ứng dụng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản và xử lý môi trường

1 CHƯƠNG 1 VI KHUẨN Cấu trúc, chức năng, các đặc trưng về hình thái I. Sự phân bố vi khuẩn 1.Sự phân bố vi khuẩn trong không khí - Mật số thấp, tồn tại một thời gian ngắn do sự khô khan và tia sáng mặt trời (tia tử ngoại,UV) tiêu diệt. - Số lượng vi khuẩn trong không khí tùy thuộc vào lượng bụi trong không khí và số lượng vi khuẩn có trong vùng đất nơi đó. - Mật số và loại vi khuẩn thay đổi tùy theo mùa, điều kiện khí hậu. - Tuy mật số có thấp nhưng rất quan trọng vì không khí là phương tiện giúp lan truyền vi khuẩn từ nơi nầy sang nơi khác, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp, mắt. 2.Sự phân bố vi khuẩn trong đất - Loại và số lượng vi khuẩn tùy thuộc vào loại đất, độ chua của đất (pH), vị trí trên địa cầu, độ ẩm, thành phần các hợp chất hữu cơ trong đất, độ thoáng khí, độ sâu của tầng đất và thành phần của các loại cây trồng trên đất. - Vi khuẩn đóng vai trò trong sự phân hủy các hợp chất hữu cơ tạo thành chất mùn, cố định đạm tự do và cộng sinh - Vi khuẩn có tác hại như vi khuẩn khử đạm, gây bệnh cho hệ thống rễ cây.. 3.Sự phân bố vi khuẩn trong nước - Nước là mội trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và sinh sản vì có nhiều thức ăn và điều kiện thích hợp. - Lượng vi khuẩn khác nhau tùy thuộc nguồn nước: nước biển, sông ngòi, suối, ao, hồ nước mặn. a. Nước ao hồ: số lượng và loại vi khuẩn tùy thuộc vào: - Khoảng cách bờ - ánh sáng và thời tiết - Chiều sâu của ao hồ b. Nước sông - Thuận lợi cho vi khuẩn phát triển vì có nhiều chất hữu cơ, muối khoáng và được luân chuyển liên tục nên thoáng khí. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 2 - Sự phân bố của vi khuẩn trên một dòng sông tùy thuộc vào: vị trí sông và tốc độ dòng nước. c. Nước biển - Có nhiều vi khuẩn do được cung cấp nguồn thức ăn từ các sông ngòi chảy ra biển liên tục. - Các loài vi khuẩn phân hủy đặc biệt là các vi khuẩn phân hủy chất béo như Clostridium, Pseudomonadaceae đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành các mõ dầu ở đáy đại dương. 4. Các vi khuẩn ký sinh ở người và sinh vật khác - Trên da: chủ yếu là các vi khuẩn Gram + thuộc các loài của Staphylococcus, corynebacterium, các vi khuẩn propionibacterium. Một số ít vi khuẩn Gram- cũng được tìm thấy trên da như Acinetobacter. Nhiệt độ và ẩm độ ảnh hưởng quan trọng đến mật số và sự phát triển của vi khuẩn trên da. - Ở miệng: các vi khuẩn ở đây phức tạp và đa dạng. Nước bọt không là môi trường tốt cho vi khuẩn vì nước bọt có các enzim lysozim và lactoperoxidase. Lysozim cắt nối glycosidic của peptidoglycan làm vỏ tế bào bi yếu và tế bào bị phân hủy. Lactoperoxydase hiện diện trong sữa giết chết vi khuẩn nhờ phản ứng của các ion chlor và H2O2 . Các loài vi khuẩn trên răng như Streptococcus sobrinus và S. mitis, tạo ra các sản phẩm có tính acit làm hư răng. - Ở hệ thống hô hấp trên (mũi và vòm họng) vi khuẩn sống nhờ vào dịch do màng nhầy nơi đây tiết ra; hệ thống hô hấp dưới (khí quản, phế quản và phổi). - Trong hệ tiêu hóa: vi khuẩn trong dạ dầy, ruột non và ruột già. Escherichia coli hiện diện với mật số thấp hơn các vi khuẩn khác (khoảng > 10 7/g). Các loại vi khuẩn nơi đây gồm các loại Gram âm, hiếu khí không bắt buộc hay kỵ khí bắt buộc, hình que. II. Hình dạng và kích thước 1.Hình dạng - Hình cầu, que và xoắn - Sống đơn độc, biệt lập hay từng cặp, chuỗi, xoắn, tế bào không thông nhau - Hình dạng ảnh hưởng đến khả năng dinh dưỡng và sức chịu đựng của tế bào: hình cầu chống lại sự khô khan tốt hơn hình que và xoắn. Ngược lại, hình que và xoắn hấp thu thức ăn tốt hơn hình cầu nhờ diện tích tiếp xúc rộng hơn. 2.Kích thước: rất nhỏ mắt thường không trông thấy, trung bình đường kính 0,5 µ và dài 2-3µ III. Cấu tạo hóa học Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 3 1. Nước: chiếm khoảng 80% trọng lượng tế bào - Là dung môi chứa các cấu tử vô cơ và hữu cơ của tế bào, là môi trường xảy ra các phản ứng hóa học giữa các phân tử tế bào. - Ở dưới 2 trạng thái: tự do và kết hợp với các cấu tử khác trong tế bào. - Trọng lượcg nước thay đổi tùy theo điều kiện tăng trưởng và thành phần các phế liệu do hoạt động của tế bào sinh ra. 2.Thành phần các nguyên tố: thay đổi tùy từng loại tế bào. Carbon chiếm khoảng 50% trọng lượng khô (TLK) tế bào, nitrogen từ 8-15%, hydro 10%, oxygen 20%, và 5% còn lại gồm Na, Mg, Ca, P, Fe.. 3. Thành phần hữu cơ a. Nhóm tan trong acid: gồm các ion vô cơ và các phân tử hữu cơ nhỏ. Các phân tử hữu cơ gồm các phân tử thức ăn, chất trung gian biến dưỡng (đường đơn giản, acid hữu cơ, acid amin, các nucleotid, vitamin...). Thành phần và nồng độ các chất nầy tùy thuộc vào trạng thái sinh lý, sinh hóa của tế bào. b. Nhóm không tan trong acid: gồm acid nhân, lipid, protein,carbohydrate. Carbohydrate ở dưới 2 dạng: tự do và kiến trúc. Carbohydrate tự do gồm đường đơn giản như glucose, fructose..đây là nguồn năng lượng và carbon của tế bào. Carbohydrate kiến trúc kết hợp với các phân tử khác tạo thành cơ cấu tế bào như màng tế bào chất, vỏ tế bào, vỏ nhầy... IV. Cấu trúc tế bào vi khuẩn 1. Chiên mao a. Hình dạng - Là cơ quan giúp tế bào chuyển động bằng cử động xoắn ốc hay vặn nút chai. - Đường kính thay đổi tùy loài: 100 - 200 Å - Chiên mao gắn một đầu vào tế bào, đầu kia tự do. - Cách sắp xếp chiên mao trên thân tế bào thay đổi tùy theo loài: 1 chiên mao ở 1 đầu hay 2 đầu, chùm chiên mao ở 1 đầu hay 2 đầu, phân phối đều khắp tế bào. b. Cấu tạo: bởi 99% là protein. Chiên mao gồm 3 phần: * Thân: phần dài nhất, hình xoắn lơi, cấu tạo bởi protein kiến trúc hình sợi:flagellin có phân tử khối 20.000 - 45.000. Thân chiên mao tan trong acid cho dung dịch chứa các sợi flagellin rời rạc, nếu trung hòa dung dịch các sợi nầy kết hợp lại cho thân chiên mao như cũ. Flagellin cấu tạo bởi ít acid amin