khảo sát khả năng ức chế enzyme alpha amylase của cao thô ethanol trái cau trắng (veitchia merrillii wendl ) in vitro

Trong thời gian gần đây, những thông tin truyền miệng về khả năng giảm đường huyết của trái Cau Trắng được nhiều bệnh nhân ĐTĐ biết đến và sử dụng nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ENZYME ALPHA-AMYLASE CỦA CAO THÔ

ETHANOL TRÁI CAU TRẮNG

(Veitchia merrillii Wendl.) IN VITRO

MSSV: 3102645 Lớp: Sinh Học K36

Cần Thơ, tháng 5 năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và trân trọng nhất đến quý Thầy Cô đã dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức hữu ích, đặc biệt là quý Thầy Cô bộ môn Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã dẫn dắt em đi hết quãng đường đại học

Trong thời gian thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế enzyme

alpha-amylase của cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) in vitro ”, em xin chân thành cảm ơn đến:

Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em hoàn thành tốt đề tài, cùng với quý Thầy Cô bộ môn Sinh Học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến Cô Đái Thị Xuân Trang, là cán bộ hướng dẫn em thực hiện đề tài, đã nhiệt tình góp ý kiến và chỉ dạy cho em hoàn thành đề tài

Quý Thầy Cô, cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học, Hoá học – Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tạo môi trường học tập và điều kiện thuận lợi về thời gian cho em hoàn thành đề tài này

Ngoài ra, tôi xin cảm ơn đến gia đình tôi đã hỗ trợ và ủng hộ tôi về mặt thể chất lẫn tinh thần, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn

Tôi xin cảm ơn lớp Sinh Học K36 đã đồng hành và chia sẻ khó khăn với tôi

Rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để bài luận văn của em được hoàn thiện

Xin chân thành cảm ơn!

Lương Ánh Huệ

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự chỉ dẫn của cán bộ hướng dẫn Các số liệu và kết quả thu được là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts Đái Thị Xuân Trang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM KẾT ii

PHẦN KÝ DUYỆT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

TÓM LƯỢC 1

PHẦN I: MỞ ĐẦU 2

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 4

I Sơ lược về bệnh đái tháo đường 4

1 Định nghĩa 4

2 Phân loại và cơ chế sinh bệnh 4

3 Các biến chứng của bệnh đái tháo đường 6

4 Các phương pháp điều trị bệnh 7

II Giới thiệu về Enzyme α-amylase 11

1 Thành phần hoá học và tính chất 11

2 Cơ chế tác dụng 12

3 Tính đặc hiệu 13

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme α-amylase 13

III Sơ lược về cây Cau Trắng 15

1 Phân loại và định danh 15

2 Nguồn gốc và phân bố 15

3 Đặc điểm thực vật 15

PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 17

I Phương tiện 17

1 Địa điểm và thời gian thực hiện 17

2 Mẫu vật, hoá chất và thiết bị 17

II Phương pháp thí nghiệm 17

1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 17

2 Phương pháp chiết và tách cao ruột trái Cau Trắng bằng dung môi ethanol 18

3 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột 19

4 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột 20

5 Phương pháp xử lí kết quả 21

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

I Xác định độ ẩm của nguyên liệu 22

II Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột 22

III Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) 27

PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

I Kết luận 31

II Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC A 36

PHỤ LỤC B 41

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Độ ẩm của ruột trái Cau Trắng 22 Bảng 2: Ảnh hưởng bởi các nồng độ khác nhau của Acarbose lên hoạt tính enzyme α-amylase 23 Bảng 3: Hàm lượng chất ức chế có trong cao thô ruột trái Cau Trắng tương đương với nồng độ Acarbose (mg/ml) 28 Bảng 4: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose 36 Bảng 5: Kết quả hiệu suất ức chế enzyme α-amylase bởi các nồng độ khác nhau của Acarbose 37 Bảng 6: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng 41 Bảng 7: Kết quả hiệu suất ức chế enzyme α-amylase bởi các nồng độ khác nhau của cao thô ruột trái Cau Trắng 42

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Buồng Cau Trắng ở trên cây và cây Cau Trắng (Veitchia merrillii

Wendl.) 16 Hình 2 Trái Cau Trắng ở giai đoạn trung gian giữa non và già được chẻ đôi 18 Hình 3 Phần ruột của trái Cau Trắng ở các giai đoạn phát triển 21 Hình 4 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose 22 Hình 5 Đường chuẩn khả năng ức chế hoạt động enzyme α-amylase của Acarbose ……….24

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ADA: American Diabetes Association

CI: Confidence interval

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

ĐTĐ: Đái Tháo Đường

HbA1c: Glycosylate Hemoglobin A

IC50: Inhibitory concentration of 50 percent

KI: Potassium iodide

RTCT: Ruột trái Cau Trắng

WHO: World Heath Organization

TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol

trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) in vitro” được thực hiện nhằm khảo

sát khả năng ức chế hoạt động enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau

