Kiểm nghiệm listeria monocytogenes
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG KIỂM NGHIỆM LISTERIA MONOCYTOGENES GVHD: Th.S Bùi Anh Võ Lớp: 10060301, 08SH1D Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 3 năm 2013 SV thực hiện: 1) Nguyễn Triết Lãm - MSSV: 61003212 2) Bùi Văn Thành – MSSV: 080569H 1. Giới thiệu về Listeria Monocytogenes 1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes 1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes 1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes Nguồn chứa vi khuẩn L. monocytogenes 2. Khả năng nguy hiểm của Listeria monocytogenes 2. Khả năng nguy hiểm củaListeria monocytogenes Bệnh Listeriosis: 2. Khả năng nguy hiểm của Listeria monocytogenes Biện pháp phòng tránh: 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1. Phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẫm thịt, sữa. 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1.2 Quy trình phân tích: 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.1 Mồi cho phản ứng PCR 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.2 Xác định tính đặc hiệu của mồi 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.3 Tiến hành - Phương pháp chuẩn bị mẫu 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.3 Tiến hành - Tăng sinh 3. Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.3 Tiến hành - Phản ứng PCR và xử lý kết quả 3. Định tính Listeria Monocytogenes - Đánh giá kết quả: các mẫu xuất hiện các băng DNA tương ứng với vị trí 468bp trong các phản ứng PCR với cặp mồi là các mẫu bị nhiễm 468 bp L. monocytogenes 400 bp Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch được thể hiện trong hình 1-giếng 2 cho thấy một băng DNA có Hình 1 kích thước nằm trong khoảng 1.Thang DNA chuẩn 2.Mẫu chuẩn dương tính kích thước sản phẩm PCR 3.Mẫu chuẩn âm tính thiết kế. 3. Định tính Listeria Monocytogenes 2. Quy trình phân tích L. monocytogenes theo truyền thống 2.1 Nguyên lý phương pháp Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh vật hoá học. 3. Định tính Listeria Monocytogenes 2.2 Dụng cụ, môi trường và thuốc thử 2.2.1 Môi trường, thuốc thử - Nước Pepton 0,1 %. - Thạch Oxford. - Thạch Tryptone soya có 0,6% cao men (yeast extract) -TSA-YE. - Canh thang Tryptone soya có 0,6% cao men (TSB-YE) - Thạch máu cừu. - Môi trường SIM. - Môi trường Clurk-Lubs. - Canh thang đường Manitol, Xylose, Rhamnose 5%, có chỉ thị màu Bromocresol và ống Durham. - Bộ thuốc nhuộm Gram. - Hydrogen Peroxide 3% 3. Định tính Listeria Monocytogenes 2.3 Tiến hành 2.3.1. Bước 1 : - Đánh dấu lên đĩa thạch nồng độ dung dịch mẫu thử. - Dùng pipet 1ml vô trùng hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch thử 10-1 , nhỏ lên bề mặt đĩa thạch chọn lọc đã đánh dấu nồng độ dung dịch mẫu thử tương ứng. - Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy thuỷ tinh ria đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp mặt thạch sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều - Ủ ở 370C/48giờ. 3. Định tính Listeria Monocytogenes 2.3.2. Bước 2: Đọc kết quả sơ bộ sau 48 giờ. - Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có đặc tính: Tròn đều, màu nâu đen hoặc xanh đen. Đường kính: 2-3 mm và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đen với trung tâm khuẩn lạc lõm xuống. Đây là đặc điểm đặc trưng của giống Listeria. 3.Tính Định Listeria Monocytogenes kếttính quả theo công thức (tài liệu TN Vi sinh) : N A= n1. f1.V +.... + ni f iV Trong đó: -A : Số tế bào vi khuẩn (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1ml mẫu; CFU/ml - N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp đã chọn. - V: Thể tích mẫu cấy trên môi trường đĩa. - n1 : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng ban đầu. - ni : Số đĩa đếm được ứng với độ pha loãng thứ i. 3. Định tính Listeria Monocytogenes 2.3.3. Bước 3: Tăng sinh thuần chủng và xác định hình thể, tính chất bắt màu. 2.3.3.1. Tăng sinh thuần chủng: - Lấy khuẩn lạc điển hình từ thạch chọn lọc cấy vào môi trường TSA-YE và ủ ấm ở 370C / 24h thu được khuẩn lạc thuần nhất tròn, trong, bóng và hơi lồi. 2.3.3.2. Hình thể và tính chất bắt màu: Từ khuẩn lạc thuần nhất nhuộm Gram xem hình thể: Nhuộm Gram sau 16 - 24h nuôi cấy thấy: Trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm Gram. Đường kính 0,4 - 0,5 mm và dài 0,5 - 2 mm. 3. Định tính Listeria Monocytogenes - Soi tươi trên lam kính xem tính chất di động: + Lấy 1 khuẩn lạc mọc trên TSA-YE cấy vào môi trường canh thang TSB-YE. Để ở 25oC qua đêm. + Canh trùng được soi tươi trên lam kính thấy : Hình que ngắn, mảnh, di động kiểu xoay tròn nhẹ hoặc nhào lộn. Di động kiểu bơi không phải là giống Listeria. 