vòng, acid amin chứa lưu huỳnh và nhiều acid aspartic và acid glutamic hơn protein thường. Thân chiên mao được cấu tạo bởi 9 sợi vòng ngoài và 1 sợi đôi trung tâm (khác với tế bào chân hạch là 9 sợi đôi vòng ngoài và 1 sợi đôi trung tâm) Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 4 * Trung thể: đoạn giữa chiên mao, nằm ngoài tế bào, ngắn hơn thân chiên mao nhưng to hơn. ở E. coli dài 450 Å * Động thể: gắn chiên mao vào tế bào, gồm 1 trục và nhiều dĩa: dĩa M gắn vào màng tế bào, dĩa S nằm ngoài màng. c. Nhiệm vụ: là cơ quan cử động của tế bào, mất chiên mao tế bào không cử động cho tới khi chiên mao mới mọc lại, trung bình tế bào vi khuẩn có chiên mao di động được khoảng 50 µ /giây 2. Tiêm mao: tìm gặp ở một số vi khuẩn Gram âm. Tiêm mao ngắn hơn và nhỏ hơn chiên mao, nhưng nhiều hơn. Hình dạng gần giống như chiên mao. Mỗi tế bào có thể có tới 100 - 250 tiêm mao phân phối rải rác khắp tế bào. Nhiệm vụ tiêm mao chưa biết cụ thể, có thể là cầu nối giữa 2 tế bào lúc bắt cặp để trao đổi acid nhân. 3. Cơ quan cử động khác Vi khuẩn Spirochete có sợi đàn hồi nối 2 đầu tế bào lại. Nhờ sợi đàn hồi giúp tế bào di chuyển như con rắn. 4. Vỏ nhầy và lớp nhầy: khi lớp hữu cơ bao quanh vỏ tế bào có cơ cấu và giới hạn: vỏ nhầy hay lớp hữu cơ không có giới hạn rõ rệt: lớp nhầy. Tế bào có thể có vỏ nhầy, lớp nhầy hay cả hai. a. Đặc tính: có tính đàn hồi, chiết suất gần bằng chiết suất môi trường nên khó thấy, không ăn màu thuốc nhuộm thông thường và trong suốt với chùm tia điện tử nên hình dạng, kích thước và cơ cấu bên trong các lớp hữu cơ khó quan sát. b. Cấu tạo hóa học: thay đổi tùy theo loài, cấu tạo bởi polysaccharide, acid hữu cơ, protein, lipid. Cấu tạo hóa học thay đổi theo điều kiện sinh lý, sinh hóa môi trường và thành phần thức ăn nuôi vi khuẩn. Cấu tạo hóa học không thay đổi ở các loài vi khuẩn gây bệnh. c. Nhiệm vụ: chống sự mất nước của tế bào, chống các hạch bạch huyết và nguyên sinh động vật, giúp tế bào bám vào vật lạ, và là cơ quan định đoạt hoạt tính của vi khuẩn. 5. Vỏ tế bào a. Đặc tính: chiếm 20% TLK tế bào, thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của mẻ cấy: khi tế bào phân cắt nhanh: vỏ mỏmg, lúc tế bào phân cắt chậm: vỏ dầy hơn. Vỏ đầy 100 - 200 Å, vỏ tế bào Gram âm mỏmg hơn tế bào Gram dương nhưng bên ngoài vỏ tế bào Gram âm có thêm 1 lớp lipo-polysaccharides và protein bên ngoài. Do được cấu tạo bởi các phân tử hữu cơ kết hợp theo hình mắc cáo nên vỏ có tính đàn hồi và vững chắc. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 5 b. Cấu tạo hóa học: cấu tạo bởi lipid, polysaccharides và glucosamine. Vỏ tế bào Gram dương chứa ít lipid hơn Gram âm nhưng có nhiều glucosamine hơn vỏ tế bào Gram âm. Vỏ tế bào cấu tạo bởi 2 chất dẫn xuất đường chính là N - Acetyl glucosamine và N - Acetyl muramic acid. Ngoài ra còn có các acid amin khác như L - Alanine, D - Glutamic acid, Lysine, Diaminopimelic acid. Các phân tử hữu cơ hóa hợp thành các đơn vị cấu tạo gọi là peptidoglycan. Vỏ tế bào Gram dương có thêm 1 acid đặc biệt là acid teichoic. Acid nầy cấu tạo bởi các phân tử glycerol hay ribitol nối với nhau bằng các cầu nối ester phosphate. c. Nhiệm vụ: giúp giữ tế bào có hình dạng nhất định, chống các biến đổi đột ngột của môi trường về áp suất thẩm thấu, sức ép.. d. Tổng hợp vỏ tế bào: có 4 giai đoạn - Tổng hợp tiền chất - Gắn tiền chất vào màng lipid - Thành lập chất trùng hợp - Thành lập cầu nối giữa các chất trùng hợp 6. Màng tế bào chất a. Đặc tính: có tính bán thấm. Lúc còn non, bán đậm đặc, trưởng thành dầy và đậm đặc hơn. màng dầy 50 - 130 Å, chiếm khoảng 10 - 20% TLK tế bào. b. Thành phần hóa học: cấu tạo bởi protein (50%), lipid (28 - 30%), carbohydrate (15 - 20%), còn lại là ARN, P...Kiến trúc tương tự như tế bào sinh vật chân hạch: các phân tử phospholipid xếp thành 2 lớp đơn phân tử, đầu mang điện tích hướng ra ngoài và 2 đuôi trung hòa hướng vào trong, kế đến là 2 lớp chứa protein. Cấu tạo màng tế bào chất của vi khuẩn khác tế bào động vật ở các điểm sau: - Màng tế bào chất của vi khuẩn không chứa sterol trừ nhóm mycoplasma. - Không có hay có rất ít phospholipid glycerol phosphoryl choline - Có chứa phospholipid glycerol phosphoryl ethanolamine. - Chứa nhiều phân tử acid béo chia nhánh. c. Nhiệm vụ: chọn lọc chất trao đổi giữa tế bào và môi trường bên ngoài, chứa bộ máy quang tổng hợp ở vi khuẩn quang tự dưỡng, các enzyme dự phần vào phản ứng hô hấp 7. Tế bào chất a. Đặc tính: trong mẻ cấy mới, tế bào chất có vẻ đồng nhất, khi mẻ cấy già có nhiều hạt có kích thước khác nhau xuất hiện trong tế bào chất có thể là các hạt Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 6 dự trử hay không bào. Sự di chuyển của dòng tế bào chất không có do tế bào quá nhỏ không cần dòng tế bào chất b. Các thể trong tế bào chất: * Meso thể (mesosomes): là các túi hay phiến gấp nếp thông với màng tế bào chất. Nhiệm vụ có lẻ tham dự vào phản ứng tổng hợp vỏ tế bào và sự phân cắt nhân thể và là phương tiện gia tăng diện tích của màng tế bào để màng có thể đảm nhận các chức năng hô hấp tổng hợp. * Ribo thể (ribosomes): là các hạt có đường kính 100 - 200 Å, mỗi tế bào có thể có tới 10.000 hạt ribo thể. Ribo thể được cấu tạo bởi 60% là ARN và 40% là protein. Kích thước ribo thể rất nhỏ bé, hằng số trầm lắng là 70S. Ribo thể cấu tạo bởi 2 bán đơn vị độc lập và có kích thước không bằng nhau. Nhiệm vụ ribo thể là trung tâm tổng hợp protein của tế bào. * Khí bào (gas vacuoles): thường gặp ở tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lam sống ở môi trường nước như ao, hồ, ruộng lúa. ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng nào đó khí bào tích tụ nhiều khí làm cho tế bào nhẹ nổi lên mặt nước tạo ra hiện tượng hoa rong (algae bloom). Điều đặc biệt là màng bao quanh khí bào được cấu tạo bởi protein chớ không phải là lipid như các màng khác của tế bào * Tích thể và chất dự trử: - Volutin là các hạt chứa phosphate. - Sulfure, gặp ở các vi khuẩn quang duỡng lưu huỳnh - Polysaccharides gồm glycogen, hạt tinh bột. - Lipid, gặp nhiều nhất là các poly - β - hydroxy butyric acid (PHB) - Các hạt khác: prodigiosin, indigoidin, violacein, phenazines và các sắc tố huỳnh quang. * Vùng nhân:Acid nhân hay vật liệu di truyền tụ tập tại một vùng trong tế bào chất gọi là vùng nhân. Mỗi vùng nhân chỉ có 1 phân tử ADN duy nhất. ADN rất dài so với kích thước tế bào mang nó. E. coli dài 2 µ có ADN dài 1100 - 1400 µ. Khi tế bào phân cắt ADN được dùng làm khuôn để tổng hợp ra 2 phân tử ADN mới. *Plasmid α. Đặc tính - Plasmid là phân tử di truyền có ADN dạng vòng kín - Có khả năng tự phân cắt và có nhiểm thể riêng - Có thể chuyển từ tế bào nầy sang tế bào khác bằng cách tiếp hợp hay kết hợp với nhiểm thể - Plasmid có chứa nhiều gen như kháng kháng sinh, kim loại nặng, sản xuất độc tố.. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 7 β. Cấu tạo - Kích thước plasmid rất biến động từ 1 đến hơn 1.000 kilobase pairs tức chỉ bằng khoảng 1/20 kích thước của nhiểm thể - Cấu trúc vòng đôi xoắn kín - Trọng lượng phân tử rất thay đổi từ 2x106 đến > 108 γ. Sự phân cắt - Tham gia thúc đẩy quá trình phân cắt plasmid là các enzim thông thường của tế bào - Sự phân cắt plasmid độc lập với sự phân cắt của tế bào nhưng cũng có sự kiểm soát của tế bào - Plasmid của vi khuẩn Gram âm (G-) phân cắt gần giống như sự phân cắt của nhiểm thể, thời gian phân cắt bằng 1/10 hay ít hơn thời gian phân cắt của tế bào - Plasmid của vi khuẩn Gram dương (G+) phân cắt gần giống như sự phân cắt của thực khuẩn ϕ x 174. * Nội bào tử: thường gặp ở Bacillus, Clostridium, Vibrio, Spirillum. Mỗi tế bào thường có 1 nội bào tử. Nội bào tử có khả năng sống tiềm sinh chống lại điều kiện khó khăn của môi trường. Nội bào tử có tính chiết quang nên có thể quan sát được bằng kính hiển vi thường. Vị trí của nội bào tử trong tế bào vi khuẩn thay đổi theo loài: có thể thành lập ở một đầu, gần đầu hay giữa tế bào. Cơ cấu của nội bào tử gồm nhiều lớp - Lớp Exosporium: là màng mỏng gấp nếp nhiều lần, độ chiết quang thấp nên khó quan sát. - Áo: gồm 1- 4 lớp, độ dầy và độ chiết quang tăng từ ngoài vào trong nên quan sát được bằng kính hiển vi thường. - Cortex: chiết quang kém nhưng dầy hơn áo, không ăn màu, được cấu tạo bằng peptidoglycan và acid dipicolinic và calci. - Vỏ: là màng mỏng ít chiết quang, cấu tạo giống vỏ tế bào vi khuẩn. Khi nội bào tử nẩy mầm, vỏ nội bào tử trở thành vỏ tế bào. - Màng và tế bào chất: cấu tạo giống màng tế bào vi khuẩn, tế bào chất đậm đặc hơn tế bào bình thường, lượng PHB ít và có chứa đầy đủ các enzyme, coenzyme nhưng ít hơn tế bào. * Nhiệm vụ: nội bào tử sống tiềm sinh cho đến khi gặp điều kiện thuận tiện thì nẩy mầm để cho tế bào dinh dưỡng mới. * Sự thành lập: thay đổi tùy theo loài. Khi môi trường thiếu thức ăn cần thiết thì cơ cấu bên trong tế bào có những biến đổi phức tạp và thành lập nội bào tử gồm nhiều lớp bao bên ngoài. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 8 CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI VI KHUẨN I. Lịch sử phát triển phân loại vi sinh vật Năm1750, Carl Linnaeus đề nghị hệ thống phân loại đầu tiên: ông gọi đó là sự hổn độn (Chaos). Năm1866, Ernst Haeckel phân chia động vật, thực vật và vi sinh vật làm 3 giới (kingdoms) Animalia Plantae Protista Năm 1969, Robert Whittaker căn cứ vào sự khác biệt về hình thái học của sinh vật để xếp sinh vật vào 5 nhóm chính: Animalia Plantae Fungi Protista Monera Năm 1970, Carl Woese, dựa vào kết quả phân tích RNA, để chia sinh vật làm 3 giới Archaebacteria Bacteria Eucarya Hiện nay hệ thống phân loại nầy được các nhà vi sinh vật quan tâm II. Phân loại cổ điển Nhiều đặc tính của vi khuẩn về hình dạng, gram, nhu cầu dinh dưỡng (quang dưỡng, dị dưỡng, hóa dưỡng…), cấu tạo hóa học của vỏ tế bào, thành phần hóa học của lipid, cấu tạo hóa học của vỏ nhầy, các loại sắc tố, khả năng sử dụng nguồn carbon, đạm,.., các sản phẩm lên men, nhu cầu về oxy, nhiệt độ tăng trưởng, pH, tính chống chịu với môi trường, các mối quan hệ như sự cộng sinh… Dòng vi khuẩn ở ruột của một động vật máu nóng cần phân loại Làm ròng Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 9 Nhuộm gram G- G+ Hình que Không có dạng hình que Tùy ý không bắt buộc Hiếu khí bắt buộc Lên men lactose và sản xuất ra acid và khí Không lên men lactose Các xét nghiệm sinh hóa Dương tính: indole, đỏ methyl, mucate Âm tính: citrate, Voges-Proskauer, H2S Escherichia coli Hình 1. Các bước tiến hành để phân loại vi khuẩn theo phương pháp cổđiển (Madigan và ctv, 2000) Trong phương pháp phân loại cổ điển, tỉ lệ GC của phân tử ADN của sinh vật được đặc biệt lưu ý. Tỉ lệ các base của ADN được biểu thị theo công thức sau: G+C --------------------A+T+G+C x 100% Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 10 Tỉ số trên có thể biến đổi từ 20-80% III. Phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR - Khuếch đại gene 16S rDNA or 16S rRNA bằng máy PCR Điện di sản phẩm DNA để nhận diện băng DNA khoảng 1.500bp Điện di sản phẩm DNA để nhận diện băng 1.500bp - DNA khoảng Giải trình tự đoạn DNA 1.500bp Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 11 - So sánh trình tự đoạn DNA với ngân hàng dữ liệu GENEBANK để xác định giống loài vi sinh vật. CATGCAGTCGAGCGGGGAGAGGTAGCTTGCTACTGATCTTAGCG GCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATT TCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCT TCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGT AAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT ATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG CCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACC TAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAA GCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGG GAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGAATTCC AGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAAGC AGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCYGTTGGGG CCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAGTAGACGCTGGGGAGTACG TCGCAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCCAAGC Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 12 Phân loại theo hệ thống Bergey Giới: Vi sinh vật sơ hạch Division: Vi khuẩn 1 Vi khuẩn quang dưỡng 2 Vi khuẩn trượt (Gliding) 3 Vi khuẩn có vỏ bao (Sheath) 4 Vi khuẩn nẩy chồi (budding) 5 Spirochetes 6 Vi khuẩn xoắn 7 Vi khuẩn gram âm hình que và hình cầu 8 Vi khuẩn gram âm hình que kỵ khí tùy ý 9 Vi khuẩn gram âm hình que kỵ khí 10 Vi khuẩn gram âm hình cầu 11 Vi khuẩn gram âm hình cầu kỵ khí 12 Vi khuẩn hóa dị dưỡng 13 Vi khuẩn sinh methane 14 Vi khuẩn hình cầu gram dương 15 Vi khuẩn hình cầu và hình que có khả năng tổng hợp nội bào tử 16 Vi khuẩn hình que không có nội bào tử 17 Xạ khuẩn 18 Rickettsia 19 Mycoplasmas PHÂN LOẠI VI KHUẨN Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 13 VI KHUẨN GRAM ÂM Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 14 Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 15 Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 16 CHƯƠNG BA ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP ********* Đạm là một trong số những nguyên tố quan trọng nhất ở địa cầu. Sự tăng trưởng của thực vật thường bị giới hạn bởi thiếu đạm hơn là do thiếu các nguyên tố khác. Sự cộng sinh giữa các vi sinh vật cố định đạm và các cây họ Đậu và không thuộc họ Đậu đóng một vai trò cực kỳ quan trọng trong hệ thống canh tác nông nghiệp. Ví dụ, nếu trồng một vụ đậu có chủng vi khuẩn tương ứng hữu hiệu mỗi ha đất có thể cố định được từ 100-175 kgN/ha (Richards, 1987). Ngoài ra, còn phải kể đến vai trò không kém phần quan trọng cuả các vi sinh vật cố định đạm sống tự do, ví dụ như các cyanobacteria (vi khuẩn lam) cố định khoảng 80 kgN/ha/năm (Mishustin và Shilnikova, 1966). A. VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM I. NHÓM VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Các vi sinh vật dị dưỡng * Nhóm vi sinh vật hiếu khí 1. Họ Azotobacteriaceae Họ Azotobacteriaceae gồm một nhóm vi sinh vật khá đồng nhất về mặt sinh lý. Các tế bào thuộc họ này thường có dạng hình que gồ ghề hay hình bầu dục, φ = 2 µm hoặc lớn hơn, chiều dài thay đổi. Hình dạng tế bào thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường nuôi . Các tế bào thường sống thành cặp hay chuỗi, có thể không di chuyển hay di chuyển nhờ các chiên mao. Phần lớn tế bào thuộc gram âm hoặc thay đổi. Không tạo nội bào tử. Nang (cysts) được thành lập ở một giống là Azotobacter. Tế bào vi khuẩn thuộc họ này là loại hiếu khí bắt buộc, có khả năng cố định đạm tự do. Chúng có thể sống trong đất, nước và ở vùng rễ cây. Họ Azotobacteriaceae gồm nhiều giống như Azotobacte, Azomonas. * Azotobacter Giống này có tính mẫn cảm với độ pH, nồng độ phosphat cao và với nhiệt độ trên 35oC. Các giống Azotobacter ở môi trường biển hay các giống chịu được mặn rất hiếm. Các tế bào Azotobacter già gồm các thể bào xác (encysted forms) có hình thái rõ rệt. Các thể bào xác có thể tạo ra bằng cách nuôi trong môi trường có thêm một hoá chất như n butanol. Các bào xác có đặc tính hơi chống chịu lại với các điều kiện khó khăn của môi Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 17 trường như nhiệt độ, sự khô khan (Sadoff, 1975). Hai loài Azotobacter vinelandii (Hình 1) và Azotobacter chroococcum có một hệ gen (genome) có kích thước rất lớn và biến đổi : cấu tạo ADN của chúng có thể đến 50 lần so với của E. coli trong môi trường nuôi cấy và giảm xuống 10 lần khi mẻ cấy đã già [Sadoff và cộng tác viên (ctv), 1979]. Azotobacter được tìm thấy ở vùng rễ của một số cây. Chúng có thể sản xuất ra chất kích thích tăng trưởng giống như hormone. * Azomonas Tế bào thuộc giống này có φ = 2,0 µm hoặc hơn, chiều dài thay đổi. Tế bào có dạng hình que, dạng trứng hay hình cầu. Chúng sống đơn độc, từng cặp hay chùm. Thông thường gram âm đôi khi gram có thể thay đổi. Tế bào không tạo nội bào tử hay nang (cysts), di động được nhờ có chiên mao. Giống Azomonas thuộc loại hiếu khí nhưng cũng có thể tăng trưởng dưới áp lực oxygen thấp. Cố định đạm ở trạng thái tự do. Chúng sống trong đất và nước. Các loài quan trọng của giống này gồm Azomonas agilis , Azomonas insignis và Azomonas macrocytogenes. 2. Họ Spirillaceae Trước đây các xoắn khuẩn tự dưỡng đạm (diazotrophic spirilla) được khảo cứu một cách rời rạc (Beijerinck, 1925; Becking, 1963), nhưng hiện nay người ta đã nghiên cứu khá nhiều. Năm 1976, Döbereiner và Day tái phân lập loài Spirillum lipoferum mà sau đó được phân loại lại vào một trong hai loài của giống Azospirillum (De Polli và ctv, 1980; Krieg và Döbereiner, 1984; Tarrand, và ctv, 1978). Các loài này mẫn cảm với oxy, hiếu khí, tạo một màng mỏng đặc trưng trong môi trường. Về mặt hình thái học các xoắn khuẩn nằm ở ranh giới của Vibrio và Spirilla. Giống tiêu biểu cho họ này là Azospirillum. Giống này bao gồm những tế bào vi khuẩn có dạng hình que thẳng hoặc hơi cong tròn trỉnh, có φ =1 µm và chiều dài 2,1 – 3,8 µm. Trong môi trường nuôi cấy kiềm, mẻ cấy già hoặc dưới điều kiện thừa oxy tế bào có thể lớn lên hay có nhiều dạng thay đổi. Tế bào thuộc loại gram âm hay gram thay đổi và trong môi trường lỏng chúng có thể chuyển động nhờ một chùm chiên mao ở một đầu. Nhiệt độ tăng trưởng tối hảo từ 35 - 37oC. Trên môi trường khoai tây agar, các khuẩn lạc của Azospirillum có màu hồng đậm hay lợt, thường nhăn nheo và không nhầy. Tế bào thuộc giống nầy có thể sống tự do trong đất hay sống liên kết với rễ các loại ngủ cốc, cỏ, không tạo được nốt rễ. Hai loài chính của giống này là Azospirillum brasilense và Azospirillum lipoferum. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 18 Ngoài giống Azospirillum họ này còn có các giống như Aquaspirillum và Campylobacter. 3. Họ Corynebacteriaceae Nhiều dòng vi sinh vật thuộc giống Arthrobacter được nghiên cứu (Smyk, 1970). Loài được khảo cứu kỷ nhất thuộc giống này là Arthrobacter fluorescens (Cacciari và ctv, 1979). Loài Arthrobacter fluorescens là loài vi sinh vật tự dưỡng đạm, mẫn cảm với oxy. 4. Họ Methanomonadaceae Các vi khuẩn họ này được Coty (1967) khám phá trong số các vi khuẩn oxid hóa methane. Chúng là những vi khuẩn tự dưỡng đạm (diazotrophs), mẫn cảm với oxy (Dalton, 1980). Họ Methanomonadaceae gồm nhiều giống vi khuẩn như Methylosinus ,Methylocystis, Methylococcus, Methylomonas và Methylobacter. 5. Họ Thiobacteriaceae Năm 1978, Mackintosh báo cáo sự cố định đạm hiếu khí của 3 dòng vi khuẩn của Thiobacillus ferro - oxidans bằng cách sử dụng phản ứng khử acetylene với 15N2. Theo Mackintosh, không phải tất cả các dòng vi khuẩn thuộc Thiobacillus ferro - oxidans đều có khả năng tự dưỡng đạm. Các dòng vi khuẩn Thiobacillus ferro - oxidans có dạng hình que, đơn hay từng cặp, φ = 0,5 x 1,0 µm, chuyển động nhờ 1 chiên mao ở một đầu, khuẩn lạc nhỏ 0,5-1 mm, thuộc loại hiếu khí bắt buộc, pH tối hảo để tăng trưởng là 2,5. Có thể tìm thấy loài này khắp nơi. * Nhóm vi sinh vật kỵ khí Họ Enterobacteriaceae Năm 1958, Wilson bày tỏ mối nghi ngờ về khả năng cố định đạm bởi loài Aerobacter aerogenes (hiện nay được xếp vào giống Klebsiella). Tuy nhiên, kể từ khi người ta xác định được loài Klebsiella pneumoniae M5a1 có khả năng tự dưỡng về đạm, chúng trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà sinh hóa và di truyền. Các giống Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Citrobacter và Escherichia là những dòng vi khuẩn tự dưỡng đường ruột. Các vi khuẩn thuộc họ này là những vi sinh vật kỵ khí bắt buộc hay các vi sinh vật vi khí sinh (micro-aerophile), gram âm, hình que thẳng, φ = 0,3-1,0 x 1,0-6,0 µm, không chuyển động hay chuyển động nhờ các chiên mao, không tạo nội bào tử hay nang (cysts). Giống như ở họ Bacillaceae, số lượng vi khuẩn tự dưỡng đạm có trong một giống hay một loài thì không phổ biến trong họ này (khoảng năm 1980, trong số 134 Klebsiellae trong thí Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 19 nghiệm chỉ có 38 (28%) là có khả năng tự dưỡng đạm). Không có mối liên hệ rõ rệt giữa môi trường sống và các vi sinh vật tự dưỡng đạm. Tuy nhiên, khi khảo sát các dòng vi khuẩn trên lâm sàng, Chamber và Silver (1977) chỉ tìm thấy có 22% là có khả năng tự dưỡng đạm. Các vi sinh vật tự dưỡng đạm dường như được phân bố một cách ngẫu nhiên trong các vi khuẩn đường ruột. Nhóm vi sinh vật tự dưỡng 1. Họ Bacillaceae Các giống có khả năng tự dưỡng đạm thuộc họ này làBacillus, Clostridium và Desulfotomaculum. Giống Bacillus gồm các dòng vi khuẩn tự dưỡng đạm của hai loài Bacillus polymysa và Bacillus macerans. Các dòng vi khuẩn thuộc giống Bacillus là những dòng vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc.Giống Clostridium gồm nhiều loài như Clostridium pasteurianum, Clostridiumbutyricum, Clostridium accharobutyricum, Clostridium acetobutyricum, Clostri-dium beijerinckii. Trong số các loài vừa kể ở trên, Clostridium pasteurianum (hay Clostridium pastorianum) là loài vi khuẩn tự dưỡng đạm được khám phá đầu tiên (Hình 6). Đây là loài vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Môi trường nuôi chúng có "mùi bơ" của acit butyric. Giống Desulfotomaculum bao gồm các dòng vi khuẩn hơi ái nhiệt. Các loài quan trọng của giống này là Desulfotomaculum ruminis và Desulfotomaculum orientis. Giống Desulfotomaculum là một giống mới được xếp vào danh sách các vi khuẩn tự dưỡng đạm (Postgate, 1979) thuộc họ Bacillaceae 2. Họ Chromatiaceae Các tế bào thuộc họ Chromatiaceae có dạng hình cầu, dạng trứng, dạng xoắn, dạng que hay phẩy. Chúng sinh sản bằng cách phân hai (binary fission). Các loài trong họ này có thể có hay không có không bào, chuyển động hay không chuyển động. Ở dạng chuyển động chúng có một chiên mao hoặc một chùm chiên mao ở một đầu. Ngoại trừ một loài Thiocapsa pfennigii có bacteriochlorophyll b, các loài khác có bacteriochlorophyll a và carotenoid nhóm 1, 3 hay 4. Các giống thuộc họ Chromatiaceae gồm Chromatium, Thiocapsa, và Thiocystis. a. Giống Chromatium Tế bào giống Chromatium có dạng hình que thẳng, hơi cong hay hình trứng, có đầu mút tròn. Chúng sinh sản bằng cách phân hai, chuyển động được nhờ một hay nhiều chiên mao ở một đầu. Tế bào sống đơn độc hay thành từng cặp hoặc dính với nhau tạo thành Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 20 từng cụm tế bào, gram âm, có chứa sắc tố quang hợp bacteriochlorophyll a và carotenoids nhóm 1 - 4. Tế bào không có chứa không bào. Ở điều kiện kỵ khí, tất cả loài có khả năng quang tự dưỡng, sử dụng sulfide hay nguyên tố lưu huỳnh làm chất cho điện tử. Các loài của giống Chromatium thuộc loại ưa nhiệt trung bình, nhiệt độ tăng trưởng tối hảo 20-40 oC. Tế bào có chứa chất dự trử như polysaccharides, PHB, polyphosphat. Trong 10 loài thuộc giống Chromatium chỉ có loài Chromatium weissei là có khả năng cố định đạm. Tế bào của loài này có dạng hình que, kích thước 3,4-4,5 x 7-14 µm, nhiệt độ tăng trưởng tối hảo từ 25-30oC, có thể tìm thấy ở ao, hồ. b. Giống Thiocystis Tế bào vi khuẩn thuộc giống này có dạng hình cầu hay dạng hình trứng và có dạng hai hình cầu gắn liền nhau trước khi tế bào phân cắt. Chúng sinh sản bằng cách phân hai. Tế bào có thể di động được nhờ một chiên mao. Các tế bào thuộc giống Thiocystis có thể sống đơn độc hay thành từng cặp, gram âm, có chứa sắc tố bacteriochlorophyll a và carotenoid nhóm 3 và 4. Tế bào không có không bào. Chúng là các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc như loài Thiocystis violacea và Thiocystis gelatinosa. c. Giống Thiocapsa Tế bào của giống Thiocapsa thường có hình cầu hay dạng hình trứng, φ = 1,2-3,0 µm. Tế bào sinh sản bằng cách phân hai. Chúng không chuyển động, có thể sống kết hợp thành từng cụm 4 tế bào, gram âm, không có không bào, và là những vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. d. Giống Amoebobacter Bao gồm những tế bào hình cầu, sinh sản bằng cách phân hai, không chuyển động được. Tế bào được một lớp nhầy bao quanh. Chúng có thể gắn với nhau tạo thành từng chùm có dạng bất định, gram âm, không có chứa không bào. Chúng thuộc loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. 