1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm Sinh học và phòng thí nghiệm Hoá học của Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
2. Mẫu vật, hoá chất và thiết bị 2.1. Mẫu vật
Trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) không được phun xịt thuốc bảo vệ thực vật, được thu hái tại Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ, Thành Phố Cần Thơ.
2.2. Hoá chất
Một số hoá chất được dùng trong đề tài: enzyme α-amylase trích từ tuỵ heo (Sigma – Aldrich – Mỹ), tinh bột (Trung Quốc), thuốc Acarbose (Wako – Nhật), Dimethylsulfoxide (DMSO) (Meck – Đức), ethanol 96°, HCl đậm đặc, Iodine, KI, Na2HPO4, NaH2PO4.
2.3. Thiết bị
Máy đo quang phổ Beckman Coulter 640B (Mỹ), máy cô quay chân không Heidolph (Đức), máy đo pH Metler Toledo, máy khuấy từ, máy trộn mẫu Vortex, máy ổn nhiệt, cân phân tích AB104 (Thuỵ Sĩ), eppendorf, micropipette và một số dụng cụ khác.
II. Phương pháp thí nghiệm
1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Buồng Cau được thu hái và được xác định phần ruột của trái Cau là ở giai đoạn trung gian giữa non và già trước khi xử lý. Trái Cau ở giai đoạn trung gian sẽ có phần ruột mềm, ở giữa có lỗ rỗng chứa nước như Hình 2.
Độ ẩm tương đối của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô được xác định theo công thức sau :
H% là ký hiệu độ ẩm tương đối của nguyên liệu, biểu thị lượng nước có trong ruột trái Cau Trắng. Giá trị H% càng cao chứng tỏ ruột trái Cau Trắng càng chứa nhiều nước.
2. Phương pháp chiết cao thô ruột trái Cau Trắng bằng dung môi ethanol Buồng Cau được thu về và chọn ra những trái có ruột mềm như Hình 2, sau đó trái Cau được tách lấy phần ruột, đem phơi khô, nghiền nhỏ. Sau khi nghiền, đem ngâm trong ethanol 96°, 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọc lấy phần dịch và cô cạn thành cao bằng hệ thống máy cô quay để loại bỏ ethanol. Cao thô ethanol thu được từ mẫu ruột của trái Cau Trắng được trữ lạnh ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm.
trọng lượng tươi (g) – trọng lượng khô (g) trọng lượng tươi (g)
Í 100 H% =
Hình 2. Trái Cau Trắng ở giai đoạn trung gian giữa non và già được chẻ đôi.
-19-
3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của Acarbose trong phản ứng chuyển hoá tinh bột
Thí nghiệm được thực hiện gồm 10 ống nghiệm với các nồng độ Acarbose lần lượt từ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09 đến 0,1 mg/ml; một ống đối chứng có nồng độ Acarbose bằng 0 mg/ml và một ống chứa nồng độ tinh bột ban đầu có nồng độ enzyme và nồng độ Acarbose bằng 0 mg/ml. Mỗi ống nghiệm được lặp lại 3 lần.
Thuốc Acarbose được pha trong nước cất thành dung dịch gốc nồng độ 100 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các nồng độ tương ứng với các nồng độ Acarbose được sử dụng trong thí nghiệm. Enzyme α-amylase được pha trong dung dịch đệm phosphate natri pH 7 thành nồng độ 1 mg/ml tương đương 30 U/ml (U). Tinh bột được pha trong nước cất thành nồng độ 2 mg/ml và đun bằng lò vi sóng cho đến khi tan hết.
