khảo sát khả năng ức chế enzyme alpha amylase của cao thô ethanol trái cau trắng (veitchia merrillii wendl ) in vitro

    TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN SINH HỌC —-oOo-– LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA-AMYLASE CỦA CAO THÔ ETHANOL TRÁI CAU TRẮNG (Veitchia merrillii Wendl.) IN VITRO Giảng Viên Hướng Dẫn Sinh Viên Thực Hiện TS. Đái Thị Xuân Trang Lương Ánh Huệ MSSV: 3102645 Lớp: Sinh Học K36 Cần Thơ, tháng 5 năm 2014 -i-      LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và trân trọng nhất đến quý Thầy Cô đã dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức hữu ích, đặc biệt là quý Thầy Cô bộ môn Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã dẫn dắt em đi hết quãng đường đại học. Trong thời gian thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế enzyme alpha-amylase của cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) in vitro ”, em xin chân thành cảm ơn đến: Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài, cùng với quý Thầy Cô bộ môn Sinh Học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến Cô Đái Thị Xuân Trang, là cán bộ hướng dẫn em thực hiện đề tài, đã nhiệt tình góp ý kiến và chỉ dạy cho em hoàn thành đề tài. Quý Thầy Cô, cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học, Hoá học – Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tạo môi trường học tập và điều kiện thuận lợi về thời gian cho em hoàn thành đề tài này. Ngoài ra, tôi xin cảm ơn đến gia đình tôi đã hỗ trợ và ủng hộ tôi về mặt thể chất lẫn tinh thần, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn. Tôi xin cảm ơn lớp Sinh Học K36 đã đồng hành và chia sẻ khó khăn với tôi. Rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để bài luận văn của em được hoàn thiện. Xin chân thành cảm ơn! Lương Ánh Huệ -i-      LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự chỉ dẫn của cán bộ hướng dẫn. Các số liệu và kết quả thu được là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây. Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận văn Ts. Đái Thị Xuân Trang Lương Ánh Huệ -ii-      PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. Đái Thị Xuân Trang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG -iii-      MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i LỜI CAM KẾT ...................................................................................................... ii PHẦN KÝ DUYỆT .............................................................................................. iii MỤC LỤC ............................................................................................................ iv DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................... vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. viii TÓM LƯỢC .......................................................................................................... 1 PHẦN I: MỞ ĐẦU ............................................................................................... 2 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 4 I. Sơ lược về bệnh đái tháo đường ...................................................................... 4 1. Định nghĩa ................................................................................................... 4 2. Phân loại và cơ chế sinh bệnh ...................................................................... 4 3. Các biến chứng của bệnh đái tháo đường .................................................... 6 4. Các phương pháp điều trị bệnh .................................................................... 7 II. Giới thiệu về Enzyme α-amylase ................................................................. 11 1. Thành phần hoá học và tính chất ............................................................... 11 2. Cơ chế tác dụng ......................................................................................... 12 3. Tính đặc hiệu ............................................................................................. 13 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme α-amylase .......................................... 13 III. Sơ lược về cây Cau Trắng........................................................................... 15 1. Phân loại và định danh ............................................................................... 15 2. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 15 3. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 15 PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................... 17 I. Phương tiện.................................................................................................... 17 -iv-      1. Địa điểm và thời gian thực hiện................................................................. 17 2. Mẫu vật, hoá chất và thiết bị ...................................................................... 17 II. Phương pháp thí nghiệm .............................................................................. 17 1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu................................................................ 17 2. Phương pháp chiết và tách cao ruột trái Cau Trắng bằng dung môi ethanol ....................................................................................................................... 18 3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột ................................................................................ 19 4. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột ........ 20 5. Phương pháp xử lí kết quả ......................................................................... 21 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 22 I. Xác định độ ẩm của nguyên liệu ................................................................... 22 II. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột ........................................................................................... 22 III. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) ..................................................................... 27 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 31 I. Kết luận ......................................................................................................... 31 II. Kiến nghị ...................................................................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 32 PHỤ LỤC A......................................................................................................... 36 PHỤ LỤC B ......................................................................................................... 41 -v-      DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Độ ẩm của ruột trái Cau Trắng ............................................................... 22 Bảng 2: Ảnh hưởng bởi các nồng độ khác nhau của Acarbose lên hoạt tính enzyme α-amylase ............................................................................................... 23 Bảng 3: Hàm lượng chất ức chế có trong cao thô ruột trái Cau Trắng tương đương với nồng độ Acarbose (mg/ml). ................................................................ 28 Bảng 4: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose. ... 36 Bảng 5: Kết quả hiệu suất ức chế enzyme α-amylase bởi các nồng độ khác nhau của Acarbose. ....................................................................................................... 37 Bảng 6: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng. ..................................................................................................... 41 Bảng 7: Kết quả hiệu suất ức chế enzyme α-amylase bởi các nồng độ khác nhau của cao thô ruột trái Cau Trắng. .......................................................................... 42 -vi-      DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Buồng Cau Trắng ở trên cây và cây Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) ................................................................................................................ 16 Hình 2. Trái Cau Trắng ở giai đoạn trung gian giữa non và già được chẻ đôi. .. 18 Hình 3. Phần ruột của trái Cau Trắng ở các giai đoạn phát triển ........................ 21 Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose.... 22 Hình 5. Đường chuẩn khả năng ức chế hoạt động enzyme α-amylase của Acarbose..……………………………………………………………………….24 -vii-      DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADA: American Diabetes Association CI: Confidence interval DMSO: Dimethyl Sulfoxide ĐTĐ: Đái Tháo Đường HbA1c: Glycosylate Hemoglobin A IC50: Inhibitory concentration of 50 percent KI: Potassium iodide RTCT: Ruột trái Cau Trắng WHO: World Heath Organization -viii-    TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) in vitro” được thực hiện nhằm khảo sát khả năng ức chế hoạt động enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng (RTCT). Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô RTCT được thực hiện bằng cách ủ enzyme α-amylase với cao thô trong dung dịch đệm phosphate natri pH 7 ở 37°C, sau đó tinh bột được cho vào hỗn hợp phản ứng và tiếp tục ủ. Cuối cùng, phản ứng được kết thúc bằng HCl và nhận biết lượng tinh bột còn lại bằng dung dịch iod. Khả năng ức chế enzyme α-amylase được xác định dựa vào lượng tinh bột ban đầu và lượng tinh bột còn lại sau phản ứng dựa trên sự nhận biết màu xanh đặc trưng của phức hợp tinh bột-iod. Kết quả được đánh giá bằng lượng enzyme bị ức chế thông qua giá trị mật độ quang (OD) của mẫu được đo ở bước sóng 660 nm. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ức chế enzyme α-amylase tăng dần khi tăng nồng độ cao thô ethanol RTCT lên từ 0,2 mg/ml đến 0,4; 0,6; 0,8; 1 và nồng độ cao thô 1,2 mg/ml có khả năng ức chế enzyme cao đến 90,18% ± 0,647. Bên cạnh đó, kết quả còn cho thấy khả năng ức chế enzyme α-amylase của RTCT (IC50 = 0,503 mg/ml) thấp hơn Acarbose (IC50 = 0,036 mg/ml) 13,97 lần. Từ khoá: Acarbose, bệnh đái tháo đường, enzyme α-amylase, ruột trái Cau Trắng, Veitchia merrillii Wendl.. -1-      PHẦN I: MỞ ĐẦU Bệnh tiểu đường, tên gọi y khoa là bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), là một trong bốn bệnh mãn tính đang có tốc độ phát triển nhanh trên toàn thế giới, đó là bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch, bệnh phổi và bệnh ung thư. Trên thế giới, số người mắc bệnh ĐTĐ tăng lên từ 153 triệu người năm 1980 đến 347 triệu người năm 2008 [1]. Chi phí y tế toàn cầu về bệnh ĐTĐ đã đạt ít nhất 376 tỷ USD trong năm 2010, dự đoán tăng lên 490 tỷ USD trong năm 2030 [2]. Năm 2004, ước tính khoảng 3,4 triệu người chết vì hậu quả lượng đường trong máu lúc đói cao [3]. Theo các nghiên cứu cho thấy, hơn 80% các ca tử vong do bệnh ĐTĐ xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và thu nhập trung bình [4]. Trong suốt 20 năm đầu của thế kỷ 20, vô số các công trình nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra phương thuốc điều trị bệnh ĐTĐ nhưng hầu hết đều không đạt kết quả. Năm 1921, một phẫu thuật viên người Canada với ý tưởng thực tế đã chiết xuất thành công chất insulin, đánh dấu một mốc son trong lịch sử y học [5]. Và từ đó, phương pháp điều trị bằng insulin đã trở thành phương pháp hiệu quả. Tuy nhiên, chi phí điều trị bằng phương pháp này khá cao, đem lại không ít khó khăn về tài chính cho người bệnh và nhất là những người bệnh có thu nhập thấp ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp trong việc điều trị bệnh ĐTĐ bằng thuốc như Meformin, Sulfonylureas, Glinides nhưng cũng khá tốn kém mà hiệu quả điều trị chưa cao và nhiều tác dụng phụ [6]. Chính vì vậy, nhiều bệnh nhân ĐTĐ đã tìm đến phương pháp ít tốn kém hơn và không ảnh hưởng nhiều đến các cơ quan khác trong cơ thể. Đó là phương pháp Đông y dùng cây cỏ trong thiên nhiên để làm thuốc, vừa tiết kiệm chi phí, vừa an toàn. Trong thời gian gần đây, những thông tin truyền miệng về khả năng giảm đường huyết của trái Cau Trắng được nhiều bệnh nhân ĐTĐ biết đến và sử dụng nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào chứng minh trái Cau Trắng có khả năng giảm đường huyết. Với thông tin đó, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA – AMYLASE CỦA CAO THÔ ETHANOL RUỘT TRÁI CAU TRẮNG (Veitchia merrillii Wendl.) in vitro” được thực hiện nhằm khảo -2-      sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng in vitro. Sự ức chế enzyme α-amylase sẽ làm quá trình thuỷ phân tinh bột bị chậm lại dẫn đến lượng glucose được tạo ra giảm, giúp kiểm soát đường huyết sau khi ăn. Bên cạnh đó, đề tài có thể tạo cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học của cây Cau Trắng. -3-      PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Sơ lược về bệnh đái tháo đường 1. Định nghĩa Bệnh đái tháo đường là một tình trạng mãn tính, có yếu tố di truyền, xảy ra khi mức độ glucose trong máu quá cao cùng với các rối loạn về chuyển hoá đường, đạm, mỡ, khoáng chất do hậu quả từ tình trạng thiếu insulin tuyệt đối hay tương đối. Mức độ glucose trong máu bình thường được điều hoà bởi nội tiết tố insulin, được sản xuất bởi tuyến tuỵ. Ở những người bị bệnh ĐTĐ, tuyến tuỵ không sản xuất đủ insulin hoặc cơ thể kháng insulin [7, 8]. 2. Phân loại và cơ chế sinh bệnh Theo phân loại của WHO năm 1999 thì bệnh ĐTĐ có những loại sau: 2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1 Trước đây, bệnh ĐTĐ loại 1 còn được gọi là bệnh ĐTĐ phụ thuộc nội tiết tố insulin [7]. Bệnh hầu hết gặp ở lứa tuổi trẻ nhưng có thể xảy ra ở bất cứ độ tuổi nào, có khoảng 80% các trường hợp được phát hiện ở tuổi dưới 30. Nguyên nhân bệnh có liên quan đến yếu tố di truyền. Cơ thể người bệnh tiết ra kháng thể kháng tế bào β của tuyến tụy, làm cho tế bào này bị phá hủy; có thể có tới khoảng 90% tổng số tế bào β của tụy tạng bị thương tổn. Vì vậy lượng insulin trong máu người bệnh bị giảm thiểu rất nhiều hoặc mất hẳn sẽ làm rối loạn chuyển hoá glucose, tăng phân huỷ lipid dẫn tới tăng glucose huyết và acid béo gây ra tình trạng đa niệu thẩm thấu và nhiễm ceton [8, 9]. Những người mang gen nhạy cảm khi gặp tác động của các yếu tố môi trường như bị nhiễm vi rút rubella, sởi, cocxackie; bú sữa bò thời kỳ sơ sinh và đặc thù địa dư ở một số nước có tỷ lệ bệnh cao như Phần Lan sẽ xuất hiện kháng thể kháng tế bào β của tụy tạng, phá hủy các tế bào này làm cho insulin bị giảm tiết và gây bệnh [9]. 2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2 Bệnh đái tháo đường loại 2 còn được gọi là bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin [7]. Đây là thể bệnh hay gặp nhất của bệnh ĐTĐ và chiếm khoảng từ 85% đến 90% tổng số các bệnh nhân ĐTĐ. Bệnh là sự phối hợp giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường với cơ chế gây bệnh là giảm nhạy cảm đối với insulin, gọi là -4-      kháng insulin ở gan và cơ vân; có thể kèm theo sự suy chức năng của tế bào β làm giảm tiết insulin. Bệnh khởi đầu bằng kháng insulin do béo phì, tuổi tác, ít vận động thể lực dẫn đến insulin giảm hiệu quả trong việc chuyển glucose từ máu vào gan, cơ vân. Do vậy, tụy tạng phải tăng cường tiết insulin dẫn đến tình trạng tụy tạng bị tổn thương, làm cho insulin bị giảm tiết. Cuối cùng sự phối hợp của việc kháng insulin và giảm tiết insulin làm cho glucose huyết tăng lên dẫn đến việc gây bệnh [9, 12]. Bệnh thường hay gặp ở người béo phì, người lớn tuổi do khả năng tổng hợp protein của tế bào ở những người này rất kém nên không tổng hợp được thụ thể để bắt giữ insulin, do đó, tuy tuyến tuỵ vẫn sản xuất insulin bình thường nhưng không có tác dụng đưa glucose vào trong tế bào [8]. Bệnh tiến triển âm thầm với các biến chứng mạn tính là chủ yếu [9]. 2.3. Bệnh đái tháo đường thai kỳ Bệnh đái tháo đường thai kỳ được định nghĩa như một rối loạn dung nạp glucose, được chẩn đoán lần đầu tiên trong lúc mang thai. Định nghĩa này không loại trừ trường hợp bệnh nhân đã có ĐTĐ từ trước khi có thai nhưng chưa được chẩn đoán [8]. Nguyên nhân là do mang thai làm gia tăng nhu cầu insulin hơn bình thường, do sự gia tăng sản xuất hormone dẫn đến đề kháng insulin. Đa số trường hợp thai phụ trở về bình thường sau sinh, một số trường hợp thực sự trở thành ĐTĐ loại 1 hoặc loại 2, một số có thể bị lại ở lần sinh sau. Triệu chứng bệnh tương tự như ĐTĐ loại 2. Hầu hết bệnh ĐTĐ thai kỳ thường được chẩn đoán thông qua sàng lọc trước sinh [7]. 2.4. Các loại bệnh đái tháo đường khác Đây là loại bệnh đái tháo đường thứ phát gặp trong các trường hợp bệnh ĐTĐ khi mắc các bệnh nội tiết như bệnh cushing, to đầu chi [9]. Các bệnh liên quan đến gen ảnh hưởng đến tế bào β của tụy tạng, ảnh hưởng đến chức năng của insulin; bệnh của tụy tạng như viêm tụy tạng mãn tính, ung thư tuyến tuỵ, giải phẫu cắt bỏ tuỵ; bệnh gan như xơ gan; bệnh do nhiễm sắc tố sắt; bệnh do dùng thuốc corticoid, thuốc ngừa thai, lợi tiểu thidiazoxid, diazoxid là những nguyên nhân gây ra bệnh ĐTĐ thứ phát [8, 9]. -5-      3. Các biến chứng của bệnh đái tháo đường Hiểu biết đầy đủ về bệnh đái tháo đường là rất quan trọng, vì không kiểm soát được bệnh ĐTĐ, theo thời gian, bệnh có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mù, suy thận, tổn thương thần kinh, hoại tử các chi [7]. Các biến chứng được phân thành 2 loại là biến chứng cấp tính và biến chứng mạn tính [8]. 3.1. Biến chứng cấp tính Hôn mê là biến chứng cấp tính thường gặp nhất ở bệnh ĐTĐ do nhiều nguyên nhân như nhiễm ceton, tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ glucose huyết, acid lactic tăng cao trong máu [8]. 3.2. Biến chứng mạn tính Biến chứng mạn tính bao gồm biến chứng ở mạch máu lớn, biến chứng mạch máu nhỏ, biến chứng thần kinh, biến chứng nhiễm trùng và loét chân [8]. Các biến chứng này là nguyên nhân gây ảnh hưởng đến các cơ quan và hệ cơ quan trong cơ thể [12]. 3.2.1. Tim Bệnh đái tháo đường làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ. Nguyên nhân là động mạch của người bị bệnh ĐTĐ thường bị hẹp vì glucose cao, cholesterol và triglyceride (một loại mỡ trong máu) cao và huyết áp cao, mỡ tích tụ ở thành động mạch. Vì vậy, những người bị bệnh ĐTĐ thường dễ bị bệnh tim, đứt mạch máu não và bệnh động mạch ngoại biên [7]. 