Trắng (RTCT) Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao

thô RTCT được thực hiện bằng cách ủ enzyme α-amylase với cao thô trong dung

dịch đệm phosphate natri pH 7 ở 37°C, sau đó tinh bột được cho vào hỗn hợp

phản ứng và tiếp tục ủ Cuối cùng, phản ứng được kết thúc bằng HCl và nhận

biết lượng tinh bột còn lại bằng dung dịch iod Khả năng ức chế enzyme α-amylase được xác định dựa vào lượng tinh bột ban đầu và lượng tinh bột còn

lại sau phản ứng dựa trên sự nhận biết màu xanh đặc trưng của phức hợp tinh

bột-iod Kết quả được đánh giá bằng lượng enzyme bị ức chế thông qua giá trị

mật độ quang (OD) của mẫu được đo ở bước sóng 660 nm Kết quả nghiên cứu

cho thấy khả năng ức chế enzyme α-amylase tăng dần khi tăng nồng độ cao thô

ethanol RTCT lên từ 0,2 mg/ml đến 0,4; 0,6; 0,8; 1 và nồng độ cao thô 1,2 mg/ml

có khả năng ức chế enzyme cao đến 90,18% ± 0,647 Bên cạnh đó, kết quả còn

cho thấy khả năng ức chế enzyme α-amylase của RTCT (IC50 = 0,503 mg/ml)

thấp hơn Acarbose (IC50 = 0,036 mg/ml) 13,97 lần

Từ khoá: Acarbose, bệnh đái tháo đường, enzyme α-amylase, ruột

trái Cau Trắng, Veitchia merrillii Wendl

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Bệnh tiểu đường, tên gọi y khoa là bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), là một trong bốn bệnh mãn tính đang có tốc độ phát triển nhanh trên toàn thế giới, đó là bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch, bệnh phổi và bệnh ung thư Trên thế giới,

số người mắc bệnh ĐTĐ tăng lên từ 153 triệu người năm 1980 đến 347 triệu người năm 2008 [1] Chi phí y tế toàn cầu về bệnh ĐTĐ đã đạt ít nhất 376 tỷ USD trong năm 2010, dự đoán tăng lên 490 tỷ USD trong năm 2030 [2] Năm

2004, ước tính khoảng 3,4 triệu người chết vì hậu quả lượng đường trong máu lúc đói cao [3] Theo các nghiên cứu cho thấy, hơn 80% các ca tử vong do bệnh ĐTĐ xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và thu nhập trung bình [4]

Trong suốt 20 năm đầu của thế kỷ 20, vô số các công trình nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra phương thuốc điều trị bệnh ĐTĐ nhưng hầu hết đều không đạt kết quả Năm 1921, một phẫu thuật viên người Canada với ý tưởng thực tế đã chiết xuất thành công chất insulin, đánh dấu một mốc son trong lịch sử

y học [5] Và từ đó, phương pháp điều trị bằng insulin đã trở thành phương pháp hiệu quả Tuy nhiên, chi phí điều trị bằng phương pháp này khá cao, đem lại không ít khó khăn về tài chính cho người bệnh và nhất là những người bệnh có thu nhập thấp ở các nước đang phát triển như Việt Nam Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp trong việc điều trị bệnh ĐTĐ bằng thuốc như Meformin, Sulfonylureas, Glinides nhưng cũng khá tốn kém mà hiệu quả điều trị chưa cao

và nhiều tác dụng phụ [6] Chính vì vậy, nhiều bệnh nhân ĐTĐ đã tìm đến phương pháp ít tốn kém hơn và không ảnh hưởng nhiều đến các cơ quan khác trong cơ thể Đó là phương pháp Đông y dùng cây cỏ trong thiên nhiên để làm thuốc, vừa tiết kiệm chi phí, vừa an toàn Trong thời gian gần đây, những thông tin truyền miệng về khả năng giảm đường huyết của trái Cau Trắng được nhiều bệnh nhân ĐTĐ biết đến và sử dụng nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào chứng minh trái Cau Trắng có khả năng giảm đường huyết

Với thông tin đó, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME ALPHA – AMYLASE CỦA CAO THÔ ETHANOL RUỘT TRÁI

CAU TRẮNG (Veitchia merrillii Wendl.) in vitro” được thực hiện nhằm khảo

sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng

in vitro Sự ức chế enzyme α-amylase sẽ làm quá trình thuỷ phân tinh bột bị

chậm lại dẫn đến lượng glucose được tạo ra giảm, giúp kiểm soát đường huyết sau khi ăn Bên cạnh đó, đề tài có thể tạo cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học của cây Cau Trắng

