Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng, tuy nhiên để kết quả khảo sát có tính thuyết phục hơn thì hiệu quả ức chế cần phải so sánh với một chất được biết có khă năng ức chế enzyme α-amylase. Hiện nay, thuốc Glucobay đang được sử dụng lâm sàng, được biết trong điều trị bệnh ĐTĐ loại 2 với khả năng làm ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-glucosidase [16]. Thuốc có thành phần chính là chất acarbose (một tetrasaccharide) nên thường được gọi là thuốc Acarbose. Vì vậy, thử nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose được thực hiện với kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 2.
Bảng 2: Ảnh hưởng các nồng độ khác nhau của Acarbose lên hoạt tính enzyme α-amylase.
Ghi chú: các chữ cái theo sau các giá trị trong một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Nồng độ Acarbose (mg/ml) Hiệu suất ức chế (%)
0 0a
0,01 12,38b ± 0,444
0,02 33,84c ± 0,361
0,03 52,98d ± 0,471
0,04 58,53e ± 0,384
0,05 63,28f ± 0,46
0,06 68,04g ± 0,565
0,07 77,64h ± 0,683
0,08 78,31h ± 0,423
0,09 81,29i ± 0,629
0,1 86,13j ± 0,497
Kết quả trình bày trong Bảng 2 đã thể hiện rõ khả năng ức chế enzyme α- amylase của Acarbose thông qua hiệu suất ức chế được xác định từ nồng độ Acarbose 0,01 đến 0,1 mg/ml. Điều này chứng tỏ Acarbose có khả năng kìm hãm trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase kết hợp với cơ chất là tinh bột nên khi tăng nồng độ chất kìm hãm là Acarbose thì lượng tinh bột còn lại sau phản ứng càng tăng làm cho hiệu suất phản ứng thấp hay nói cách khác lượng enzyme bị ức chế càng nhiều. Tuy nhiên, khi nồng độ Acarbose được tăng gấp đôi thì hiệu suất ức chế không tăng lên gấp đôi. Điều này cho thấy, lượng enzyme bị ức chế phụ thuộc vào từng nồng độ Acarbose.
Kết quả được trình bày ở Hình 4 cho thấy hiệu suất ức chế tăng từ nồng độ Acarbose thấp nhất là 0,01 mg/ml đến nồng độ có lượng enzyme bị ức chế cao nhất (86,13% ± 0,497) là nồng độ 0,1 mg/ml Acarbose. Hiệu suất ức chế cũng
Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose.
-25-
chính là lượng enzyme bị ức chế được tính trong thí nghiệm. Hầu hết các kết quả thu được đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%, ngoại trừ nồng độ Acarbose 0,07 và 0,08 mg/ml ức chế hoạt động của enzyme ở mức phần trăm lần lượt là 77,64% ± 0,683 và 78,31% ± 0,423 không có khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Trong mỗi thí nghiệm khảo sát hoạt tính hay khả năng ức chế của một chất đối với enzyme cũng cần phải so sánh với một mẫu chuẩn để định lượng cũng như đánh giá khả năng cần khảo sát của mẫu được thí nghiệm. Vì vậy, trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol RTCT của đề tài cũng phải xây dựng đường chuẩn để so sánh. Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô RTCT được so sánh với hiệu quả ức chế enzyme này của thuốc trị bệnh ĐTĐ nhằm đánh giá hiệu quả tác động của cao thô RTCT. Trong đề tài này, Acarbose được sử dụng như một mẫu chuẩn để xây dựng phương trình đường chuẩn. Từ đó, khả năng ức chế enzyme α-amylase của RTCT được xác định tương đương với nồng độ Acarbose. Đường chuẩn thể hiện kết quả ức chế enzyme α-amylase của Acarbose tăng tuyến tính với nồng độ Acarbose.
Phương trình đường chuẩn được xây dựng với mục đích xác định giá trị ức chế 50% enzyme (IC50) của Acarbose và hàm lượng chất ức chế có trong cao thô.
Giá trị nồng độ Acarbose ức chế 50% lượng enzyme (IC50) là 0,036 mg/ml, được tính dựa vào phương trình đường chuẩn Acarbose y = 621,8x + 27,662 với y là phần trăm enzyme bị ức chế và x là nồng độ Acarbose. Cụ thể với các nồng độ Acarbose được chọn trình bày trong Hình 5 có thể thấy các điểm chấm thể hiện kết quả ức chế enzyme của các nồng độ Acarbose 0; 0,02; 0,06; 0,08 và 0,1 mg/ml tập trung gần sát đường chuẩn và tăng theo hướng đường chuẩn; tuy nhiên điểm chấm ở nồng độ Acarbose 0,04 mg/ml nằm cách xa đường chuẩn, điều này đã làm giảm mối tương quan giữa nồng độ Acarbose và lượng enzyme bị ức chế nên R-sq chỉ đạt 93,976%. Mặc dù vậy, trong phương trình hồi quy tuyến tính của nồng độ Acarbose với hiệu suất ức chế ở phụ lục A cho thấy nồng độ Acarbose 0,04 mg/ml vẫn nằm trong khoảng tin cậy 95% và phần lớn khả năng ức chế enzyme α-amylase ở các nồng độ Acarbose 0,02; 0,06; 0,08 và 0,1 mg/ml tăng tuyến tính nên chọn các điểm nồng độ trên để xây dựng đường chuẩn. Hệ số xác định R2 = 0,93976 khá cao có nghĩa là mối liên hệ giữa lượng enzyme bị ức chế và nồng độ Acarbose chặt chẽ, hay nói cách khác, phương trình đường chuẩn Hình 5. Đường chuẩn khả năng ức chế hoạt động enzyme α-amylase của Acarbose.