3.2.2. Thận Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây suy thận [7]. Đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong của bệnh ĐTĐ. Đa số các bệnh nhân bị biến chứng thận đồng thời có thay đổi ở đáy mắt nhưng nhiều bệnh nhân có thay đổi ở đáy mắt lại không có triệu chứng rõ của bệnh thận [8]. 3.2.3. Mắt Bệnh mắt có 2 loại do bệnh ĐTĐ gây ra: bệnh võng mạc ĐTĐ tăng sinh và bệnh võng mạc ĐTĐ không tăng sinh [7]. Trên toàn cầu, 1% mù loà có thể do bệnh ĐTĐ gây ra [10]. Nguyên nhân chính của bệnh mắt do bệnh ĐTĐ gây ra là những động mạch của võng mạc không cung cấp đủ máu cho võng mạc do -6-      những động mạch này có thể bị chảy máu hay rỉ những chất từ trong máu ra võng mạc làm ảnh hưởng tới thị giác của người bệnh [7]. Bệnh ĐTĐ cũng có thể gây nên bệnh cườm mắt hay bệnh cao nhãn áp [10]. 3.2.4. Hệ thần kinh Biến chứng thần kinh ảnh hưởng lên mọi cơ cấu của hệ thần kinh có lẽ chỉ trừ não bộ. Biến chứng gây nhiều khó khăn cho bệnh nhân dù ít khi gây tử vong. Cơ chế sinh bệnh do rối loạn chuyển hoá dẫn tới giảm myoinositol và tăng sorbitol, fructose trong dây thần kinh; ngoài ra còn có thiếu máu cục bộ do tổn thương vi mạch dẫn đến thoái biến myelin dây thần kinh và giảm tiêu thụ oxy. Biến chứng thần kinh hay gặp ở người bệnh ĐTĐ là viêm đa dây thần kinh ngoại biên, viêm đơn dây thần kinh và biến chứng thần kinh dinh dưỡng [8]. Người bị bệnh thần kinh ngoại biên có thể bị tê chân, cảm giác như bị kim chích. Bệnh làm cho người bị bệnh ĐTĐ dễ bị loét chân, nhiễm trùng. Trường hợp nặng có thể dẫn tới cưa ngón chân, cưa bàn chân và ngay cả cưa chân dưới hay trên đầu gối [7]. Biến chứng thần kinh dinh dưỡng hay còn gọi là biến chứng thần kinh tự chủ ảnh hưởng lên các cơ quan và hệ cơ quan như tim mạch, tiêu hoá, hệ niệu sinh dục, bất thường tiết mồ hôi, rối loạn vận mạch và teo cơ [8]. 4. Các phương pháp điều trị bệnh Mục tiêu chính của điều trị bệnh ĐTĐ là làm giảm lượng glucose huyết cao xuống mức bình thường nhằm cải thiện các triệu chứng của bệnh ĐTĐ và cả ngăn ngừa hay trì hoãn các biến chứng của bệnh [7]. Theo hướng dẫn năm 2013, các chuyên gia của Hiệp Hội ĐTĐ Mỹ (ADA) nhắc lại sự cần thiết của việc cá thể hoá mục tiêu điều trị. Đối với đa số bệnh nhân bệnh ĐTĐ trưởng thành không có thai, mục tiêu glycosylated hemoglobin (HbA1c) nhỏ hơn 7% là phù hợp. Tuy nhiên, HbA1c có thể thay đổi từ dưới 6,5% đến dưới 8% tuỳ theo các yếu tố như thời gian đã bị bệnh ĐTĐ, triển vọng sống, bệnh kèm theo, biến chứng mạch máu, nguy cơ hạ glucose huyết nặng. Bên cạnh mục tiêu HbA1c nhỏ hơn 7%, ADA còn khuyến cáo đạt mục tiêu glucose huyết trước ăn trong khoảng 70-130 mg/dl (3,9-7,2 mM/l) và glucose huyết sau ăn (được đo 1 – 2 giờ sau khi ăn) dưới 180 mg/dl (10,0 mM/l) đối với đa số bệnh nhân bệnh ĐTĐ trưởng thành không có thai [10]. -7-      4.1. Liệu pháp ăn uống Liệu pháp ăn uống là phương pháp trị liệu cơ bản nhất, dựa trên các nguyên tắc là tiêu thụ năng lượng trong phạm vi thích hợp; giữ được sự cân bằng về dinh dưỡng; bổ sung năng lượng và vitamin; tránh ăn quá độ và ăn uống thất thường [7]. 4.2. Biện pháp vận động Rèn luyện cơ thể có tác dụng tốt nhưng cần có sự phân biệt giữa bệnh ĐTĐ loại 1 và ĐTĐ loại 2, người bệnh hầu như có thể tham gia tất cả các hoạt động thể dục thể thao nhưng luyện tập phải phù hợp, đúng cách. Đối với bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ loại 2, nếu luyện tập đúng sẽ có tác dụng giảm glucose huyết thông qua cơ chế làm giảm tình trạng kháng insulin, bớt phải dùng thuốc [8]. 4.3. Các loại Insulin Insulin là hormone do tuyến tuỵ tiết ra khi lượng glucose trong máu cao. Hormone này có tên gọi xuất phát từ chữ La tinh insula (đảo) vì insulin được sản sinh do các tế bào β của đảo Langerhans của tuyến tuỵ [11]. Tác dụng chủ yếu của insulin là xúc tiến quá trình oxy hoá glucose, chuyển glucose thành lipid, kìm hãm sự phân giải glycogen ở gan, kìm hãm sự sản sinh thể ceton [11]. Khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúp glucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạt động của các tế bào. Khi thiếu insulin, các tế bào trong cơ thể sẽ không sử dụng được glucose, do đó, glucose trong máu sẽ tăng cao và xuất hiện trong nước tiểu [12]. Tính theo thời gian tác dụng (thời gian bắt đầu có tác dụng, thời gian có tác dụng tối đa và thời gian hết tác dụng) có 3 loại insulin thường được dùng hiện nay là insulin nhanh, insulin bán chậm và insulin hỗn hợp (hay insulin mixtard gồm 2 loại nhanh và bán chậm được trộn theo những tỉ lệ nhất định) [12]. 4.4. Một số thuốc trị bệnh đái tháo đường 4.4.1. Nhóm Sulphonylurea Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamide, Gliclazide, Glimepiride, Glipizide, Glinide thuộc nhóm Sulfonylurea là những thuốc điều trị bệnh ĐTĐ -8-      loại 2 được dùng phổ biến nhất, thuốc có tác dụng chính là kích thích tụy tạng tăng tiết insulin[12]. Tác dụng phụ của thuốc là gây tăng cân tuy không nhiều (1-2 kg) trong 3 tháng khi sử dụng thuốc thuộc nhóm này [13]. Hạ glucose huyết quá thấp thường hay gặp khi dùng thuốc Chlorpropamide và Glibenclamide, nhất là ở những bệnh nhân già, bệnh nhân có bệnh gan hoặc thận [12]. Tác dụng nguy hiểm hơn là tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch, thậm chí là gây tử vong [14]. 4.4.2. Thuốc Glucobay (Acarbose) Glucose huyết tăng sau bữa ăn khá phổ biến ở các bệnh nhân bệnh đái tháo đường loại 2. Enzym alpha-glucosidase có vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu thức ăn ở niêm mạc ruột non [12]. Thuốc có tác dụng ức chế enzyme alpha-amylase và enzyme alpha-glucosidase vì vậy sẽ làm chậm quá trình hấp thu carbohydrate ở đường tiêu hóa, nhờ đó làm giảm mức độ tăng glucose huyết sau bữa ăn [12, 15]. Thuốc có thể được dùng riêng lẻ cùng với chế độ ăn kiêng hoặc được dùng phối hợp với nhóm Sulfonylurea, Metformin hoặc Insulin [15]. Tác dụng phụ là gây đầy hơi và sôi bụng, đôi khi gây đau bụng và tiêu chảy, vì thuốc này làm chậm quá trình tiêu hóa chất bột đường (carbohydrate) trong đường ruột [12, 15]. Ngoài ra, các tác dụng phụ như ban đỏ, vàng da, ngứa, mày đay khi sử dụng thuốc này đã được báo cáo [16]. 4.4.3. Metformin Metformin được dùng làm thuốc điều trị đầu tiên cho những bệnh nhân ĐTĐ loại 2 có béo phì hoặc thừa cân do có tác dụng chính lên sự đề kháng insulin. Metformin có ưu điểm nổi bật là không làm tăng cân và cũng không gây hạ glucose huyết quá thấp [12]. Các tác dụng phụ của thuốc có thể là gây đầy bụng, buồn nôn, tiêu chảy. Tác dụng phụ này có thể tránh được khi sử dụng với liều thấp hơn và uống sau khi ăn. Nếu vẫn còn cảm giác đầy bụng và bị tiêu chảy sau khi đã sử dụng theo đúng khuyến cáo, chắc chắn phải ngưng uống Metformin. Metformin được khuyến cáo không nên dùng khi người bệnh có suy thận, suy gan, suy hô hấp. Những bệnh nhân lớn tuổi phải thận trọng khi dùng thuốc này [12]. -9-      4.4.4. Nhóm Thiazolidinedione (TZD) Các thuốc TZD có tác dụng làm tăng tác dụng của insulin tại các mô trong cơ thể nhưng không làm tăng tiết insulin. Ngoài ra còn có tác dụng làm giảm rối loạn mỡ máu [12]. Điều trị TZD thường gây tăng cân (khoảng 2-4 kg / 24 tháng), chủ yếu do làm tăng tích trữ mỡ dưới da và một phần do giữ nước. Vì vậy, việc sử dụng nhóm TZD cần thận trọng khi điều trị cho các bệnh nhân có bệnh tim, viêm gan hoặc có men gan tăng cao [12]. 4.4.5. Nhóm Meglitimide Nhóm này có tác dụng kích thích tế bào β của tụy tạng sản xuất insulin, có tác dụng tương tự Sufonylurea nhưng kích thích tiết insulin sớm hơn. Thuốc được dùng là Novonorm chỉ định trong điều trị bệnh ĐTĐ loại 2, được uống trước khi ăn 15-30 phút. Tác dụng xuất hiện nhanh (30 phút sau khi uống thuốc) nên Novonorm thường được uống vào đầu bữa ăn và làm giảm glucose huyết sau bữa ăn, không được uống thuốc nếu không ăn. Thuốc không dùng cho những trường hợp suy gan, thận, có thai, nhiễm trùng, phẫu thuật [12]. Theo các khuyến cáo mới của ADA thì khi dùng một loại thuốc mà không kiểm soát được glucose huyết thì nên điều trị phối hợp sớm 2 hoặc 3 loại thuốc uống với nhau hoặc với Insulin. Điều trị phối hợp rất có lợi vì cùng lúc nhiều thuốc tác dụng lên nhiều rối loạn khác nhau của quá trình sinh bệnh ĐTĐ loại 2 [12]. 4.5. Liệu pháp tế bào gốc Liệu pháp tế bào gốc là phương pháp hữu hiệu để chữa trị nhiều bệnh và bệnh ĐTĐ cũng không ngoại lệ. Đây là phương pháp hiện đại nhất hiện nay và có chi phí điều trị rất cao. Phương pháp này rất khó thực hiện vì phải cần có nguồn tế bào gốc tương thích mới có thể ghép [17]. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về tế bào gốc cũng đã có tiến triển tốt. Một nghiên cứu của công ty kỹ thuật tế bào gốc Novacell Inc tại San Diego đã nghiên cứu thành công quy trình tái tạo tế bào β của tuyến tuỵ từ tế bào gốc phôi thai người [18]. Bên cạnh đó, nghiên cứu của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh cũng đã khảo sát thành công sự biệt hoá của tế bào gốc trung mô máu -10-      cuống rốn người thành tế bào tiết insulin khi cảm ứng bằng môi trường có nồng độ glucose thấp và biệt hoá bằng môi trường có nồng độ glucose cao [19]. Ở người bình thường, các tế bào β khoẻ mạnh trong tuyến tuỵ sản xuất và giải phóng ra insulin để kiểm soát lượng glucose trong máu. Số lượng các tế bào β được duy trì qua quá trình sản sinh liên tục và thường xuyên. Tuy nhiên, ở bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ sự cân bằng bị mất đi [8]. Vì vậy, việc bảo vệ các tế bào còn lại và bổ sung một số lượng đủ các tế bào β là trọng tâm của liệu pháp tế bào gốc đối với bệnh ĐTĐ [17]. Phương pháp điều trị này cho phép bệnh nhân giảm hoặc thậm chí trong một số trường hợp ngưng sử dụng Insulin và thuốc hạ glucose huyết. Đồng thời, phương pháp này làm giảm các biến chứng mãn tính của bệnh ĐTĐ [17]. II. Giới thiệu về enzyme alpha-amylase Tên thông thường: alpha-amylase Tên hệ thống: 1,4-α-glucan 4-glucanhydrolase Mã số enzyme: EC 3.2.1.1 Khi tác dụng lên tinh bột enzyme α-amylase giải phóng ra glucose ở dạng α-D-glucose nên năm 1924, Kuhn gọi nó là α-amylase [20]. Enzyme α-amylase thuộc thành phần hệ enzyme amylase, là enzyme nội bào (endoenzyme) thuỷ phân liên kết alpha của phân tử polysaccharide như tinh bột và glycogen thành glucose và maltose [20]. Enzyme α-amylase được tìm thấy chủ yếu ở người và động vật có vú khác, ngoài ra, còn có trong một số loại hạt chứa tinh bột và một số loài nấm cũng tiết ra enzyme này [21]. 1. Thành phần hoá học và tính chất α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và acid aspartic. Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng acid amino cấu thành nên phân tử enzyme α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine [20] . -11-      Phân tử lượng của các α-amylase từ các nguồn khác nhau rất gần nhau. Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc 45-50 kDa. Trọng lượng phân tử của α-amylase hạt thóc đang nảy mầm (malt) là 59 kDa. Do kích thước phân tử lớn nên enzyme này không đi qua được màng bán thấm của tế bào [20]. Toàn bộ cấu trúc không gian của phân tử enzyme có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc tác của enzyme. Tuy nhiên, hoạt động của enzyme liên hệ trực tiếp với một phần xác định trong phân tử enzyme [22]. Trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase có chứa các nhóm –COOH và –NH2, là phần trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hoá cơ chất (tinh bột hay glycogen) thành sản phẩm phản ứng. Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 – 5,7 [20]. α-amylase là enzyme một thành phần có chứa ion kim loại (metaloenzyme) [23]. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Canxi tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme. Do đó, canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết canxi thì sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất [20]. 2. Cơ chế tác dụng α-amylase không chỉ có khả năng thuỷ phân hồ tinh bột mà còn có khả năng thuỷ phân cả hạt tinh bột nguyên vẹn song với tốc độ rất chậm. Sự thuỷ phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn. Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp. Giai đoạn này được gọi là giai đoạn dextrin hoá. Sang giai đoạn đường hoá, các dextrin phân tử thấp tiếp tục bị thuỷ phân để tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod. Tetra-trimaltose bị thuỷ phân rất chậm bởi α-amylase cho tới maltose và glucose. Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi -12-      là polyglucose (6-7 gốc glucose) dưới tác dụng của α-amylase, sau đó các oligosaccharide này tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thuỷ phân amylose là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của enzyme α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin [20]. Khả năng dextrin hoá của α-amylase rất cao do đó người ta còn gọi enzyme α-amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá [20]. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường, α-amylase chỉ thuỷ phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose [20]. 3. Tính đặc hiệu Do cấu trúc lý hoá đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với các chất xúc tác thông thường khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hoá một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hoá. Tính đặc hiệu của enzyme α-amylase thể hiện ở kiểu đặc hiệu cơ chất. α-amylase chỉ xúc tác cho phản ứng thuỷ phân, chuyển hoá cơ chất là tinh bột và glycogen [22]. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên [23]. 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme α-amylase Nồng độ cơ chất là một trong những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến tốc độ phản ứng của α-amylase [20]. Khi nồng độ cơ chất cao hơn nồng độ enzyme, tất cả enzyme sẽ liên kết cùng lúc với cơ chất, như vậy phản ứng càng xảy ra nhanh hơn [22]. -13-      Các enzyme trong hệ enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Vì vậy, hoạt động của enzyme α-amylase bị ảnh hưởng khi có mặt các kim loại nặng [20]. Bên cạnh đó, các chất kìm hãm như Acarbose, Tanin có tác động mạnh đến hoạt tính enzyme α-amylase bằng cách kìm hãm theo hướng cạnh tranh hay phi cạnh tranh, kết quả là làm ảnh hưởng sự liên kết giữa trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất [15, 21, 24]. α-amylase được trích từ các nguồn khác nhau thì có điều kiện hoạt động khác nhau. Ví dụ như biên độ pH thích hợp cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ vi sinh vật; pH thích hợp cho hoạt động của α-amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4,7-5,4) [20]; còn α-amylase trích từ dịch tuỵ thì hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6,8-7,2 [11]. α-amylase trong nước bọt và dịch tuỵ của người thì giống nhau, nhưng khác với α-amylase thu được từ tuỵ lợn về độ hoà tan, pH thích hợp và một số tính chất khác [22]. Sự kết hợp giữa nhiệt độ và pH cũng là yếu tố làm ảnh hưởng đến độ bền của enzyme α-amylase. Tuy nhiên so với các loại amylase khác thì độ bền với nhiệt của α-amylase cao hơn. Ở 0°C và pH 3,6, α-amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính. α-amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ trong khoảng 58-60°C [20]. Các nghiên cứu đã cho thấy enzyme này hoàn toàn không hoạt động ở hạt khô. Hoạt tính của enzyme α-amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt, tuy nhiên ở nhiệt độ khác nhau thì hoạt tính đạt tối ưu vào những thời điểm khác nhau. Chẳng hạn khi cho hạt nảy mầm ở nhiệt độ 15-17°C, hoạt tính của αamylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10-12 của quá trình nảy mầm; khi ở nhiệt độ 28-30°C, hoạt tính của α-amylase đạt đến cực đại ở ngày thứ 5-8 [20]. Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi cho hoạt động của các enzyme amylase khi ở nhiệt độ cao. Đối với enzyme α-amylase, dưới tác động của tia tử ngoại với điều kiện nhiệt độ cao, enzyme này nhanh chóng bị mất hoạt tính [22]. -14-      III. Sơ lược về cây Cau Trắng 1. Phân loại và định danh Tên khoa học: Veichia merrillii Wendl. Tên tiếng Việt: Cau Trắng Tên tiếng Anh: Christmas Palm, Manila Palm. Khoá phân loại Giới: Thực vật Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Arecales Họ: Arecaceae Chi: Veitchia Loài: Veitchia merrillii Wendl. [25] 2. Nguồn gốc và phân bố Cau Trắng là một loại cau phổ biến, thường được trồng để làm kiểng. Cau có nguồn gốc từ philippines, được tìm thấy trên đảo Palawan. Chi Veitchia có 9 loài, thường gặp ở các trung tâm đa dạng phía đông Thái Bình Dương trên các đảo Vanuatu, Fiji và Tonga. Loài Cau Trắng này được trồng nhiều ở vùng nhiệt đới [26]. 3. Đặc điểm thực vật Cây Cau Trắng thuộc loại đại mộc nhỏ. Cây có thể cao đến 9 m; thân cây to, có đường kính 10-20 cm, lóng rất ngắn. Lá có màu xanh đậm, dài khoảng 1,5 m; lá phụ hẹp nhọn, rộng 3 cm, dài khoảng 40-50 cm; cuống lá màu lục rất nhạt. Buồng Cau mọc ở nách lá, mỗi buồng phân thành nhiều nhánh nhỏ, mỗi nhánh mang nhiều hoa; hoa có màu trắng. Trái hình bầu dục, dài từ 2-3,5 cm; trái non có màu xanh, trong ruột chứa nhiều nước; trái phát triển càng to thì ruột càng nhiều và chứa ít nước; trái già vẫn có vỏ màu xanh nhưng ruột rất cứng và không còn nước; đến khi chín, trái có màu đỏ, vỏ mềm chứa nước [25]. -15-      Hình 1. Buồng Cau Trắng ở trên cây và cây Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) Thông tin về thành phần hoá học và tác dụng dược lí của trái Cau Trắng hiện nay chưa được tìm thấy. -16-      PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM I. Phương tiện 1. Địa điểm và thời gian thực hiện Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm Sinh học và phòng thí nghiệm Hoá học của Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. 