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Sơ lược về bệnh đái tháo đường

1 Định nghĩa

Bệnh đái tháo đường là một tình trạng mãn tính, có yếu tố di truyền, xảy ra khi mức độ glucose trong máu quá cao cùng với các rối loạn về chuyển hoá đường, đạm, mỡ, khoáng chất do hậu quả từ tình trạng thiếu insulin tuyệt đối hay tương đối Mức độ glucose trong máu bình thường được điều hoà bởi nội tiết tố insulin, được sản xuất bởi tuyến tuỵ Ở những người bị bệnh ĐTĐ, tuyến tuỵ không sản xuất đủ insulin hoặc cơ thể kháng insulin [7, 8]

2 Phân loại và cơ chế sinh bệnh

Theo phân loại của WHO năm 1999 thì bệnh ĐTĐ có những loại sau:

2.1 Bệnh đái tháo đường loại 1

Trước đây, bệnh ĐTĐ loại 1 còn được gọi là bệnh ĐTĐ phụ thuộc nội tiết tố insulin [7] Bệnh hầu hết gặp ở lứa tuổi trẻ nhưng có thể xảy ra ở bất cứ độ tuổi nào, có khoảng 80% các trường hợp được phát hiện ở tuổi dưới 30 Nguyên nhân bệnh có liên quan đến yếu tố di truyền Cơ thể người bệnh tiết ra kháng thể kháng tế bào β của tuyến tụy, làm cho tế bào này bị phá hủy; có thể có tới khoảng 90% tổng số tế bào β của tụy tạng bị thương tổn Vì vậy lượng insulin trong máu người bệnh bị giảm thiểu rất nhiều hoặc mất hẳn sẽ làm rối loạn chuyển hoá glucose, tăng phân huỷ lipid dẫn tới tăng glucose huyết và acid béo gây ra tình trạng đa niệu thẩm thấu và nhiễm ceton [8, 9] Những người mang gen nhạy cảm khi gặp tác động của các yếu tố môi trường như bị nhiễm vi rút rubella, sởi, cocxackie; bú sữa bò thời kỳ sơ sinh và đặc thù địa dư ở một số nước

có tỷ lệ bệnh cao như Phần Lan sẽ xuất hiện kháng thể kháng tế bào β của tụy tạng, phá hủy các tế bào này làm cho insulin bị giảm tiết và gây bệnh [9]

2.2 Bệnh đái tháo đường loại 2

Bệnh đái tháo đường loại 2 còn được gọi là bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin [7] Đây là thể bệnh hay gặp nhất của bệnh ĐTĐ và chiếm khoảng từ 85% đến 90% tổng số các bệnh nhân ĐTĐ Bệnh là sự phối hợp giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường với cơ chế gây bệnh là giảm nhạy cảm đối với insulin, gọi là

kháng insulin ở gan và cơ vân; có thể kèm theo sự suy chức năng của tế bào β làm giảm tiết insulin Bệnh khởi đầu bằng kháng insulin do béo phì, tuổi tác, ít vận động thể lực dẫn đến insulin giảm hiệu quả trong việc chuyển glucose từ máu vào gan, cơ vân Do vậy, tụy tạng phải tăng cường tiết insulin dẫn đến tình trạng tụy tạng bị tổn thương, làm cho insulin bị giảm tiết Cuối cùng sự phối hợp của việc kháng insulin và giảm tiết insulin làm cho glucose huyết tăng lên dẫn đến việc gây bệnh [9, 12] Bệnh thường hay gặp ở người béo phì, người lớn tuổi

do khả năng tổng hợp protein của tế bào ở những người này rất kém nên không tổng hợp được thụ thể để bắt giữ insulin, do đó, tuy tuyến tuỵ vẫn sản xuất insulin bình thường nhưng không có tác dụng đưa glucose vào trong tế bào [8] Bệnh tiến triển âm thầm với các biến chứng mạn tính là chủ yếu [9]

2.3 Bệnh đái tháo đường thai kỳ

Bệnh đái tháo đường thai kỳ được định nghĩa như một rối loạn dung nạp glucose, được chẩn đoán lần đầu tiên trong lúc mang thai Định nghĩa này không loại trừ trường hợp bệnh nhân đã có ĐTĐ từ trước khi có thai nhưng chưa được chẩn đoán [8] Nguyên nhân là do mang thai làm gia tăng nhu cầu insulin hơn bình thường, do sự gia tăng sản xuất hormone dẫn đến đề kháng insulin Đa số trường hợp thai phụ trở về bình thường sau sinh, một số trường hợp thực sự trở thành ĐTĐ loại 1 hoặc loại 2, một số có thể bị lại ở lần sinh sau Triệu chứng bệnh tương tự như ĐTĐ loại 2 Hầu hết bệnh ĐTĐ thai kỳ thường được chẩn đoán thông qua sàng lọc trước sinh [7]

