị trí khoảng 38 kDa. Kết quả này có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của Wang SY và cs (2003) khi phân tích vai trò của protein màng ngoài của V. anguillarum trong kháng mật và hình thành màng sinh học. Họ đã xác định một Omp đƣợc tổng hợp với một lƣợng lớn có trọng lƣợng phân tử 38 kDa [22]. Tuy nhiên, trong kết quả của chúng tôi, band này còn xuất hiện ở NH1, NT1, VN2 và NH4. Protein này có thể là một ứng cử viên cho sản xuất vaccine chống lại V. mimicus, V. alginolyticus, V. diazotrophicus

V. parahaemolyticus.

Một kết quả khác trong nghiên cứu của chúng tôi là chủng NH1 xuất hiện một band protein khoảng 58 kDa với cƣờng độ màu rất đậm. Band này cũng xuất hiện ở NH3 và VN2 nhƣng bắt màu rất nhạt. Trong phạm vi tìm hiểu của chúng tôi thì chƣa thấy kết quả này tƣơng đồng với các báo cáo về protein màng của V. mimicus đã đƣợc công bố. Do đó, chúng tôi cần có những nghiên cứu sâu hơn trƣớc khi đƣa ra kết luận về protein này.

Khi quan sát kết quả SDS - PAGE của chủng NH3 (nghi ngờ là V. harveyi), chúng tôi nhận thấy có một band protein khoảng 36 kDa bắt màu tƣơng đối đậm và

không xuất hiện ở các chủng còn lại. Kết quả này có sự khác biệt lớn với kết quả nghiên cứu của Tang Xiao-Qian và cs (2009) khi họ kết luận Omp 36 kDa là phổ biến ở 6 loài: V. anguillarum, V. ichthyoenteri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi V. vulnificus [20]. Một nghiên cứu khác của Wei-ni Z và cs (2008) cũng khẳng định Omp 36 kDa đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu nhận dạng cho các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio [23]. Sự khác biệt này có thể do sự phân tách protein chƣa tốt trong thí nghiệm của chúng tôi hoặc do chƣa xác định rõ ràng giữa band 36 và 35 kDa. Chúng tôi cần thực hiện một số nghiên cứu tiếp theo mới có thể đƣa ra kết luận về protein này.

Nhìn chung thành phần protein màng của các chủng phân lập có tính tƣơng đồng rất cao. Có nhiều band xuất hiện ở tất cả hoặc đa số các chủng với sự sai khác cƣờng độ màu không đáng kể nhƣ các band 80, 78, 52, 43, 38, 35 và 31 kDa. Với kết quả này, một phần nào đó có thể cho thấy triển vọng lớn trong việc phát triển một loại vaccine từ protein màng chống lại nhiều chủng Vibrio hay ít nhất là 7 chủng mà chúng tôi đã phân lập đƣợc hoặc cũng có thể tách chiết các protein này để làm kháng nguyên sản xuất kháng thể tăng sức đề kháng với Vibrio cho động vật thủy sản.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

 Đã phân lập, định danh sinh hóa và lƣu giữ đƣợc 7 chủng vi khuẩn từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa gồm: NH1, NH2, NH3, NH4, VN1, VN2, NT1 có các đặc điểm sinh hóa tƣơng đồng cao với các chủng tƣơng ứng là: V. mimicus, V. anguillarum, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. diazotrophicus V. alginolyticus.

 Thành phần protein màng của 7 chủng có sự tƣơng đồng rất cao ở các band protein có khối lƣợng phân tử khoảng 140, 80, 78, 52, 46, 43, 40, 38, 35 và 31 kDa. Tuy nhiên, vẫn có một số khác biệt ở một vài band có khối lƣợng phân tử khoảng 160, 150, 58, 36 kDa.

2 Kiến nghị

 Định danh di truyền các chủng vi khuẩn đã phân lập để xác định chính xác từng chủng vi khuẩn.

 Khảo sát các phƣơng pháp tách chiết protein màng để thu đƣợc protein màng tinh khiết với hàm lƣợng cao hơn.