2. Mẫu vật, hoá chất và thiết bị 2.1. Mẫu vật Trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) không được phun xịt thuốc bảo vệ thực vật, được thu hái tại Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ, Thành Phố Cần Thơ. 2.2. Hoá chất Một số hoá chất được dùng trong đề tài: enzyme α-amylase trích từ tuỵ heo (Sigma – Aldrich – Mỹ), tinh bột (Trung Quốc), thuốc Acarbose (Wako – Nhật), Dimethylsulfoxide (DMSO) (Meck – Đức), ethanol 96°, HCl đậm đặc, Iodine, KI, Na2HPO4, NaH2PO4. 2.3. Thiết bị Máy đo quang phổ Beckman Coulter 640B (Mỹ), máy cô quay chân không Heidolph (Đức), máy đo pH Metler Toledo, máy khuấy từ, máy trộn mẫu Vortex, máy ổn nhiệt, cân phân tích AB104 (Thuỵ Sĩ), eppendorf, micropipette và một số dụng cụ khác. II. Phương pháp thí nghiệm 1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu Buồng Cau được thu hái và được xác định phần ruột của trái Cau là ở giai đoạn trung gian giữa non và già trước khi xử lý. Trái Cau ở giai đoạn trung gian sẽ có phần ruột mềm, ở giữa có lỗ rỗng chứa nước như Hình 2. -17-      Độ ẩm tương đối của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô được xác định theo công thức sau : trọng lượng tươi (g) – trọng lượng khô (g) H% = Í 100 trọng lượng tươi (g) H% là ký hiệu độ ẩm tương đối của nguyên liệu, biểu thị lượng nước có trong ruột trái Cau Trắng. Giá trị H% càng cao chứng tỏ ruột trái Cau Trắng càng chứa nhiều nước. 2. Phương pháp chiết cao thô ruột trái Cau Trắng bằng dung môi ethanol Buồng Cau được thu về và chọn ra những trái có ruột mềm như Hình 2, sau đó trái Cau được tách lấy phần ruột, đem phơi khô, nghiền nhỏ. Sau khi nghiền, đem ngâm trong ethanol 96°, 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọc lấy phần dịch và cô cạn thành cao bằng hệ thống máy cô quay để loại bỏ ethanol. Cao thô ethanol thu được từ mẫu ruột của trái Cau Trắng được trữ lạnh ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm. Hình 2. Trái Cau Trắng ở giai đoạn trung gian giữa non và già được chẻ đôi. -18-      3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột Thí nghiệm được thực hiện gồm 10 ống nghiệm với các nồng độ Acarbose lần lượt từ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09 đến 0,1 mg/ml; một ống đối chứng có nồng độ Acarbose bằng 0 mg/ml và một ống chứa nồng độ tinh bột ban đầu có nồng độ enzyme và nồng độ Acarbose bằng 0 mg/ml. Mỗi ống nghiệm được lặp lại 3 lần. Thuốc Acarbose được pha trong nước cất thành dung dịch gốc nồng độ 100 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các nồng độ tương ứng với các nồng độ Acarbose được sử dụng trong thí nghiệm. Enzyme α-amylase được pha trong dung dịch đệm phosphate natri pH 7 thành nồng độ 1 mg/ml tương đương 30 U/ml (U). Tinh bột được pha trong nước cất thành nồng độ 2 mg/ml và đun bằng lò vi sóng cho đến khi tan hết. Thí nghiệm được thực hiện như sau: hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl dung dịch đệm phosphate natri pH 7 với 100 µl Acarbose nồng độ lần lượt từ 0,1 đến 1 mg/ml và 50 µl enzyme α-amylase nồng độ 30 U được đem ủ ở nhiệt độ 37°C trong 10 phút. Sau đó, 250 µl tinh bột nồng độ 2 mg/ml được cho vào hỗn hợp trên và ủ tiếp tục ở 37°C trong 10 phút. Tiếp theo, 200 µl dung dịch HCl đậm đặc được cho vào để ngừng phản ứng trong hỗn hợp và 300 µl dung dịch thuốc thử iod để nhận biết lượng tinh bột còn thừa sau khi dừng phản ứng dựa trên phản ứng màu xanh đặc trưng của phức hợp tinh bột-iod. Nồng độ tinh bột được sử dụng trong phản ứng là 0,5 mg/ml; nồng độ enzyme là 1,5 U và nồng độ Acarbose lần lượt là 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1 mg/ml. Nồng độ tinh bột và nồng độ enzyme trên được cho là phù hợp để sử dụng dựa trên kết quả nghiên cứu khảo sát khả năng ức chế hoạt động enzyme αamylase của cao chiết lá Nhàu của Lê Bá Tước và Mã Thanh Tòng [27]. Cách thu nhận kết quả: hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 660 nm để xác định lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng thông qua kết quả mật độ quang (OD). Bước sóng 660 nm là bước sóng tối ưu nhạy với phức hợp tinh bột-iod, đã được khảo sát bởi các nghiên cứu trước đây [28, 29]. -19-      Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất phản ứng và hiệu suất ức chế. Hiệu suất phản ứng được tính dựa trên lượng tinh bột còn dư sau khi đã ngừng phản ứng thuỷ phân lại. Hiệu suất phản ứng (%) = 100 x ((A0 – A1)/A0) A0: Giá trị đo mật độ quang (OD) của dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu) A1: Giá trị đo mật độ quang (OD) của dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột còn lại sau phản ứng) Hiệu suất ức chế là lượng enzyme bị ức chế trong phản ứng. Hiệu suất ức chế (%) = 100% – hiệu suất phản ứng (%) 4. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột Thí nghiệm được thực hiện gồm 6 nghiệm thức với các nồng độ cao thô ruột trái Cau Trắng lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 và 1,2 mg/ml; một ống nghiệm chứa nồng độ tinh bột ban đầu có nồng độ enzyme và cao thô bằng 0 mg/ml và một ống đối chứng có nồng độ cao thô bằng 0 mg/ml. Mỗi ống nghiệm được lặp lại 3 lần. Cao thô ruột trái Cau Trắng được pha trong dung dịch DMSO thành nồng độ 100 mg/ml, sau đó hỗn hợp được trộn đều bằng máy Vortex để hoà tan cao. Tiếp tục, hỗn hợp được li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Phần dịch chiết thu được sẽ được pha loãng ra trong dung dịch DMSO ở các nồng độ tương ứng với các nồng độ Acarbose được sử dụng trong thí nghiệm. Nghiên cứu trước đây trên cao chiết lá Nhàu cũng đã chứng minh dung môi DMSO không làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme α-amylase trong phản ứng thuỷ phân tinh bột [27]. Trong thí nghiệm, nồng độ tinh bột được sử dụng là 0,5 mg/ml; nồng độ enzyme là 1,5 U; nồng độ cao thô lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 và 1,2 mg/ml. Phản ứng được thực hiện tương tự mục 3 với Acarbose được thay thế bằng cao thô RTCT. -20-      Cách thu nhận kết quả: hỗn hợp trên được đo độ hấp thu quang phổ của phức hợp tinh bột-iod ở bước sóng 660 nm để xác định lượng tinh bột thừa sau phản ứng. Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất phản ứng và hiệu suất ức chế được tính tương tự như mục 3. 5. Phương pháp xử lí kết quả Số liệu thu được từ các thí nghiệm được tính toán, phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16, vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel và kết quả được trình bày dưới dạng hiệu suất ức chế ± SEM. -21-      PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu Ruột trái Cau Trắng tươi được tách ra từ trái Cau Trắng được cân để xác định trọng lượng tươi. Mẫu tươi được phơi nắng cho đến khi trọng lượng không đổi. Độ ẩm được tính toán bằng công thức được trình bày trong phần phương pháp thí nghiệm. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Độ ẩm của ruột trái Cau Trắng Tên mẫu Ruột trái Cau Trắng Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Độ ẩm (%) 957 167 82,55 Độ ẩm của ruột trái Cau Trắng cao (82,55%) cho thấy lượng nước mất đi là đáng kể. Trong quá trình phát triển của trái, độ ẩm càng cao khi ở giai đoạn non và càng thấp khi Cau già. Ở giai đoạn còn non, ruột Cau rỗng, hầu như là nước, phần thịt Cau rất ít, dính sát vào vỏ, rất khó tách ra; ở giai đoạn trung gian giữa trái Cau non và trái Cau già, ruột Cau chứa ít nước và phần thịt dày lên, mềm, dễ tách ra khỏi vỏ. Khi Cau già thì hầu như ruột Cau không còn nước, phần thịt khô cứng lại, vì vậy độ ẩm thấp. Như vậy, kết quả xác định độ ẩm của RTCT là 82,55% phù hợp với thực tế. Các giai đoạn trưởng thành của trái Cau được trình bày trong Hình 3, thể hiện phần ruột bên trong ở từng giai đoạn khác nhau. Qua đó cho thấy sự khác nhau về độ rỗng cũng như khả năng chứa nước bên trong trái non, trái trung gian và trái già. Hình 3. Phần ruột của trái Cau ở các giai đoạn phát triển. -22-      II. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng, tuy nhiên để kết quả khảo sát có tính thuyết phục hơn thì hiệu quả ức chế cần phải so sánh với một chất được biết có khă năng ức chế enzyme α-amylase. Hiện nay, thuốc Glucobay đang được sử dụng lâm sàng, được biết trong điều trị bệnh ĐTĐ loại 2 với khả năng làm ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-glucosidase [16]. Thuốc có thành phần chính là chất acarbose (một tetrasaccharide) nên thường được gọi là thuốc Acarbose. Vì vậy, thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose được thực hiện với kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2: Ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của Acarbose lên hoạt tính enzyme α-amylase. Nồng độ Acarbose (mg/ml) Hiệu suất ức chế (%) 0 0a 0,01 12,38b ± 0,444 0,02 33,84c ± 0,361 0,03 52,98d ± 0,471 0,04 58,53e ± 0,384 0,05 63,28f ± 0,46 0,06 68,04g ± 0,565 0,07 77,64h ± 0,683 0,08 78,31h ± 0,423 0,09 81,29i ± 0,629 0,1 86,13j ± 0,497 Ghi chú: các chữ cái theo sau các giá trị trong một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%. -23-      Kết quả trình bày trong Bảng 2 đã thể hiện rõ khả năng ức chế enzyme αamylase của Acarbose thông qua hiệu suất ức chế được xác định từ nồng độ Acarbose 0,01 đến 0,1 mg/ml. Điều này chứng tỏ Acarbose có khả năng kìm hãm trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase kết hợp với cơ chất là tinh bột nên khi tăng nồng độ chất kìm hãm là Acarbose thì lượng tinh bột còn lại sau phản ứng càng tăng làm cho hiệu suất phản ứng thấp hay nói cách khác lượng enzyme bị ức chế càng nhiều. Tuy nhiên, khi nồng độ Acarbose được tăng gấp đôi thì hiệu suất ức chế không tăng lên gấp đôi. Điều này cho thấy, lượng enzyme bị ức chế phụ thuộc vào từng nồng độ Acarbose. Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose. Kết quả được trình bày ở Hình 4 cho thấy hiệu suất ức chế tăng từ nồng độ Acarbose thấp nhất là 0,01 mg/ml đến nồng độ có lượng enzyme bị ức chế cao nhất (86,13% ± 0,497) là nồng độ 0,1 mg/ml Acarbose. Hiệu suất ức chế cũng -24-      chính là lượng enzyme bị ức chế được tính trong thí nghiệm. Hầu hết các kết quả thu được đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%, ngoại trừ nồng độ Acarbose 0,07 và 0,08 mg/ml ức chế hoạt động của enzyme ở mức phần trăm lần lượt là 77,64% ± 0,683 và 78,31% ± 0,423 không có khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Trong mỗi thí nghiệm khảo sát hoạt tính hay khả năng ức chế của một chất đối với enzyme cũng cần phải so sánh với một mẫu chuẩn để định lượng cũng như đánh giá khả năng cần khảo sát của mẫu được thí nghiệm. Vì vậy, trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol RTCT của đề tài cũng phải xây dựng đường chuẩn để so sánh. Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô RTCT được so sánh với hiệu quả ức chế enzyme này của thuốc trị bệnh ĐTĐ nhằm đánh giá hiệu quả tác động của cao thô RTCT. Trong đề tài này, Acarbose được sử dụng như một mẫu chuẩn để xây dựng phương trình đường chuẩn. Từ đó, khả năng ức chế enzyme α-amylase của RTCT được xác định tương đương với nồng độ Acarbose. Đường chuẩn thể hiện kết quả ức chế enzyme α-amylase của Acarbose tăng tuyến tính với nồng độ Acarbose. Phương trình đường chuẩn được xây dựng với mục đích xác định giá trị ức chế 50% enzyme (IC50) của Acarbose và hàm lượng chất ức chế có trong cao thô. -25-      Hình 5. Đường chuẩn khả năng ức chế hoạt động enzyme α-amylase của Acarbose. Giá trị nồng độ Acarbose ức chế 50% lượng enzyme (IC50) là 0,036 mg/ml, được tính dựa vào phương trình đường chuẩn Acarbose y = 621,8x + 27,662 với y là phần trăm enzyme bị ức chế và x là nồng độ Acarbose. Cụ thể với các nồng độ Acarbose được chọn trình bày trong Hình 5 có thể thấy các điểm chấm thể hiện kết quả ức chế enzyme của các nồng độ Acarbose 0; 0,02; 0,06; 0,08 và 0,1 mg/ml tập trung gần sát đường chuẩn và tăng theo hướng đường chuẩn; tuy nhiên điểm chấm ở nồng độ Acarbose 0,04 mg/ml nằm cách xa đường chuẩn, điều này đã làm giảm mối tương quan giữa nồng độ Acarbose và lượng enzyme bị ức chế nên R-sq chỉ đạt 93,976%. Mặc dù vậy, trong phương trình hồi quy tuyến tính của nồng độ Acarbose với hiệu suất ức chế ở phụ lục A cho thấy nồng độ Acarbose 0,04 mg/ml vẫn nằm trong khoảng tin cậy 95% và phần lớn khả năng ức chế enzyme α-amylase ở các nồng độ Acarbose 0,02; 0,06; 0,08 và 0,1 mg/ml tăng tuyến tính nên chọn các điểm nồng độ trên để xây dựng đường chuẩn. Hệ số xác định R2 = 0,93976 khá cao có nghĩa là mối liên hệ giữa lượng enzyme bị ức chế và nồng độ Acarbose chặt chẽ, hay nói cách khác, phương trình đường chuẩn -26-      y = 621,8x + 27,662 được xây dựng có ý nghĩa về mặt thống kê và có thể dự đoán nồng độ Acarbose thông qua lượng enzyme bị ức chế. III. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chiết ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột Trong những năm gần đây, không ít người trên thế giới đang phải đối mặt với những hậu quả nặng nề do bệnh ĐTĐ gây ra. Vì vậy, các nhà khoa học luôn quan tâm nghiên cứu những phương pháp điều trị bệnh, đặc biệt là hữu hiệu trong việc làm giảm glucose huyết tạm thời cho người mắc bệnh ĐTĐ. Một mặt có thể khống chế và ngăn ngừa bệnh tiến triển nặng hơn, mặt khác có thể giảm đi những biến chứng nguy hiểm của bệnh. Song song đó, từ việc nghiên cứu các chất trong thực vật có khả năng ức chế một số enzyme thuỷ phân tinh bột in vitro đến nghiên cứu trên chuột mắc bệnh ĐTĐ đã được rất nhiều công trình nghiên cứu ở một số trường đại học trên thế giới áp dụng và công bố thành công. Kết quả chứng minh được khả năng hạ glucose huyết ở các loài thực vật như Đậu Tây (Phaseolus vulgaris) [30], Sen (Nelumbo nucifera) [31], Ổi (Psidium guajava) [32]. Ở Việt Nam cũng có không ít nghiên cứu liên quan đến việc giảm glucose huyết trên rễ cây Nhàu [28], Khổ Qua [29] được công bố. Và đề tài này đã xác định được khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) ở mức đáng kể. Ruột trái Cau Trắng được tách ra từ trái Cau Trắng nguyên vẹn ở giai đoạn trung gian trong quá trình phát triển và qua các bước xử lý để cô cạn thành cao thô ethanol. Thí nghiệm sử dụng cao thô RTCT để khảo sát khả năng cao thô ức chế hoạt tính của enzyme α-amylase in vitro. Dựa vào phương trình đường chuẩn Acarbose y = 621,8x + 27,662 (R2 = 0,93976), hàm lượng chất ức chế enzyme α-amylase có trong cao thô tương đương với nồng độ Acarbose được xác định. Kết quả được trình bày trong Bảng 3. -27-      Bảng 3: Hàm lượng chất ức chế có trong cao thô ethanol RTCT tương đương với nồng độ Acarbose (mg/ml). Nồng độ cao thô Hiệu suất enzyme bị Hàm lượng chất ức chế ethanol RTCT ức chế (%) có trong cao thô (mg/ml) tương đương với nồng độ Acarbose (mg/ml) 0 0a 0 0,2 30,66b ± 1,75 Không xác định 0,4 44,16c ± 0,557 0,027 0,6 52,97d ± 1,91 0,041 0,8 79,84e ± 1,34 0,084 1 89,8f ± 1,02 Không xác định 1,2 90,18f ± 0,647 Không xác định Ghi chú: các chữ cái theo sau các giá trị trong một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%. Kết quả trình bày ở Bảng 3 cho thấy khi tăng nồng độ cao thô ethanol RTCT thì nồng độ Acarbose tương ứng cũng tăng theo. Điều này cho thấy cao thô RTCT có chứa thành phần hoá học có khả năng kìm hãm trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase cũng giống như Acarbose. Như vậy, nồng độ cao thô từ 0,4; 0,6 và 0,8 mg/ml tương đương với nồng độ Acarbose được xác định lần lượt là 0,027; 0,041 và 0,084 mg/ml. Do lượng enzyme bị ức chế ở nồng độ cao thô 0,2; 1 và 1,2 mg/ml không nằm trong khoảng phần trăm enzyme bị ức chế của đường chuẩn đã dựng nên không xác định được. Kết quả còn cho thấy khi tăng nồng độ cao thô RTCT lên thì hiệu suất ức chế enzyme cũng tăng theo. Lượng enzyme α-amylase bị ức chế khá cao ở nồng độ cao thô 0,2 mg/ml (30,66% ± 1,75). Điều này chứng tỏ ở nồng độ cao thô này có chứa khá nhiều hàm lượng chất ức chế enzyme. Tiếp tục, nồng độ cao thô được tăng lên 0,4 mg/ml (44,16% ± 0,557) thì khả năng ức chế enzyme được cho là tăng đáng kể dựa trên kết quả xử lí thống kê ở phụ lục B là khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Ở nồng độ cao thô 0,6 mg/ml với hiệu quả ức chế là 52,97% ± 1,91 có sự -28-      chênh lệch khá cao với nồng độ cao thô 0,4 mg/ml. Với chiều hướng đó, lượng enzyme bị ức chế vẫn tăng với hiệu suất ức chế 79,84% ± 1,34 khi tăng nồng độ cao thô lên 0,8 mg/ml. So với nồng độ cao thô 0,6 mg/ml, lượng enzyme bị ức chế đã tăng thêm rất cao và có khác biệt về mặt thống kê. Tiếp tục, khả năng ức chế enzyme tăng khi tăng nồng độ cao thô lên 1 mg/ml (89,8% ± 1,02). Tuy nhiên, với nồng độ cao thô 1,2 mg/ml (90,18% ± 0,647) lượng enzyme bị ức chế vẫn tăng nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% dựa trên kết quả thống kê ở phụ lục B, hay nói cách khác, hiệu suất ức chế của nồng độ cao thô RTCT 1 và 1,2 mg/ml không khác biệt trong phản ứng có cùng một nồng độ tinh bột 0,5 mg/ml đóng vai trò là cơ chất với nồng độ enzyme 1,5 U chứng tỏ trung tâm hoạt động của enzyme đã bão hoà nên hiệu suất ức chế chỉ tăng đến một giá trị nhất định và không tăng thêm nữa. Vì vậy, việc tăng thêm nồng độ cao thô đồng nghĩa với việc nồng độ chất ức chế có trong cao thô được tăng lên không có ý nghĩa bởi không làm tăng hiệu suất ức chế. Nên việc khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của RTCT dừng lại ở nồng độ cao thô RTCT 1,2 mg/ml. Nồng độ ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol RTCT cao nhất được khảo sát trong thí nghiệm này là 1,2 mg/ml với hiệu quả ức chế đến 90,18% ± 0,647. Việc xác định hàm lượng chất ức chế có trong cao thô tương đương với nồng độ Acarbose giúp định lượng tương đối khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô, tuy nhiên để xem xét mức độ ảnh hưởng của cao thô RTCT đến hoạt tính enzyme này như thế nào so với Acarbose thì cần phải xác định nồng độ ức chế 50% enzyme (IC50) của cao. Dựa trên kết quả đường chuẩn của cao thô ở phụ lục B, giá trị IC50 của cao thô RTCT được xác định là 0,503 mg/ml. So với IC50 của Acarbose là 0,036 mg/ml thì IC50 của cao thô cao hơn gấp 13,97 lần. Điều này cho thấy phải cần lượng lớn cao thô mới đạt hiệu suất ức chế 50%. Tuy thuốc Acarbose có hiệu quả ức chế enzyme α-amylase cao nhưng có giá thành đắt và nhiều tác dụng không mong muốn [33]. Do vậy, khả năng ức chế được hoạt động của enzyme α-amylase của cao thô RTCT được phát hiện là một thông tin rất có ích và khả quan bởi Cau Trắng là một loài cây kiểng được trồng phổ -29-      biến và sẽ là một nguồn thảo dược lớn, rẻ tiền khi được đưa vào sử dụng làm thực phẩm chức năng trong điều trị bệnh ĐTĐ. Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh một trong các phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 2 là làm giảm mức glucose huyết thông qua sự ức chế enzyme thuỷ phân carbohydrate là alpha-amylase [34]. Enzyme α-amylase là một trong những sản phẩm tiết chính của tuyến tuỵ và tuyến nước bọt, đóng vai trò quan trọng thực hiện bước đầu tiên trong việc tiêu hoá tinh bột và glycogen [35]. Việc ức chế enzyme này sẽ làm đình trệ việc tiêu hoá carbohydrat của các enzyme khác. Vì vậy, nếu ức chế được hoạt động của enzyme α-amylase sẽ làm quá trình thuỷ phân tinh bột chậm lại. Như vậy, lượng glucose được tạo ra từ từ nên glucose huyết sẽ giảm. Bệnh ĐTĐ có mức glucose huyết cao nên ức chế enzyme α-amylase cũng là một trong các mục tiêu giúp hạ glucose huyết trong trị bệnh ĐTĐ. Do đó, enzyme α-amylase đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh ĐTĐ. Chính vì vậy, đề tài được thực hiện và đã chứng minh được khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng như là một thông tin hữu ích để tạo cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu hướng đến điều trị bệnh ĐTĐ. -30-      PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. Kết luận Cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng nồng độ 1,2 mg/ml có khả năng ức chế enzyme α-amylase đến 90,18% ± 0,647 trong phản ứng chuyển hoá tinh bột. Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol RTCT (IC50 = 0,503 mg/ml) thấp hơn thuốc thương mại Acarbose (IC50 = 0,036 mg/ml) 13,97 lần. II. Kiến nghị Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) ở chuột bị bệnh ĐTĐ. Nghiên cứu xác định thành phần hoá học có khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.). -31-      TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Danaei G, Finucane MM, Lu Y, Singh GM, Cowan MJ, Paciorek CJ et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participant. Lancet, 2011, 378 (9785): 31 – 40. 2. Zhang P, Zhang X, Brown J, Vistisen D, Sicree R, Shaw J, Nichols G. Global healthcare expenditure on diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract 2010; 87: 293 – 301. 3. Global health risks. Mortality and burden of disease attributable to selected major risks. Geneva, World Health Organization, 2009. 4. Mathers CD, Loncar D. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PloS Med, 2006, 3 (11): e442. 5. Nguyễn Quang Bảy. [online] [truy cập ngày 10/2/2014] 6. [truy cập ngày 23/3/2014]. 7. Đỗ Trung Quân, 2006. Biến chứng bệnh đái tháo đường và điều trị. NXB Y học. 8. Nguyễn Thị Bay, 2007. Bệnh học và điều trị nội khoa. NXB Y học Hà Nội. Tr 327-364. 9. Silvio P. Marriotti. Global data on visual impairments 2010. Geneva, World Health Organization, 2012. 10. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes – 2013. Diabetes Care 2013; 36 (suppl 1): S11 – S66. 11. Trần Tố, Cù Thị Thuý Nga, 2008. Sinh hoá học động vật. NXB Nông nghiệp Hà Nội. Tr 111, 124 – 137. -32-      12. Silvio E. Inzucchi, 2002. Oral Anihyperglycemic Therapy for Type 2 Diabetes. Scientific Review and Clinical Applications. Reprinted by JAMA, 2002. Vol 287, page: 360-372. 13. United Kingdom Prospective Diabetes Study Group, 1998. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). The Lancet, vol 352, September 12, 1998. Page: 840-846. 14. Rodger N.W, 1999. Sulphonylureas and Heart Disease in Diabetes Management. Diabetes spectrum. Page: 95-97. 15. Cheng AYY, Fantus IG, 2005. Oral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetes mellitus. Canadian Medicinal Association Journal, 172(2): 213226. 16. Bộ Y Tế, 2011. Công Báo số 119 + 120: Quyết định về việc ban hành Dược thư quốc gia Việt Nam, lần xuất bản thứ 2, tập I. Số 4447/QĐ-BYT. Tr 8-11. 17. [truy cập ngày 20/5/2013] 18. Novacell Inc, 2008. Production of β cells from human embryonic stem cells. Diabetes, Obesity and Metabolism, 10 (Suppl. 4): 186 – 194. San Diego, USA. 19. Đặng Thị Tùng Loan và ctv, 2008. Khảo sát sự biệt hoá của tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin. Hội nghị khoa học lần thứ 6, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr 259. 20. Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ enzyme. NXB TP.HCM. 21. Lê Thanh Hải, 2013. Công nghệ enzyme. Trường Cao Đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM. Tr 2. 22. Đỗ Quý Hai, 2008. Giáo trình công nghệ và ứng dụng enzyme. Đại học Huế. Tr 52-56, 64-69, 74-89. -33-      23. MacGregor EA, Stefan Jannecek, Birte Swensson, 2001. Relationship of sequence and structure to specificity in the α-amylase family of enzymes. Biochimica et Biophysica Acta. 1546 (2001) 1 – 20. 24. Kandra L, Gyemant G, Zajacz A, Batta G, 2004. Inhibitory effects of tannin on human salivary alpha-amylase. Biochem Biophys Res Commun 2004 Jul 9; 319 (4): 1265-71. PMID: 15194503. 25. Phạm Hoàng Hộ, 2003. Cây cỏ Việt Nam quyển III. NXB Trẻ. 9369, tr 417. 26. Johnson D., 1998. Adonidia merrillii. In : IUCN 2006, Red List of threatened species. 27. Lê Bá Tước, Mã Thanh Tòng, 2013. Khảo sát khả năng ức chế enzyme αamylase của cao chiết lá Nhàu (Morinda citrifolia L.). Đề tài nghiên cứu cấp trường trường Đại Học Cần Thơ. 28. Nguyễn Bình Đông, 2010. Khảo sát khả năng ức chế enzyme Glucoamylase từ cao rễ Nhàu (Morinda citrifolia L.). Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành sinh học, trường Đại học Cần Thơ. 29. Trần Thành Đạt, 2011. Khảo sát khả năng ức chế enzyme γ-amylase của cao chiết Khổ Qua (Momordica charantina Linn.). Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ. 30. Obiro WC, Zhang T, Jiang B. The nutraceutical role of the Phaseolus vulgaris alpha-amylase inhibitor. Br J Nutr, 2008; 100 (1): 1 – 12. PMID: 18331662. 31. Mukherjee PK, Saha K, Pal M, Saha BP. Effect of Nelumbo nucifera rhizome extract on blood sugar level in rats. J ethnopharmacol, 1997; 58 (3): 207 – 13. PMID: 9421256. 32. Kuang QT, Zhao JJ, Ye CL, Wang JR, Ye KH, Zhang XQ, Wang Y, Ye WC. Nephro-protective effects of total triterpenoids from Psidium guajava leaves on type 2 diabetic rats. Zhong Yao Cai, 2012; 35 (1): 94 – 7. PMID: 22734419. 33. -34-      34. Funke I, Melzing MF, 2006. Traditionally used plants in diabetes therapy-phytotherapeutics as inhibitors of α-amylase activity. Rev Bras Farmacogn, 16: 1-5. 35. Kandra L., 2003. α-Amylases of medical and industrial importance. J. Mol. Struct., 666 – 667: 487 – 498. -35-      PHỤ LỤC A Phản ứng khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột. Bảng 4: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose. Nồng độ Acarbose Giá trị OD (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Trung bình Hiệu suất OD phản ứng (%) 0,0392 0,041 0,0421 0,0408 98,34 0,045 0,0466 0,0477 0,0464 98,13 0,0439 0,0457 0,0464 0,0453 98,2 0,3188 0,3214 0,3224 0,3209 86,97 0,3601 0,3686 0,3677 0,3655 85,3 0,3517 0,3566 0,3532 0,3538 85,91 0,851 0,866 0,869 0,862 65,01 0,87 0,889 0,896 0,885 64,4 0,857 0,865 0,872 0,8647 65,56 1,281 1,307 1,325 1,3043 47,05 1,325 1,339 1,355 1,3397 46,11 1,365 1,373 1,376 1,3713 45,38 1,391 1,451 1,497 1,4463 41,29 1,428 1,471 1,506 1,4683 40,94 1,496 1,502 1,522 1,5067 39,99 1,51 1,592 1,602 1,568 36,35 1,559 1,579 1,585 1,5743 36,67 1,612 1,632 1,638 1,6273 35,18 1,626 1,668 1,726 1,6733 32,07 1,647 1,696 1,859 1,734 30,25 1,643 1,701 1,788 1,7107 31,86 -36-      1,873 1,892 1,899 1,888 23,36 1,984 1,981 1,977 1,9807 20,33 1,941 1,957 1,962 1,9533 22,2 1,921 1,945 1,957 1,941 21,2 1,911 1,945 1,957 1,9377 22,06 1,961 1,995 2,021 1,9923 20,65 1,937 2,056 2,128 2,0403 17,17 1,999 2,019 2,027 2,015 18,95 2,034 2,034 2,031 2,033 19,03 2,362 2,387 2,394 2,1513 12,67 2,119 2,138 2,144 2,1337 14,17 2,139 2,164 2,172 2,1583 14,03 Nồng độ 2,037 2,163 2,254 2,4633 0 tinh bột 2,475 2,494 2,489 2,486 0 ban đầu 2,515 2,513 2,504 2,5107 0 0,7 0,8 0,9 1 Ở nồng độ Acarbose 0 mg/ml được trình bày trong Bảng 4 có hiệu suất phản ứng trên 98%, tuy nhiên trên lý thuyết lượng enzyme phản ứng với cơ chất hoàn toàn khi không có chất ức chế nên hiệu suất phản ứng là 100%. Dựa trên hiệu suất 100% để tính hiệu suất enzyme bị ức chế, kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 5. Bảng 5: Kết quả hiệu suất ức chế enzyme α-amylase bởi các nồng độ khác nhau của Acarbose. Nồng độ Acarbose Hiệu suất enzyme bị ức chế (%) Trung bình (mg/ml) 0 0 0 0 0 -37-      11,56 0,1 13,08 12,38 12,51 33,9 0,2 34,37 33,84 33,23 52,16 0,3 53,01 52,98 53,79 58,02 0,4 58,28 58,53 59,28 63,04 0,5 62,63 63,28 64,17 67,39 0,6 69,17 68,04 67,55 76,25 0,7 79,29 77,64 77,39 78,44 0,8 77,52 78,31 78,98 82,54 0,9 80,69 81,29 80,62 87,12 1 85,56 86,13 85,71 -38-      Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16 One-way ANOVA: Phần trăm enzyme bị ức chế versus NĐ Acarbose Source NĐ Acarbose Error Total DF 10 