Thớ nghiệm được thực hiện như sau: hỗn hợp phản ứng gồm 100 àl dung dịch đệm phosphate natri pH 7 với 100 àl Acarbose nồng độ lần lượt từ 0,1 đến 1 mg/ml và 50 àl enzyme α-amylase nồng độ 30 U được đem ủ ở nhiệt độ 37°C trong 10 phỳt. Sau đú, 250 àl tinh bột nồng độ 2 mg/ml được cho vào hỗn hợp trờn và ủ tiếp tục ở 37°C trong 10 phỳt. Tiếp theo, 200 àl dung dịch HCl đậm đặc được cho vào để ngừng phản ứng trong hỗn hợp và 300 àl dung dịch thuốc thử iod để nhận biết lượng tinh bột còn thừa sau khi dừng phản ứng dựa trên phản ứng màu xanh đặc trưng của phức hợp tinh bột-iod. Nồng độ tinh bột được sử dụng trong phản ứng là 0,5 mg/ml; nồng độ enzyme là 1,5 U và nồng độ Acarbose lần lượt là 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1 mg/ml. Nồng độ tinh bột và nồng độ enzyme trên được cho là phù hợp để sử dụng dựa trên kết quả nghiên cứu khảo sát khả năng ức chế hoạt động enzyme α- amylase của cao chiết lá Nhàu của Lê Bá Tước và Mã Thanh Tòng [27].
Cách thu nhận kết quả: hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 660 nm để xác định lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng thông qua kết quả mật độ quang (OD). Bước sóng 660 nm là bước sóng tối ưu nhạy với phức hợp tinh bột-iod, đã được khảo sát bởi các nghiên cứu trước đây [28, 29].
Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất phản ứng và hiệu suất ức chế.
Hiệu suất phản ứng được tính dựa trên lượng tinh bột còn dư sau khi đã ngừng phản ứng thuỷ phân lại.
A0: Giá trị đo mật độ quang (OD) của dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu)
A1: Giá trị đo mật độ quang (OD) của dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột còn lại sau phản ứng)
Hiệu suất ức chế là lượng enzyme bị ức chế trong phản ứng.
4. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol ruột trái Cau Trắng (Veitchia merrillii Wendl.) trong phản ứng chuyển hoá tinh bột
Thí nghiệm được thực hiện gồm 6 nghiệm thức với các nồng độ cao thô ruột trái Cau Trắng lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 và 1,2 mg/ml; một ống nghiệm chứa nồng độ tinh bột ban đầu có nồng độ enzyme và cao thô bằng 0 mg/ml và một ống đối chứng có nồng độ cao thô bằng 0 mg/ml. Mỗi ống nghiệm được lặp lại 3 lần.
Cao thô ruột trái Cau Trắng được pha trong dung dịch DMSO thành nồng độ 100 mg/ml, sau đó hỗn hợp được trộn đều bằng máy Vortex để hoà tan cao.
Tiếp tục, hỗn hợp được li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Phần dịch chiết thu được sẽ được pha loãng ra trong dung dịch DMSO ở các nồng độ tương ứng với các nồng độ Acarbose được sử dụng trong thí nghiệm. Nghiên cứu trước đây trên cao chiết lá Nhàu cũng đã chứng minh dung môi DMSO không làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme α-amylase trong phản ứng thuỷ phân tinh bột [27].
Trong thí nghiệm, nồng độ tinh bột được sử dụng là 0,5 mg/ml; nồng độ enzyme là 1,5 U; nồng độ cao thô lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 và 1,2 mg/ml.
Phản ứng được thực hiện tương tự mục 3 với Acarbose được thay thế bằng cao thô RTCT.
Hiệu suất ức chế (%) = 100% – hiệu suất phản ứng (%) Hiệu suất phản ứng (%) = 100 x ((A0 – A1)/A0)
-21-
Cách thu nhận kết quả: hỗn hợp trên được đo độ hấp thu quang phổ của phức hợp tinh bột-iod ở bước sóng 660 nm để xác định lượng tinh bột thừa sau phản ứng.
Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất phản ứng và hiệu suất ức chế được tính tương tự như mục 3.
5. Phương pháp xử lí kết quả
Số liệu thu được từ các thí nghiệm được tính toán, phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16, vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel và kết quả được trình bày dưới dạng hiệu suất ức chế ± SEM.