3. Họ Ectothiorhodospiraceae Giống Ectothiorhodospira bao gồm những phẩy khuẩn, trực khuẩn hay xoắn khuẩn, φ = 0,5 – 1,5 µm. Tế bào chuyển động nhờ các chiên mao ở một đầu tế bào, tế bào sinh sản bằng cách phân đôi, gram âm, kỵ khí không bắt buộc. Các loài của giống này có nhiệt độ tăng trưởng rất biến động, có thể từ 25-40 oC. Sự tăng trưởng của chúng còn tùy thuộc vào độ mặn (thường rất biến động từ 1 - 27%) và môi trường kiềm (pH từ 7,5-9,5). 4. Họ Chlorobiaceae Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 21 Hình dạng tế bào thay đổi, có thể có dạng hình cầu, dạng trứng, que thẳng hay cong. Chúng sinh sản bằng cách phân hai hay ba (ternary fission). Tế bào có thể có hay không có không bào. Tế bào có chứa sắc tố chính là bacteriochlorophyll c hay d và một ít bacteriochlorophyll a và carotenoid nhóm 5. Các vi khuẩn họ này thuộc loại kỵ khí bắt buộc. a. Giống Chlorobium Gồm các tế bào hình cầu, hình trứng, que thẳng hay que cong, φ = 0,3-1,1 x 0,4-3 µm. Tế bào thường kết thành từng chuỗi, sinh sản bằng cách phân hai, gram âm, không di động. Sắc tố quang hợp của các tế bào thuộc giống này bao gồm bacteriochlorophyll c, d hay e và một lượng nhỏ bacteriochlorophyll a. Chúng thuộc loại kỵ khí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng từ 20-35oC. b. Giống Pelodictyon Các loài thuộc giống Pelodictyon có những đặc tính sinh lý và sinh hóa tương tự các loài của giống Chlorobium. Tuy nhiên, ở những vùng nước ngưng đọng có chứa nhiều sulfide, các loài của giống Pelodictyon chiếm ưu thế hơn các loài của giống Chlorobium. Giống này gồm những vi sinh vật quang tự dưỡng, kỵ khí bắt buộc, nhiệt độ tăng tưởng thích hợp từ 15-30oC. 5. Họ Rhodospirillaceae Tế bào họ này có thể có dạng hình cầu, dạng trứng, dạng que hoặc xoắn dài hay ngắn và có chiều rộng thay đổi. Tế bào có thể không chuyển động hay chuyển động được nhờ các chiên mao. Sinh sản bằng cách phân hai hay tăng trưởng về một đầu và nhẩy chồi. Tế bào thuộc loại gram âm và có chứa sắc tố bacteriochlorophyll a hay b và nhiều loại carotenoids. Chúng thuộc loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Tế bào có chứa chất dự trử dưới dạng các hạt polysaccharides, polyphosphat haypoly - β - hydroxybutyric acid (PHB). Các giống có khả năng cố định được đạm của họ này gồm : Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium. II. NHÓM VI KHUẨN SỐNG CỘNG SINH 1. Các vi sinh vật sống cộng sinh với các cây họ Đậu Hiện nay các vi sinh vật sống cộng sinh với các cây họ Đậu được chia làm 4 giống : Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium (Chen và ctv, 1988; Dreyfus và ctv, 1988 và Jordan, 1984). 1.1. Giống Rhizobium Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 22 Giống Rhizobium gồm các tế bào vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5-0,9 x 1,2-3,0 µm, không tạo bào tử, gram âm, có thể di động được nhờ có chiên mao. Các vi khuẩn giống này thuộc loại hiếu khí. Các khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, trong mờ, có tạo chất nhầy. Kích thước khuẩn lạc 2-4 mm sau khi nuôi cấy trên môi trường YEM agar 3 - 5 ngày. Vi khuẩn tạo acid khi môi trường nuôi có nguồn carbohydrat là mannitol và một số nguồn đường khác. Giống Rhizobium có 3 loài là Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, và Rhizobium loti. Loài Rhizobium leguminosarum có 3 biovars là trifolii, phaseoli và viceae. 1.2. Giống Bradyrhizobium Giống Bradyrhizobium gồm các tế bào vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5-0,9 x 1,2-3,0 µm, thường chứa chất dự trử PHB, không tạo bào tử, gram âm, hiếu khí, chuyển động được nhờ tế bào có mang chiên mao. Khuẩn lạc tròn, đục, trắng, lồi, có kích thước nhỏ hơn 1 mm khi ủ trong môi trường YEM từ 5-7 ngày, và tạo kiềm. Tế bào tổng hợp chất nhầy chung quanh tế bào. Tất cả các dòng vi khuẩn thuộc giống Bradyrhizobium đều có tính chuyên biệt cao đối với cây chủ mà chúng cộng sinh. Một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khi sống tự do. Giống Bradyrhizobium có một loài là Bradyrhizobium japonicum, là các vi khuẩn sống cộng sinh với đậu nành. Các loài vi khuẩn Bradyrhizobium cộng sinh với các cây họ Đậu khác được đặt tên là Bradyrhizobium sp. kèm với tên của cây chủ mà nó cộng sinh. Ví dụ, loài vi khuẩn cộng sinh với cây Vigna hay Lupinus thì có tên là Bradyrhizobium sp. (Vigna) và Bradyrhizobium sp. (Lupinus). 1.3. Giống Azorhizobium Giống Azorhizobium là một giống mới được đề nghị với một loài là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata (Dreyfus và ctv, 1988) (Hình 10). Đây là loài vi khuẩn có khả năng sử dụng N 2 khi sống ở trạng thái tự do. Tế bào vi khuẩn gram âm, hình que nhỏ, có kích thước trung bình 0,5-0,6 x 1,52,5 µm, chuyển động được nhờ chiên mao. Trên môi trường agar các khuẩn lạc có hình tròn, thuộc loại hiếu khí bắt buộc. 1.4. Giống Shinorhizobium Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân lập từ Trung Quốc (tên gọi trước đây là Rhizobium fredii). Các vi khuẩn giống này có dạng hình que, kích thước 0,5-0,9 x 1,2-3,0 µm. Tế bào cộng sinh (Dreyfus và ctv, 1988) thường chứa các hạt dự trử PHB, không tạo bào tử, gram âm, chuyển động được nhờ tế bào có mang chiên mao. Vi khuẩn hiếu khí, khuẩn lạc tròn, lồi, hơi trong, nhầy, có kích Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 23 thước từ 2 - 4 mm khi nuôi trên môi trường YEM sau 3-5 ngày. Nhiệt độ tăng trưởng thích hợp từ 25 - 30oC. Tuy nhiên, cũng có các dòng tăng trưởng ở 35 oC và vài dòng tăng trưởng ở 10oC. Độ pH thích hợp 6-8, nhưng cũng có dòng phát triển ở pH = 5,0 hay pH = 10,5. Giống Shinorhizobium gồm có 2 loài là Shinorhizobium fredii và Shinorhizobium xinjiangensis. 