-27-
y = 621,8x + 27,662 được xây dựng có ý nghĩa về mặt thống kê và có thể dự đoán nồng độ Acarbose thông qua lượng enzyme bị ức chế.
III. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chiết ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột
Trong những năm gần đây, không ít người trên thế giới đang phải đối mặt với những hậu quả nặng nề do bệnh ĐTĐ gây ra. Vì vậy, các nhà khoa học luôn quan tâm nghiên cứu những phương pháp điều trị bệnh, đặc biệt là hữu hiệu trong việc làm giảm glucose huyết tạm thời cho người mắc bệnh ĐTĐ. Một mặt có thể khống chế và ngăn ngừa bệnh tiến triển nặng hơn, mặt khác có thể giảm đi những biến chứng nguy hiểm của bệnh. Song song đó, từ việc nghiên cứu các chất trong thực vật có khả năng ức chế một số enzyme thuỷ phân tinh bột in vitro đến nghiên cứu trên chuột mắc bệnh ĐTĐ đã được rất nhiều công trình nghiên cứu ở một số trường đại học trên thế giới áp dụng và công bố thành công. Kết quả chứng minh được khả năng hạ glucose huyết ở các loài thực vật như Đậu Tây (Phaseolus vulgaris) [30], Sen (Nelumbo nucifera) [31], Ổi (Psidium guajava) [32]. Ở Việt Nam cũng có không ít nghiên cứu liên quan đến việc giảm glucose huyết trên rễ cây Nhàu [28], Khổ Qua [29] được công bố. Và đề tài này đã xác định được khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) ở mức đáng kể.
Ruột trái Cau Trắng được tách ra từ trái Cau Trắng nguyên vẹn ở giai đoạn trung gian trong quá trình phát triển và qua các bước xử lý để cô cạn thành cao thô ethanol. Thí nghiệm sử dụng cao thô RTCT để khảo sát khả năng cao thô ức chế hoạt tính của enzyme α-amylase in vitro. Dựa vào phương trình đường chuẩn Acarbose y = 621,8x + 27,662 (R2 = 0,93976), hàm lượng chất ức chế enzyme α-amylase có trong cao thô tương đương với nồng độ Acarbose được xác định. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3: Hàm lượng chất ức chế có trong cao thô ethanol RTCT tương đương với nồng độ Acarbose (mg/ml).
Ghi chú: các chữ cái theo sau các giá trị trong một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả trình bày ở Bảng 3 cho thấy khi tăng nồng độ cao thô ethanol RTCT thì nồng độ Acarbose tương ứng cũng tăng theo. Điều này cho thấy cao thô RTCT có chứa thành phần hoá học có khả năng kìm hãm trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase cũng giống như Acarbose. Như vậy, nồng độ cao thô từ 0,4; 0,6 và 0,8 mg/ml tương đương với nồng độ Acarbose được xác định lần lượt là 0,027; 0,041 và 0,084 mg/ml. Do lượng enzyme bị ức chế ở nồng độ cao thô 0,2; 1 và 1,2 mg/ml không nằm trong khoảng phần trăm enzyme bị ức chế của đường chuẩn đã dựng nên không xác định được. Kết quả còn cho thấy khi tăng nồng độ cao thô RTCT lên thì hiệu suất ức chế enzyme cũng tăng theo.