22 32 S = 0.8770 R-Sq = 99.93% Level 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 0.000 12.383 33.833 52.987 58.527 63.280 68.037 77.643 78.313 81.283 86.130 SS 24766.00 16.92 24782.92 StDev 0.000 0.768 0.573 0.815 0.665 0.798 0.985 1.536 0.738 1.089 0.861 MS 2476.60 0.77 F 3219.91 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.90% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------* * (* *) *) *) *) * *) (* *) +---------+---------+---------+--------0 25 50 75 Pooled StDev = 0.877 Grouping Information Using Fisher Method NĐ Acarbose 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 86.130 81.283 78.313 77.643 68.037 63.280 58.527 52.987 33.833 12.383 0.000 Grouping A B C C D E F G H I J Means that do not share a letter are significantly different. Regression Analysis: Phan tram enzyme bi uc che versus ND Acarbose The regression equation is Phan tram enzyme bi uc che = 27.66 + 621.8 ND Acarbose S = 5.74850 R-Sq = 94.0% R-Sq(adj) = 92.0% Analysis of Variance Source Regression Error Total DF 1 3 4 SS 1546.54 99.14 1645.68 MS 1546.54 33.05 F 46.80 P 0.006 -39-      -40-      PHỤ LỤC B Phản ứng khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô RTCT trong phản ứng chuyển hoá tinh bột. Bảng 6: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô RTCT. Nồng độ cao thô Giá trị OD RTCT Trung bình Hiệu suất OD phản ứng (%) (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0,1069 0,1076 0,107 0,1072 96,53 0,0716 0,0733 0,0739 0,0729 97,18 0,0825 0,0833 0,0832 0,083 97,36 1,0311 1,0609 1,0658 1,0526 65,91 0,8012 0,8048 0,807 0,8043 70,84 1,0191 1,0267 1,034 1,0266 65,09 1,4251 1,4362 1,452 1,4378 53,44 1,2979 1,3192 1,3298 1,3156 52,3 1,3391 1,3645 1,3677 1,3571 53,86 1,5322 1,6524 1,7131 1,6326 47,13 1,4268 1,6461 1,7204 1,5978 42,07 1,4826 1,5517 1,5827 1,539 47,67 2,448 2,4835 2,5332 2,4882 19,42 2,277 2,2971 2,2622 2,2788 17,39 2,322 2,2766 2,294 2,2975 21,88 2,7268 2,755 2,7556 2,7458 11,08 2,4876 2,5458 2,5823 2,5386 7,97 2,5587 2,6109 2,7167 2,6288 10,62 2,7613 2,7546 2,7568 2,7576 10,7 2,4893 2,5132 2,5503 2,5176 8,73 2,748 2,6786 2,6566 2,6944 9,15 -41-      Nồng độ 3,065 3,094 2,105 3,088 0 tinh bột 2,732 2,769 2,774 2,7583 0 ban đầu 2,906 2,948 2,969 2,941 0 Ở nồng độ cao thô RTCT 0 mg/ml được trình bày trong Bảng 6 có hiệu suất phản ứng trên 98%, tuy nhiên trên lý thuyết lượng enzyme phản ứng với cơ chất hoàn toàn khi không có chất ức chế nên hiệu suất phản ứng là 100%. Dựa trên hiệu suất 100% để tính hiệu suất enzyme bị ức chế, kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 7. Bảng 7: Kết quả hiệu suất ức chế enzyme α-amylase bởi các nồng độ khác nhau của cao thô RTCT. Nồng độ cao thô Hiệu suất enzyme RTCT(mg/ml) bị ức chế (%) Trung bình 0 0 0 0 0 31,72 0,2 27,24 30,66 33,02 44,64 0,4 46,28 45,16 44,58 51,17 0,6 56,78 52,97 50,94 79,88 0,8 82,14 77,49 -42- 79,84      88,52 1 91,82 89,8 89,08 88,91 1,2 91,04 90,18 90,58 Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16 One-way ANOVA: Phần trăm enzyme bị ức chế versus Nồng độ cao thô RTCT (mg/ml) Source Nồng độ cao thô Error Total S = 2.099 Level 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 N 3 3 3 3 3 3 3 DF SS MS F P 6 20346.53 3391.09 769.56 0.000 14 61.69 4.41 20 20408.23 RTCT ( R-Sq = 99.70% Mean 0.000 30.660 45.167 52.963 79.837 89.807 90.177 StDev 0.000 3.032 0.965 3.307 2.325 1.766 1.121 R-Sq(adj) = 99.57% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) -+---------+---------+---------+-------0 25 50 75 Pooled StDev = 2.099 Grouping Information Using Fisher Method Nồng độ cao thô RTCT (mg/ml) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 N 3 3 3 3 3 3 3 Mean 90.177 89.807 79.837 52.963 45.167 30.660 0.000 Grouping A A B C D E F Means that do not share a letter are significantly different. -43-      Regression Analysis: % Enzyme bi uc che versus ND cao thô RTCT (mg/ml) The regression equation is % Enzyme bi uc che = 6.570 + 86.34 ND cao tho RTCT (mg/ml) S = 6.37648 R-Sq = 97.0% R-Sq(adj) = 96.2% Analysis of Variance Source Regression Error Total DF 1 4 5 SS 5217.70 162.64 5380.34 MS 5217.70 40.66 F 128.33 -44- P 0.000 [...]...   TÓM LƯỢC Đề tài Khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của cao thô ethanol trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl. ) in vitro được thực hiện nhằm khảo sát khả năng ức chế hoạt động enzyme α -amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng (RTCT) Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của cao thô RTCT được thực hiện bằng cách ủ enzyme α -amylase với cao thô trong dung dịch đệm phosphate... khả năng giảm đường huyết của trái Cau Trắng được nhiều bệnh nhân ĐTĐ biết đến và sử dụng nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào chứng minh trái Cau Trắng có khả năng giảm đường huyết Với thông tin đó, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA – AMYLASE CỦA CAO THÔ ETHANOL RUỘT TRÁI CAU TRẮNG (Veitchia merrillii Wendl. ) in vitro được thực hiện nhằm khảo -2-     sát khả năng ức chế enzyme α -amylase. .. ruột của trái Cau ở các giai đoạn phát triển -22-     II Khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng, tuy nhiên để kết quả khảo sát có tính thuyết phục hơn thì hiệu quả ức chế cần phải so sánh với một chất được biết có khă năng ức chế enzyme α -amylase. .. (OD) của dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột còn lại sau phản ứng) Hiệu suất ức chế là lượng enzyme bị ức chế trong phản ứng Hiệu suất ức chế ( %) = 100% – hiệu suất phản ứng ( %) 4 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của cao ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl. ) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột Thí nghiệm được thực hiện gồm 6 nghiệm thức với các nồng độ cao thô ruột trái Cau. .. định lượng cũng như đánh giá khả năng cần khảo sát của mẫu được thí nghiệm Vì vậy, trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của cao thô ethanol RTCT của đề tài cũng phải xây dựng đường chuẩn để so sánh Khả năng ức chế enzyme α -amylase của cao thô RTCT được so sánh với hiệu quả ức chế enzyme này của thuốc trị bệnh ĐTĐ nhằm đánh giá hiệu quả tác động của cao thô RTCT Trong đề tài này,... (OD) của mẫu được đo ở bước sóng 660 nm Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ức chế enzyme α -amylase tăng dần khi tăng nồng độ cao thô ethanol RTCT lên từ 0,2 mg/ml đến 0,4; 0,6; 0,8; 1 và nồng độ cao thô 1,2 mg/ml có khả năng ức chế enzyme cao đến 90,18% ± 0,647 Bên cạnh đó, kết quả còn cho thấy khả năng ức chế enzyme α -amylase của RTCT (IC50 = 0,503 mg/ml) thấp hơn Acarbose (IC50 = 0,036 mg/ml) 13,97... đó, khả năng ức chế enzyme α -amylase của RTCT được xác định tương đương với nồng độ Acarbose Đường chuẩn thể hiện kết quả ức chế enzyme α -amylase của Acarbose tăng tuyến tính với nồng độ Acarbose Phương trình đường chuẩn được xây dựng với mục đích xác định giá trị ức chế 50% enzyme (IC5 0) của Acarbose và hàm lượng chất ức chế có trong cao thô -25-     Hình 5 Đường chuẩn khả năng ức chế hoạt động enzyme. .. suất ức chế không tăng lên gấp đôi Điều này cho thấy, lượng enzyme bị ức chế phụ thuộc vào từng nồng độ Acarbose Hình 4 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của Acarbose Kết quả được trình bày ở Hình 4 cho thấy hiệu suất ức chế tăng từ nồng độ Acarbose thấp nhất là 0,01 mg/ml đến nồng độ có lượng enzyme bị ức chế cao nhất (86,13% ± 0,49 7) là nồng độ 0,1 mg/ml Acarbose Hiệu suất ức chế cũng... nghiền, đem ngâm trong ethanol 96°, 5 ngày ở nhiệt độ phòng Sau đó, lọc lấy phần dịch và cô cạn thành cao bằng hệ thống máy cô quay để loại bỏ ethanol Cao thô ethanol thu được từ mẫu ruột của trái Cau Trắng được trữ lạnh ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm Hình 2 Trái Cau Trắng ở giai đoạn trung gian giữa non và già được chẻ đôi -18-     3 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của Acarbose trong phản... loại 2 với khả năng làm ức chế enzyme α -amylase và enzyme α-glucosidase [16] Thuốc có thành phần chính là chất acarbose (một tetrasaccharide) nên thường được gọi là thuốc Acarbose Vì vậy, thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α -amylase của Acarbose được thực hiện với kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 2 Bảng 2: Ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của Acarbose lên hoạt tính enzyme α -amylase Nồng ... “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA – AMYLASE CỦA CAO THÔ ETHANOL RUỘT TRÁI CAU TRẮNG (Veitchia merrillii Wendl. ) in vitro thực nhằm khảo -2-     sát khả ức chế enzyme α -amylase cao thô ethanol. .. tài Khảo sát khả ức chế enzyme α -amylase cao thô ethanol trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl. ) in vitro thực nhằm khảo sát khả ức chế hoạt động enzyme α -amylase cao thô ruột trái Cau Trắng. .. II Khảo sát khả ức chế enzyme α -amylase Acarbose phản ứng chuyển hoá tinh bột 22 III Khảo sát khả ức chế enzyme α -amylase cao thô ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl. )