2. Các vi sinh vật sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu 2.1. Frankia Trước đây khi nói đến sự cộng sinh giữa vi sinh vật và thực vật người ta nghĩ ngay đến các cây thuộc họ Đậu (Leguminosae). Tuy nhiên, trong thời gian gần đây (trong những năm 60 đến 70) nhờ sự nổ lực to lớn của Giáo sư G. Bond, tầm quan trọng của các loại vi sinh vật cộng sinh với các cây không thuộc họ Đậu mới được nhiều người quan tâm (Becking, 1970 ; Bond, 1967). Một ví dụ đầu tiên của nhóm này là cây Alder (Alnus) thuộc họ Fagales tạo được nốt rễ. Các nốt rễ này không chứa rhizobia nhưng chúng có khả năng tự dưỡng đạm (diazotrophic). Những loại cây khác thường là các cây bụi hay thân mộc cũng có thể thành lập cơ cấu tương đương như nốt rễ. Ví dụ như Shepherdia và Ceanothus (bộ Rhamnales), Myrica và Comptonia (bộ Myricales), Casuarina (bộ Casuarinales), Coriaria (bộ Coriariales), Dryas (bộ Rosales) và nhiều loại cây khác. Ngày nay, người ta đã biết được hơn 120 loài tự dưỡng đạm tạo nốt với các cây không thuộc họ Đậu. Khi các nốt rễ hữu hiệu nó có màu hồng. Màu của sắc tố này là do anthocyanins chớ không phải là leghaemoglobin như ở các nốt rễ ở các cây thuộc họ Đậu. Becking (1970) đề nghị một họ vi khuẩn mới là Frankiaceae gồm tất cả các xạ khuẩn tạo nốt trên rễ của các cây không thuộc họ Đậu có hai lá mầm. Ông cũng phát hiện ra một số loài và xếp vào một giống là Frankia. Cách xâm nhiểm của Frankia vào cây được mô tả gần đây hầu như giống với trường hợp các vi khuẩn cộng sinh với các cây họ Đậu (Newcomb và ctv, 1979). Tjepkema và ctv (1980) cho biết các loài Frankia phân lập từ Comptonia peregrina có khả năng cố định đạm khi không có cây chủ. Cố định đạm trong môi trường không có cây chủ liên quan đến sự xuất hiện của các cấu trúc giống như túi được tìm thấy ở nốt của Comptonia; Frankia của Casuarina dường như cũng tương đối chịu đựng được oxy khi cố định đạm ngoài cây chủ (Gauthier và ctv, 1981). Frankia là các xạ khuẩn có bào tử nang chia thành nhiều ngăn. Các khuẩn ty phân nhánh có kích thước 0,5-2,0 µm và thỉnh thoảng lớn hơn. Không có khuẩn ty thể trên Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 24 không, bào tử nang nhiều ngăn có dạng tròn hoặc bất thường phát sinh ở cuối, ở bên hoặc xen vào các sợi nấm. Các bào tử nang thường phát sinh trên các cuống túi bào tử, một số bào tử nang có thể không có cuống. Các bào tử nang có chiều dài đến 100 µm. Các bào tử túi không cử động, có dạng thay đổi, kích thước 1-5 µm, không màu hay có màu đen. Các bào tử không có tính kháng nhiệt. Thông thường các bào tử túi (sporangiospores) không phát triển và trưởng thành cùng một lúc. Vì vậy, các bào tử nang (sporangia) đang phát triển có thể không chứa các bào tử cùng kích thước và cùng tuổi. Các túi (vesicles) có thể được thành lập ở bên hoặc cuối sợi nấm. Các túi này có vách dầy và phồng lên và có lẻ là vị trí hoạt động của phân hóa tố nitrogenaz ở những dòng cố định đạm khí quyển. Các túi này cũng có thể được thành lập ở trường hợp không có sự cố định đạm xảy ra. Các đặc tính về hình thái học nầy có thể biểu hiện cả trong cây cũng như trong ống nghiệm mặc dù các nốt cố định đạm không có túi cũng được phát hiện. Các loài Frankia thường có gram dương hay gram biến đổi, hiếu khí hay vi hiếu khí, không tăng trưởng được ở điều kiện kỵ khí. Hầu hết các dòng thuộc Frankia có khả năng cố định đạm trong điều kiện ống nghiệm cũng như trong cây. Phần lớn các dòng đều sống cộng sinh với các thực vật hạt kín nhất định và tạo nốt trên rễ các cây chủ thích hợp. Chúng cũng có thể sống tự do trong đất. Công tác nghiên cứu sự cộng sinh của các vi khuẩn thuộc giống Frankia gặp nhiều trở ngại bởi vì chúng rất khó phân lập và tăng trưởng rất chậm trong môi trường ròng (Baker, 1989; Baker và Mullin, 1992). Theo Quispel và Burggraaf (1981) các dòng phân lập từ Alnus spp. (Betulaceae) tạo nốt với các loài của Comptonia và Myrica (Myricaceae) nhưng sẽ không tạo nốt với loài của Eleagnus, Hippophae hay Shepherdia (Coriaceae). Hình dáng bên ngoài của các nốt ở những cây không thuộc họ Đậu rất dễ phân biệt với các nốt ở những cây thuộc họ Đậu bởi vì chúng thường xuất hiện như những bướu bên ở các rễ cây và sau đó trở thành dạng thùy tạo ra những cụm nốt lớn đến 5 cm đường kính (Hình 12). Theo Becking (1977), có hai loại hình phân biệt một loại rễ có tính hướng trọng lực âm phát sinh từ các đỉnh thùy nốt tìm thấy ở Casuarina và Myrica và một loại phát triển chậm, có các đỉnh lưỡng phân tiêu biểu ở Alnus. Tuy nhiên, theo Gibson và Jordan (1983), cả hai loại hình nầy đều tìm thấy ở Alnus và Myrica.Theo Dommergues và ctv (1984), khi sử dụng dòng Frankia ORS 021001 Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 25 (phân lập từ Casuarina junghuhniana) để chủng cho những loài cây khác nhau của Casuarina và Allocasuarina, họ nhận thấy chỉ có những loài thuộc nhóm Allocasuarina có thể tạo nốt trong khi đó không có loài nào thuộc nhóm Casuarina tạo được nốt. Nhưng ở những thí nghiệm khác khi dùng nốt của Casuarina equisetifolia nghiền ra và chủng cho các loài trên thì có khoảng 20% loài Allocasuarina torulosa và 30% loài Allocasuarina verticillata tạo được 2 - 3 nốt trên cây. Như vậy, rõ ràng là nốt rễ nghiền có chứa nhiều hơn một dòng Frankia. Để nhận diện các dòng Frankia, nhiều kỹ thuật hiện đại đã được