2.4 Các loại bệnh đái tháo đường khác

Đây là loại bệnh đái tháo đường thứ phát gặp trong các trường hợp bệnh ĐTĐ khi mắc các bệnh nội tiết như bệnh cushing, to đầu chi [9] Các bệnh liên quan đến gen ảnh hưởng đến tế bào β của tụy tạng, ảnh hưởng đến chức năng của insulin; bệnh của tụy tạng như viêm tụy tạng mãn tính, ung thư tuyến tuỵ, giải phẫu cắt bỏ tuỵ; bệnh gan như xơ gan; bệnh do nhiễm sắc tố sắt; bệnh do dùng thuốc corticoid, thuốc ngừa thai, lợi tiểu thidiazoxid, diazoxid là những nguyên nhân gây ra bệnh ĐTĐ thứ phát [8, 9]

3 Các biến chứng của bệnh đái tháo đường

Hiểu biết đầy đủ về bệnh đái tháo đường là rất quan trọng, vì không kiểm soát được bệnh ĐTĐ, theo thời gian, bệnh có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mù, suy thận, tổn thương thần kinh, hoại tử các chi [7] Các biến chứng được phân thành 2 loại là biến chứng cấp tính và biến chứng mạn tính [8]

3.1 Biến chứng cấp tính

Hôn mê là biến chứng cấp tính thường gặp nhất ở bệnh ĐTĐ do nhiều nguyên nhân như nhiễm ceton, tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ glucose huyết, acid lactic tăng cao trong máu [8]

3.2 Biến chứng mạn tính

Biến chứng mạn tính bao gồm biến chứng ở mạch máu lớn, biến chứng mạch máu nhỏ, biến chứng thần kinh, biến chứng nhiễm trùng và loét chân [8] Các biến chứng này là nguyên nhân gây ảnh hưởng đến các cơ quan và hệ cơ quan trong cơ thể [12]

3.2.1 Tim

Bệnh đái tháo đường làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ Nguyên nhân là động mạch của người bị bệnh ĐTĐ thường bị hẹp vì glucose cao, cholesterol và triglyceride (một loại mỡ trong máu) cao và huyết áp cao, mỡ tích

tụ ở thành động mạch Vì vậy, những người bị bệnh ĐTĐ thường dễ bị bệnh tim, đứt mạch máu não và bệnh động mạch ngoại biên [7]

3.2.2 Thận

Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây suy thận [7] Đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong của bệnh ĐTĐ Đa số các bệnh nhân bị biến chứng thận đồng thời có thay đổi ở đáy mắt nhưng nhiều bệnh nhân có thay đổi ở đáy mắt lại không có triệu chứng rõ của bệnh thận [8]

3.2.3 Mắt

Bệnh mắt có 2 loại do bệnh ĐTĐ gây ra: bệnh võng mạc ĐTĐ tăng sinh

và bệnh võng mạc ĐTĐ không tăng sinh [7] Trên toàn cầu, 1% mù loà có thể do bệnh ĐTĐ gây ra [10] Nguyên nhân chính của bệnh mắt do bệnh ĐTĐ gây ra là những động mạch của võng mạc không cung cấp đủ máu cho võng mạc do

những động mạch này có thể bị chảy máu hay rỉ những chất từ trong máu ra võng mạc làm ảnh hưởng tới thị giác của người bệnh [7] Bệnh ĐTĐ cũng có thể gây nên bệnh cườm mắt hay bệnh cao nhãn áp [10]

3.2.4 Hệ thần kinh

Biến chứng thần kinh ảnh hưởng lên mọi cơ cấu của hệ thần kinh có lẽ chỉ trừ não bộ Biến chứng gây nhiều khó khăn cho bệnh nhân dù ít khi gây tử vong Cơ chế sinh bệnh do rối loạn chuyển hoá dẫn tới giảm myoinositol và tăng sorbitol, fructose trong dây thần kinh; ngoài ra còn có thiếu máu cục bộ do tổn thương vi mạch dẫn đến thoái biến myelin dây thần kinh và giảm tiêu thụ oxy Biến chứng thần kinh hay gặp ở người bệnh ĐTĐ là viêm đa dây thần kinh ngoại biên, viêm đơn dây thần kinh và biến chứng thần kinh dinh dưỡng [8] Người bị bệnh thần kinh ngoại biên có thể bị tê chân, cảm giác như bị kim chích Bệnh làm cho người bị bệnh ĐTĐ dễ bị loét chân, nhiễm trùng Trường hợp nặng có thể dẫn tới cưa ngón chân, cưa bàn chân và ngay cả cưa chân dưới hay trên đầu gối [7] Biến chứng thần kinh dinh dưỡng hay còn gọi là biến chứng thần kinh tự chủ ảnh hưởng lên các cơ quan và hệ cơ quan như tim mạch, tiêu hoá, hệ niệu sinh dục, bất thường tiết mồ hôi, rối loạn vận mạch và teo cơ [8]