3. Định tính Listeria Monocytogenes 2.3.4 Bước 4: Tính chất sinh vật hoá học: 2.3.4.1.Tính chất di động trên thạch SIM : - Lấy canh trùng từ TSB-YE cấy vào môi trường thạch SIM . - Ủ ấm : 2-7 ngày ở 25oC. Thấy di động tạo hình cái ô. 2.3.4.2.Tính chất lên men đường: Xylose, Rhamnose, Manitol. - Dùng canh thang có chỉ thị màu Bromocresol và có ống Durham để xác định tính chất lên men các loại đường. - Để các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở tủ ấm 35oC / 4 - 7 ngày. - Quan sát hàng ngày (24-48h) để xem sự thay đổi màu 3. Định tính Listeria Monocytogenes Tiêu chuẩn xác định Listeria monocytogenes trong thực phẩm: Danh mục Thực phẩm làm sẵn, là nguyên nhân liên kết với bệnh Listeriosis (như phó-mát, pa-tê gan, xà lách trộn hạn sử dụng >10 ngày, sản phẩm thịt lợn). Giới hạn (LM) > 0 cfu/50g Tất cả các loại thực phẩm làm sẵn > 0 cfu/25g khác hỗ trợ cho sự tăng trưởng của Listeria monocytogenestrong điều kiện làm lạnh và hạn sử dụng >10 ngày. Tình trạng Hành động cần GMP thiết n/ad Loại I: Thu về đối với việc bán lẻ. n/a Xem xét, báo cáo cộng đồng, theo dõi tại nhà máy. Loại II: Thu hồi sản phẩm. 3. Định tính Listeria Monocytogenes Thực phẩm làm sẵn [...]...3 Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.1 Mồi cho phản ứng PCR 3 Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.2 Xác định tính đặc hiệu của mồi 3 Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.3 Tiến hành - Phương pháp chuẩn bị mẫu 3 Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.3 Tiến hành - Tăng sinh 3 Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.3 Tiến hành - Phản ứng PCR và xử lý kết quả 3 Định tính Listeria Monocytogenes - Đánh... tích L monocytogenes theo truyền thống 2.1 Nguyên lý phương pháp Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh vật hoá học 3 Định tính Listeria Monocytogenes 2.2 Dụng cụ, môi trường và thuốc thử 2.2.1 Môi trường, thuốc thử - Nước Pepton... thay đổi màu 3 Định tính Listeria Monocytogenes Tiêu chuẩn xác định Listeria monocytogenes trong thực phẩm: Danh mục Thực phẩm làm sẵn, là nguyên nhân liên kết với bệnh Listeriosis (như phó-mát, pa-tê gan, xà lách trộn hạn sử dụng >10 ngày, sản phẩm thịt lợn) Giới hạn (LM) > 0 cfu/50g Tất cả các loại thực phẩm làm sẵn > 0 cfu/25g khác hỗ trợ cho sự tăng trưởng của Listeria monocytogenestrong điều kiện... và dài 0,5 - 2 mm 3 Định tính Listeria Monocytogenes - Soi tươi trên lam kính xem tính chất di động: + Lấy 1 khuẩn lạc mọc trên TSA-YE cấy vào môi trường canh thang TSB-YE Để ở 25oC qua đêm + Canh trùng được soi tươi trên lam kính thấy : Hình que ngắn, mảnh, di động kiểu xoay tròn nhẹ hoặc nhào lộn Di động kiểu bơi không phải là giống Listeria 3 Định tính Listeria Monocytogenes 2.3.4 Bước 4: Tính... mọc phân tán đều - Ủ ở 370C/48giờ 3 Định tính Listeria Monocytogenes 2.3.2 Bước 2: Đọc kết quả sơ bộ sau 48 giờ - Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có đặc tính: Tròn đều, màu nâu đen hoặc xanh đen Đường kính: 2-3 mm và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đen với trung tâm khuẩn lạc lõm xuống Đây là đặc điểm đặc trưng của giống Listeria 3.Tính Định Listeria Monocytogenes kếttính quả theo công thức (tài... PCR với cặp mồi là các mẫu bị nhiễm 468 bp L monocytogenes 400 bp Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch được thể hiện trong hình 1-giếng 2 cho thấy một băng DNA có Hình 1 kích thước nằm trong khoảng 1.Thang DNA chuẩn 2.Mẫu chuẩn dương tính kích thước sản phẩm PCR 3.Mẫu chuẩn âm tính thiết kế 3 Định tính Listeria Monocytogenes 2 Quy trình phân tích L monocytogenes theo truyền thống 2.1 Nguyên... cáo cộng đồng, theo dõi tại nhà máy Loại II: Thu hồi sản phẩm 3 Định tính Listeria Monocytogenes Thực phẩm làm sẵn ... thiệu Listeria Monocytogenes Giới thiệu Listeria monocytogenes Giới thiệu Listeria monocytogenes Giới thiệu Listeria monocytogenes Nguồn chứa vi khuẩn L monocytogenes Khả nguy hiểm Listeria monocytogenes. .. monocytogenes Khả nguy hiểm củaListeria monocytogenes Bệnh Listeriosis: Khả nguy hiểm Listeria monocytogenes Biện pháp phòng tránh: Định tính Listeria Monocytogenes Phát nhanh Listeria monocytogenes thực... tính Listeria Monocytogenes 1.2 Quy trình phân tích: Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.1 Mồi cho phản ứng PCR Định tính Listeria Monocytogenes 1.2.2 Xác định tính đặc hiệu mồi Định tính Listeria