 Nghiên cứu so sánh protein màng giữa các chủng Vibrio phân lập từ cá chẽm bệnh với các chủng Vibrio chuẩn để kết quả tin cậy hơn.

 Nghiên cứu tách chiết những protein màng có tiềm năng nhƣ protein 78, 43, 38 và 31 kDa để làm vaccine hoặc làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể trong phòng trị bệnh cho thủy sản.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.

2. Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008). Các loại bệnh thƣờng gặp trên cá biển nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trƣờng Đại học Nha Trang, trang 16 - 24. 3. Ngô Thị Giang (2013). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng gây

đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm. Đồ án Đại học, Trƣờng Đại học Nha Trang.

4. Nguyễn Thị Thoa (2011). Độc lực và thành phần protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Nha Trang. 5. Nguyễn Thị Thúy An (2013). Phân lập vi khuẩn Vibrio trên cá bớp

(Rachycentron canadum) bị lở loét. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Cần Thơ. 6. Viên Đại Phúc (2011). Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates

calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hòa.

Tài liệu tiếng Anh

7. Austin B., Zhang X. H. (2006). Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates. Lett Appl Microbiology, 43(2): 119-124.

8. Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72:248-254.

9. Ding T., Tian-long L., Bin-fu X. (2011). Comparative Characteristics of Outer Membrane Proteins in Bacteria V. vulnificus and V. alginolyticus. Fisheries Science (Biotechnology Institute, the Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China).

10. Holt J. G., N.R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (1994).

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition. William & Wilkins. 11. Koqa T., Kawata T. (1983). Isolation and characterization of the outer membrane

12. Laemmli U. K. (1970). Cleavage of structural protein during the assembly of the head of Bacteriophage T4.Nature, 227, 680-685.

13. McCarter L. L., Silverman M. (1987). Phosphate regulation of gene expression in

Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, 169(8): 3441-3449.

14. Ningqiu L., Junjie B., Shuqin W., Xiaozhe F., Haihua L., Xing Y., Cunbin S. (2008). An outer membrane protein, OmpK, is an effective vaccine candidate for

Vibrio harveyi in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Fish Shellfish Immunology, 25(6): 829-833.

15. Ningqiu L., Zhihui Y., Junjie B., Xiaozhe F., Lihui L., Cunbin S., Shuqin W. (2010). A shared antigen among Vibrio species: outer membrane protein-OmpK as a versatile sis vaccine candidate in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Fish & Shellfish Immunology, 28(5): 952-956.

16. Poornima M., Vijaya Kumar R., Santiago T. C., Arasu, A. R. T. (2013). Recombinant outer membrane protein, Omp26la of Vibrio anguillarum is an effective vaccine candidate. Journal of Aquatic Biology and Fisheries, 2, pp. 436-440.

17. Sadok Khouadja, Faouzi Lamari, Amina Bakhrouf (2013). Characterization of

Vibrio parahaemolyticus isolated from farmed sea bass (Dicentrarchus labrax ) during disease outbreaks. International Aquatic Research, 5(1): 13.

18. Sobhana, K. S. (2009). Diseases of seabass in cage culture and control measures.

National training on cage culture of seabass, pp. 87-93.

19. Sun K., Zhang W. W., Hou J. H., Sun L. (2009). Immunoprotective analysis of VhhP2, a Vibrio harveyi vaccine candidate. Vaccine, 27(21): 2733-2740.

20. Tang Xiao-Qian, Zhan Wen-Bin, Zhou Li, Sheng Xiu-Zhen (2009). Characterization of 36 kDa Outer Membrane Proteins of Six Pathogenic Species. Periodical of Ocean University of China (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China).

21. Wang Q., Chen J., Liu R., Jia J. (2011). Identification and evaluation of an outer membrane protein OmpU from a pathogenic Vibrio harveyi isolate as vaccine candidate in turbot (Scophthalmus maximus). Letter Appl Microbiology, 53(1): 22-29.

22. Wang S. Y., Lauritz J., Jass J., Milton D. L. (2003). Role for the major outer- membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm

Một phần của tài liệu XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ SO SÁNH PROTEIN MÀNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VIBRIO SPP PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER) (Trang 35 -35 )

×