4 Các phương pháp điều trị bệnh

Mục tiêu chính của điều trị bệnh ĐTĐ là làm giảm lượng glucose huyết cao xuống mức bình thường nhằm cải thiện các triệu chứng của bệnh ĐTĐ và cả ngăn ngừa hay trì hoãn các biến chứng của bệnh [7]

Theo hướng dẫn năm 2013, các chuyên gia của Hiệp Hội ĐTĐ Mỹ (ADA) nhắc lại sự cần thiết của việc cá thể hoá mục tiêu điều trị Đối với đa số bệnh nhân bệnh ĐTĐ trưởng thành không có thai, mục tiêu glycosylated hemoglobin (HbA1c) nhỏ hơn 7% là phù hợp Tuy nhiên, HbA1c có thể thay đổi từ dưới 6,5% đến dưới 8% tuỳ theo các yếu tố như thời gian đã bị bệnh ĐTĐ, triển vọng sống, bệnh kèm theo, biến chứng mạch máu, nguy cơ hạ glucose huyết nặng Bên cạnh mục tiêu HbA1c nhỏ hơn 7%, ADA còn khuyến cáo đạt mục tiêu glucose huyết trước ăn trong khoảng 70-130 mg/dl (3,9-7,2 mM/l) và glucose huyết sau ăn (được đo 1 – 2 giờ sau khi ăn) dưới 180 mg/dl (10,0 mM/l) đối với đa số bệnh nhân bệnh ĐTĐ trưởng thành không có thai [10]

4.1 Liệu pháp ăn uống

Liệu pháp ăn uống là phương pháp trị liệu cơ bản nhất, dựa trên các nguyên tắc là tiêu thụ năng lượng trong phạm vi thích hợp; giữ được sự cân bằng

về dinh dưỡng; bổ sung năng lượng và vitamin; tránh ăn quá độ và ăn uống thất thường [7]

4.2 Biện pháp vận động

Rèn luyện cơ thể có tác dụng tốt nhưng cần có sự phân biệt giữa bệnh ĐTĐ loại 1 và ĐTĐ loại 2, người bệnh hầu như có thể tham gia tất cả các hoạt động thể dục thể thao nhưng luyện tập phải phù hợp, đúng cách Đối với bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ loại 2, nếu luyện tập đúng sẽ có tác dụng giảm glucose huyết thông qua cơ chế làm giảm tình trạng kháng insulin, bớt phải dùng thuốc [8]

4.3 Các loại Insulin

Insulin là hormone do tuyến tuỵ tiết ra khi lượng glucose trong máu cao Hormone này có tên gọi xuất phát từ chữ La tinh insula (đảo) vì insulin được sản sinh do các tế bào β của đảo Langerhans của tuyến tuỵ [11]

Tác dụng chủ yếu của insulin là xúc tiến quá trình oxy hoá glucose, chuyển glucose thành lipid, kìm hãm sự phân giải glycogen ở gan, kìm hãm sự sản sinh thể ceton [11] Khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúp glucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạt động của các tế bào Khi thiếu insulin, các tế bào trong cơ thể sẽ không sử dụng được glucose, do đó, glucose trong máu sẽ tăng cao và xuất hiện trong nước tiểu [12]

Tính theo thời gian tác dụng (thời gian bắt đầu có tác dụng, thời gian có tác dụng tối đa và thời gian hết tác dụng) có 3 loại insulin thường được dùng hiện nay là insulin nhanh, insulin bán chậm và insulin hỗn hợp (hay insulin mixtard gồm 2 loại nhanh và bán chậm được trộn theo những tỉ lệ nhất định) [12]

4.4 Một số thuốc trị bệnh đái tháo đường

4.4.1 Nhóm Sulphonylurea

Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamide, Gliclazide, Glimepiride, Glipizide, Glinide thuộc nhóm Sulfonylurea là những thuốc điều trị bệnh ĐTĐ

loại 2 được dùng phổ biến nhất, thuốc có tác dụng chính là kích thích tụy tạng tăng tiết insulin[12]

Tác dụng phụ của thuốc là gây tăng cân tuy không nhiều (1-2 kg) trong 3 tháng khi sử dụng thuốc thuộc nhóm này [13] Hạ glucose huyết quá thấp thường hay gặp khi dùng thuốc Chlorpropamide và Glibenclamide, nhất là ở những bệnh nhân già, bệnh nhân có bệnh gan hoặc thận [12] Tác dụng nguy hiểm hơn là tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch, thậm chí là gây tử vong [14]