Lượng enzyme α-amylase bị ức chế khá cao ở nồng độ cao thô 0,2 mg/ml (30,66% ± 1,75). Điều này chứng tỏ ở nồng độ cao thô này có chứa khá nhiều hàm lượng chất ức chế enzyme. Tiếp tục, nồng độ cao thô được tăng lên 0,4 mg/ml (44,16% ± 0,557) thì khả năng ức chế enzyme được cho là tăng đáng kể dựa trên kết quả xử lí thống kê ở phụ lục B là khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Ở nồng độ cao thô 0,6 mg/ml với hiệu quả ức chế là 52,97% ± 1,91 có sự
Nồng độ cao thô ethanol RTCT
(mg/ml)
Hiệu suất enzyme bị ức chế (%)
Hàm lượng chất ức chế có trong cao thô tương đương với nồng độ
Acarbose (mg/ml)
0 0a 0
0,2 30,66b ± 1,75 Không xác định
0,4 44,16c ± 0,557 0,027
0,6 52,97d ± 1,91 0,041
0,8 79,84e ± 1,34 0,084
1 89,8f ± 1,02 Không xác định
1,2 90,18f ± 0,647 Không xác định
-29-
chênh lệch khá cao với nồng độ cao thô 0,4 mg/ml. Với chiều hướng đó, lượng enzyme bị ức chế vẫn tăng với hiệu suất ức chế 79,84% ± 1,34 khi tăng nồng độ cao thô lên 0,8 mg/ml. So với nồng độ cao thô 0,6 mg/ml, lượng enzyme bị ức chế đã tăng thêm rất cao và có khác biệt về mặt thống kê. Tiếp tục, khả năng ức chế enzyme tăng khi tăng nồng độ cao thô lên 1 mg/ml (89,8% ± 1,02). Tuy nhiên, với nồng độ cao thô 1,2 mg/ml (90,18% ± 0,647) lượng enzyme bị ức chế vẫn tăng nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% dựa trên kết quả thống kê ở phụ lục B, hay nói cách khác, hiệu suất ức chế của nồng độ cao thô RTCT 1 và 1,2 mg/ml không khác biệt trong phản ứng có cùng một nồng độ tinh bột 0,5 mg/ml đóng vai trò là cơ chất với nồng độ enzyme 1,5 U chứng tỏ trung tâm hoạt động của enzyme đã bão hoà nên hiệu suất ức chế chỉ tăng đến một giá trị nhất định và không tăng thêm nữa. Vì vậy, việc tăng thêm nồng độ cao thô đồng nghĩa với việc nồng độ chất ức chế có trong cao thô được tăng lên không có ý nghĩa bởi không làm tăng hiệu suất ức chế. Nên việc khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của RTCT dừng lại ở nồng độ cao thô RTCT 1,2 mg/ml. Nồng độ ức chế enzyme α-amylase của cao thô ethanol RTCT cao nhất được khảo sát trong thí nghiệm này là 1,2 mg/ml với hiệu quả ức chế đến 90,18%
± 0,647.
Việc xác định hàm lượng chất ức chế có trong cao thô tương đương với nồng độ Acarbose giúp định lượng tương đối khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô, tuy nhiên để xem xét mức độ ảnh hưởng của cao thô RTCT đến hoạt tính enzyme này như thế nào so với Acarbose thì cần phải xác định nồng độ ức chế 50% enzyme (IC50) của cao. Dựa trên kết quả đường chuẩn của cao thô ở phụ lục B, giá trị IC50 của cao thô RTCT được xác định là 0,503 mg/ml. So với IC50
của Acarbose là 0,036 mg/ml thì IC50 của cao thô cao hơn gấp 13,97 lần. Điều này cho thấy phải cần lượng lớn cao thô mới đạt hiệu suất ức chế 50%. Tuy thuốc Acarbose có hiệu quả ức chế enzyme α-amylase cao nhưng có giá thành đắt và nhiều tác dụng không mong muốn [33]. Do vậy, khả năng ức chế được hoạt động của enzyme α-amylase của cao thô RTCT được phát hiện là một thông tin rất có ích và khả quan bởi Cau Trắng là một loài cây kiểng được trồng phổ
biến và sẽ là một nguồn thảo dược lớn, rẻ tiền khi được đưa vào sử dụng làm thực phẩm chức năng trong điều trị bệnh ĐTĐ.
Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh một trong các phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ loại 2 là làm giảm mức glucose huyết thông qua sự ức chế enzyme thuỷ phân carbohydrate là alpha-amylase [34]. Enzyme α-amylase là một trong những sản phẩm tiết chính của tuyến tuỵ và tuyến nước bọt, đóng vai trò quan trọng thực hiện bước đầu tiên trong việc tiêu hoá tinh bột và glycogen [35]. Việc ức chế enzyme này sẽ làm đình trệ việc tiêu hoá carbohydrat của các enzyme khác. Vì vậy, nếu ức chế được hoạt động của enzyme α-amylase sẽ làm quá trình thuỷ phân tinh bột chậm lại. Như vậy, lượng glucose được tạo ra từ từ nên glucose huyết sẽ giảm. Bệnh ĐTĐ có mức glucose huyết cao nên ức chế enzyme α-amylase cũng là một trong các mục tiêu giúp hạ glucose huyết trong trị bệnh ĐTĐ. Do đó, enzyme α-amylase đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh ĐTĐ. Chính vì vậy, đề tài được thực hiện và đã chứng minh được khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao thô ruột trái Cau Trắng như là một thông tin hữu ích để tạo cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu hướng đến điều trị bệnh ĐTĐ.