4.4.2 Thuốc Glucobay (Acarbose)

Glucose huyết tăng sau bữa ăn khá phổ biến ở các bệnh nhân bệnh đái tháo đường loại 2 Enzym alpha-glucosidase có vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu thức ăn ở niêm mạc ruột non [12] Thuốc có tác dụng ức chế enzyme alpha-amylase và enzyme alpha-glucosidase vì vậy sẽ làm chậm quá trình hấp thu carbohydrate ở đường tiêu hóa, nhờ đó làm giảm mức độ tăng glucose huyết sau bữa ăn [12, 15] Thuốc có thể được dùng riêng lẻ cùng với chế

độ ăn kiêng hoặc được dùng phối hợp với nhóm Sulfonylurea, Metformin hoặc Insulin [15]

Tác dụng phụ là gây đầy hơi và sôi bụng, đôi khi gây đau bụng và tiêu chảy, vì thuốc này làm chậm quá trình tiêu hóa chất bột đường (carbohydrate) trong đường ruột [12, 15] Ngoài ra, các tác dụng phụ như ban đỏ, vàng da, ngứa, mày đay khi sử dụng thuốc này đã được báo cáo [16]

4.4.3 Metformin

Metformin được dùng làm thuốc điều trị đầu tiên cho những bệnh nhân ĐTĐ loại 2 có béo phì hoặc thừa cân do có tác dụng chính lên sự đề kháng insulin Metformin có ưu điểm nổi bật là không làm tăng cân và cũng không gây

hạ glucose huyết quá thấp [12]

Các tác dụng phụ của thuốc có thể là gây đầy bụng, buồn nôn, tiêu chảy Tác dụng phụ này có thể tránh được khi sử dụng với liều thấp hơn và uống sau khi ăn Nếu vẫn còn cảm giác đầy bụng và bị tiêu chảy sau khi đã sử dụng theo đúng khuyến cáo, chắc chắn phải ngưng uống Metformin Metformin được khuyến cáo không nên dùng khi người bệnh có suy thận, suy gan, suy hô hấp Những bệnh nhân lớn tuổi phải thận trọng khi dùng thuốc này [12]

4.4.4 Nhóm Thiazolidinedione (TZD)

Các thuốc TZD có tác dụng làm tăng tác dụng của insulin tại các mô trong cơ thể nhưng không làm tăng tiết insulin Ngoài ra còn có tác dụng làm giảm rối loạn mỡ máu [12]

Điều trị TZD thường gây tăng cân (khoảng 2-4 kg / 24 tháng), chủ yếu

do làm tăng tích trữ mỡ dưới da và một phần do giữ nước Vì vậy, việc sử dụng nhóm TZD cần thận trọng khi điều trị cho các bệnh nhân có bệnh tim, viêm gan hoặc có men gan tăng cao [12]

4.4.5 Nhóm Meglitimide

Nhóm này có tác dụng kích thích tế bào β của tụy tạng sản xuất insulin,

có tác dụng tương tự Sufonylurea nhưng kích thích tiết insulin sớm hơn Thuốc được dùng là Novonorm chỉ định trong điều trị bệnh ĐTĐ loại 2, được uống trước khi ăn 15-30 phút Tác dụng xuất hiện nhanh (30 phút sau khi uống thuốc) nên Novonorm thường được uống vào đầu bữa ăn và làm giảm glucose huyết sau bữa ăn, không được uống thuốc nếu không ăn Thuốc không dùng cho những trường hợp suy gan, thận, có thai, nhiễm trùng, phẫu thuật [12]

Theo các khuyến cáo mới của ADA thì khi dùng một loại thuốc mà không kiểm soát được glucose huyết thì nên điều trị phối hợp sớm 2 hoặc 3 loại thuốc uống với nhau hoặc với Insulin Điều trị phối hợp rất có lợi vì cùng lúc nhiều thuốc tác dụng lên nhiều rối loạn khác nhau của quá trình sinh bệnh ĐTĐ loại 2 [12]

và trên thế giới về tế bào gốc cũng đã có tiến triển tốt Một nghiên cứu của công

ty kỹ thuật tế bào gốc Novacell Inc tại San Diego đã nghiên cứu thành công quy trình tái tạo tế bào β của tuyến tuỵ từ tế bào gốc phôi thai người [18] Bên cạnh

đó, nghiên cứu của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh cũng đã khảo sát thành công sự biệt hoá của tế bào gốc trung mô máu

cuống rốn người thành tế bào tiết insulin khi cảm ứng bằng môi trường có nồng

độ glucose thấp và biệt hoá bằng môi trường có nồng độ glucose cao [19]

Ở người bình thường, các tế bào β khoẻ mạnh trong tuyến tuỵ sản xuất

và giải phóng ra insulin để kiểm soát lượng glucose trong máu Số lượng các tế bào β được duy trì qua quá trình sản sinh liên tục và thường xuyên Tuy nhiên, ở bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ sự cân bằng bị mất đi [8] Vì vậy, việc bảo vệ các tế bào còn lại và bổ sung một số lượng đủ các tế bào β là trọng tâm của liệu pháp tế bào gốc đối với bệnh ĐTĐ [17]

Phương pháp điều trị này cho phép bệnh nhân giảm hoặc thậm chí trong một số trường hợp ngưng sử dụng Insulin và thuốc hạ glucose huyết Đồng thời, phương pháp này làm giảm các biến chứng mãn tính của bệnh ĐTĐ [17]

II Giới thiệu về enzyme alpha-amylase

Tên thông thường: alpha-amylase

Tên hệ thống: 1,4-α-glucan 4-glucanhydrolase

Enzyme α-amylase được tìm thấy chủ yếu ở người và động vật có vú khác, ngoài ra, còn có trong một số loại hạt chứa tinh bột và một số loài nấm cũng tiết

ra enzyme này [21]

1 Thành phần hoá học và tính chất

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và acid aspartic Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng acid amino cấu thành nên phân tử enzyme α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine [20]

Phân tử lượng của các α-amylase từ các nguồn khác nhau rất gần nhau Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc 45-50 kDa Trọng lượng phân tử của α-amylase hạt thóc đang nảy mầm (malt) là 59 kDa Do kích thước phân tử lớn nên enzyme này không đi qua được màng bán thấm của tế bào [20]

Toàn bộ cấu trúc không gian của phân tử enzyme có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc tác của enzyme Tuy nhiên, hoạt động của enzyme liên hệ trực tiếp với một phần xác định trong phân tử enzyme [22] Trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase có chứa các nhóm –COOH và –NH2, là phần trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hoá cơ chất (tinh bột hay glycogen) thành sản phẩm phản ứng Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng Protein của các α-amylase

có tính chất acid yếu và tính chất của globuline Điểm đẳng điện nằm trong vùng

pH 4,2 – 5,7 [20]

α-amylase là enzyme một thành phần có chứa ion kim loại (metaloenzyme) [23] Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol Canxi tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme

Do đó, canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân

tử α-amylase bị loại bỏ hết canxi thì sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thuỷ phân

cơ chất [20]

2 Cơ chế tác dụng

α-amylase không chỉ có khả năng thuỷ phân hồ tinh bột mà còn có khả năng thuỷ phân cả hạt tinh bột nguyên vẹn song với tốc độ rất chậm Sự thuỷ phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp Giai đoạn này được gọi là giai đoạn dextrin hoá Sang giai đoạn đường hoá, các dextrin phân tử thấp tiếp tục bị thuỷ phân để tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod Tetra-trimaltose bị thuỷ phân rất chậm bởi α-amylase cho tới maltose và glucose Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi

là polyglucose (6-7 gốc glucose) dưới tác dụng của α-amylase, sau đó các oligosaccharide này tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thuỷ phân amylose là 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của enzyme α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%)

do α-amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân

3 Tính đặc hiệu

Do cấu trúc lý hoá đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với các chất xúc tác thông thường khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hoá một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hoá Tính đặc hiệu của enzyme α-amylase thể hiện ở kiểu đặc hiệu cơ chất α-amylase chỉ xúc tác cho phản ứng thuỷ phân, chuyển hoá cơ chất là tinh bột và glycogen [22] α-amylase

có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên [23]

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme α-amylase

Nồng độ cơ chất là một trong những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến tốc độ phản ứng của α-amylase [20] Khi nồng độ cơ chất cao hơn nồng độ enzyme, tất

cả enzyme sẽ liên kết cùng lúc với cơ chất, như vậy phản ứng càng xảy ra nhanh hơn [22]

Các enzyme trong hệ enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Vì vậy, hoạt động của enzyme α-amylase bị ảnh hưởng khi có mặt các kim loại nặng [20] Bên cạnh đó, các chất kìm hãm như Acarbose, Tanin có tác động mạnh đến hoạt tính enzyme α-amylase bằng cách kìm hãm theo hướng cạnh tranh hay phi cạnh tranh, kết quả là làm ảnh hưởng sự liên kết giữa trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất [15, 21, 24]

α-amylase được trích từ các nguồn khác nhau thì có điều kiện hoạt động khác nhau Ví dụ như biên độ pH thích hợp cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ vi sinh vật; pH thích hợp cho hoạt động của α-amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong khoảng

pH 4,7-5,4) [20]; còn α-amylase trích từ dịch tuỵ thì hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6,8-7,2 [11] α-amylase trong nước bọt và dịch tuỵ của người thì giống nhau, nhưng khác với α-amylase thu được từ tuỵ lợn về độ hoà tan, pH thích hợp và một số tính chất khác [22]

Sự kết hợp giữa nhiệt độ và pH cũng là yếu tố làm ảnh hưởng đến độ bền của enzyme α-amylase Tuy nhiên so với các loại amylase khác thì độ bền với nhiệt của α-amylase cao hơn Ở 0°C và pH 3,6, α-amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính α-amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ trong khoảng 58-60°C [20]

Các nghiên cứu đã cho thấy enzyme này hoàn toàn không hoạt động ở hạt khô Hoạt tính của enzyme α-amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt, tuy nhiên ở nhiệt độ khác nhau thì hoạt tính đạt tối ưu vào những thời điểm khác nhau Chẳng hạn khi cho hạt nảy mầm ở nhiệt độ 15-17°C, hoạt tính của α-amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10-12 của quá trình nảy mầm; khi ở nhiệt

độ 28-30°C, hoạt tính của α-amylase đạt đến cực đại ở ngày thứ 5-8 [20]

Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi cho hoạt động của các enzyme amylase khi ở nhiệt độ cao Đối với enzyme α-amylase, dưới tác động của tia tử ngoại với điều kiện nhiệt độ cao, enzyme này nhanh chóng bị mất hoạt tính [22]

III Sơ lược về cây Cau Trắng

1 Phân loại và định danh

Tên khoa học: Veichia merrillii Wendl

Tên tiếng Việt: Cau Trắng

Tên tiếng Anh: Christmas Palm, Manila Palm

Khoá phân loại

Giới: Thực vật

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida Bộ: Arecales Họ: Arecaceae

Chi: Veitchia Loài: Veitchia merrillii Wendl [25]

2 Nguồn gốc và phân bố

Cau Trắng là một loại cau phổ biến, thường được trồng để làm kiểng Cau

có nguồn gốc từ philippines, được tìm thấy trên đảo Palawan Chi Veitchia có 9

loài, thường gặp ở các trung tâm đa dạng phía đông Thái Bình Dương trên các đảo Vanuatu, Fiji và Tonga Loài Cau Trắng này được trồng nhiều ở vùng nhiệt đới [26]

3 Đặc điểm thực vật

Cây Cau Trắng thuộc loại đại mộc nhỏ Cây có thể cao đến 9 m; thân cây

to, có đường kính 10-20 cm, lóng rất ngắn Lá có màu xanh đậm, dài khoảng 1,5 m; lá phụ hẹp nhọn, rộng 3 cm, dài khoảng 40-50 cm; cuống lá màu lục rất nhạt Buồng Cau mọc ở nách lá, mỗi buồng phân thành nhiều nhánh nhỏ, mỗi nhánh mang nhiều hoa; hoa có màu trắng Trái hình bầu dục, dài từ 2-3,5 cm; trái non

có màu xanh, trong ruột chứa nhiều nước; trái phát triển càng to thì ruột càng nhiều và chứa ít nước; trái già vẫn có vỏ màu xanh nhưng ruột rất cứng và không còn nước; đến khi chín, trái có màu đỏ, vỏ mềm chứa nước [25]

Thông tin về thành phần hoá học và tác dụng dược lí của trái Cau Trắng hiện nay chưa được tìm thấy

Hình 1 Buồng Cau Trắng ở trên cây và cây Cau Trắng

(Veitchia merrillii Wendl.)

PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

I Phương tiện

1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm Sinh học và phòng thí nghiệm Hoá học của Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

2 Mẫu vật, hoá chất và thiết bị

2.1 Mẫu vật

Trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) không được phun xịt thuốc

bảo vệ thực vật, được thu hái tại Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ, Thành Phố Cần Thơ

2.2 Hoá chất

Một số hoá chất được dùng trong đề tài: enzyme α-amylase trích từ tuỵ heo (Sigma – Aldrich – Mỹ), tinh bột (Trung Quốc), thuốc Acarbose (Wako – Nhật), Dimethylsulfoxide (DMSO) (Meck – Đức), ethanol 96°, HCl đậm đặc, Iodine, KI, Na2HPO4, NaH2PO4

2.3 Thiết bị

Máy đo quang phổ Beckman Coulter 640B (Mỹ), máy cô quay chân không Heidolph (Đức), máy đo pH Metler Toledo, máy khuấy từ, máy trộn mẫu Vortex, máy ổn nhiệt, cân phân tích AB104 (Thuỵ Sĩ), eppendorf, micropipette

và một số dụng cụ khác

II Phương pháp thí nghiệm

1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Buồng Cau được thu hái và được xác định phần ruột của trái Cau là ở giai đoạn trung gian giữa non và già trước khi xử lý Trái Cau ở giai đoạn trung gian

sẽ có phần ruột mềm, ở giữa có lỗ rỗng chứa nước như Hình 2