người ta áp dụng như PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sellstedt và ctv, 1992), RFLP-PCR (Restrition fragment length polymorphism) (McEwan và ctv, 1994). Sử dụng nhiều phương pháp tính toán khác nhau, Dommergues và các ctv (1984) cho biết trong thời gian 6,5 tháng, Frankia cố định được khoảng 131 kg N/ha. 2.2. Vi khuẩn lam (cyanobacteria) Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay thanh tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến các thực vật hạt kín (Gibson và Jordan, 1983). Nhiều sự cộng sinh góp phần tiết kiệm một lượng đạm đáng kể trong hệ thống sinh học hay đóng vai trò quan trọng trong hệ thống nông nghiệp như trường hợp Azolla - Anabaena. a. Địa y (Lichens) Địa y là sự cộng sinh quen thuộc giữa một nấm (thường là một discomycete) và một loại tảo có thể là lục tảo hay thanh tảo. Chúng được tìm thấy trên các tảng đá, tường, mái nhà, thân cây. Khoảng 8% địa y có chứa các vi khuẩn lam và có lẻ hầu hết chúng đều có khả năng cố định đạm. Ở những khu rừng thông ẩm, mát, chúng cung cấp cho địa y một lượng đạm lên đến 10 kgN/ha/năm (Pike và ctv, 1972). Địa y rất dồi dào trên vỏ cây của nhiều khu rừng có mưa miền nhiệt đới và bán nhiệt đới. Chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc tiết kiệm đạm của hệ thống sinh học ở các khu rừng này. Còn ở vùng đất cực bắc khô hơn, địa y cùng với các vi khuẩn lam là nguồn cung cấp đạm chính cho sự sống của quần thể (Gibson và Jordan, 1983). Tầm quan trọng của địa y ở vùng lảnh nguyên (tundra) rất biến đổi tùy theo mùa và điều kiện môi trường, nhưng trung bình chúng cố định khoảng 1 - 5 kgN/ha/năm (Denison, 1973). b. Azolla - Anabaena Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 26 Mối liên kết chính yếu của các vi sinh vật tự dưỡng đạm được biết đến trong số các thực vật ẩn hoa có mạch là giữa Azolla, một thực vật thủy sinh nhỏ bé, và một vi khuẩn lam (cyanobacterium) là Anabaena azollae. Azolla có các lá hai thùy nhỏ, mọc xen, phủ lên nhau. Thùy bên trên chứa sắc tố quang hợp chlorophyll trong khi một phần của thùy dưới chìm trong nước thì gần như không màu. Azolla có ba loại tế bào : tế bào dinh dưỡng (vegetative cells), nơi quang hợp chủ yếu; các dị bào (heterocysts), nơi cố định đạm; và các tế bào bên (akinetes), là những hậu bào tử có vỏ dầy, thành lập từ các tế bào dinh dưỡng (Dworkin, 1979 ; Lumpkin và Plucknett, 1980) (Hình 13). Azolla phân bố một cách rộng rãi ở vùng nhiệt đới và ôn đới, nhưng phổ biến nhất là ở vùng nhiệt đới ấm áp và bán nhiệt đới. Azolla được sử dụng làm cây phân xanh trong việc canh tác lúa nước (Chu, 1978; Moore, 1969; Singh, 1978; Watanabe, 1977). Các vi khuẩn lam nằm trong một hốc chứa đầy chất nhầy ở bề mặt bụng của thùy trên của Azolla (Peter và ctv, 1980). Giống Anabaena thuộc họ Nostocaceae. Tế bào giống này có dạng hình trụ, hình cầu hay hình trứng, kích thước từ 2 10µm, nhưng ở một số loài khác có thể lớn hơn 20µm (Desikachary, 1959). Các tế bào đầu mút có thể tròn hay hình nón. Anabaena azollae không giống như các loài sống tự do của giống, nó có khả năng cố định đạm dù môi trường có hiện diện một lượng lớn đạm khoáng. Tùy theo mùa và điều kiện môi trường, trung bình chúng cố định khoảng 30 - 60 kgN/ha/vụ lúa (Kumarasinghe và Zapata, 1986). c. Nostoc Giống này cũng thuộc họ Nostocaceae. Nostoc nhiểm vào rễ dạng san hô của các loại cây tuế (cycads) tại mặt đất hay dưới mặt đất. Sau đó phát triển thành nhiều dị bào (Stewart và Rowell, 1977; Rodgers và Stewart, 1977). Tế bào Nostoc có hình trụ, hình cầu hay hình trứng. Nó có thể tăng trưởng ngoài cây chủ, nhưng khi ở trạng thái cộng sinh, Nostoc hoàn toàn phụ thuộc vào sự quang hợp của cây chủ (Stewart và Rogers, 1977). 2.3.Vi khuẩn Azospirillum Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 27 Döbereiner và Ruschel (1958) phân lập được loài vi khuẩn Beijerinckia fluminensis cố định đạm sống ở vùng rễ cây mía trồng ở vùng nhiệt đới đã cho thấy một tiềm năng cố định đạm ở cây họ hoà bản. Döbereiner và Day (1975) phát hiện ra giống Azospirillum thì các nhà khoa học mới thực sự quan tâm đến các vi khuẩn cố định đạm ở cây họ hoà bản. Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn sống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ Các vi khuẩn nầy gíup cây tăng trưởng tốt hơn và làm gia tăng năng suất, hoà tan lân dạng khoáng khó tan và các chất ding dưỡng khác; sản xuất kích thích tố thực vật hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng. Các loài vi khuẩn trên đã được nghiên cứu khá tường tận và mỗi loài giúp tăng năng suất cây trồng khác nhau. Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32-81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa được 10-30%. Tùy theo loại vi khuẩn mà người ta có thể phân lập từ các nguồn khác nhau. Vi khuẩn Azospirillum brasilense Azospirillum lipoferum Azospirillum amazonense Azospirillum irakense Loại cây Bộ phận của cây Ngũ cốc Rễ, thân, hạt Cỏ Rễ, thân Mía Rễ, thân, lá Cây cọ dầu Rễ, thân, trái Ngũ cốc Rễ, thân, hạt, nhựa nguyên Cỏ Rễ, lá Mía Rễ, thân, lá Cây có củ Củ, rễ Cây cọ dầu Rễ, thân, trái Ngũ cốc Rễ, thân, hạt Mía Rễ, thân Cây cọ dầu Rễ, thân, trái Lúa Rễ Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ, vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, cỏ và cây có củ. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 28 Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những vi khuẩn này là 35-37C. Khuẩn lạc của chúng trên môi trường agar- khoai tây có màu hồng nhạt hoặc đậm.Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên môi trường có muối hữu cơ như malate, succinate, lactate hay pyruvate. Vi khuẩn này không sử dụng đường đơn, fructose hay các đường đôi khác là nguồn carbon của chúng. Một số dòng Azospirillum còn cần thêm biotin. Để phát hiện vi khuẩn Azospirillum có nhiễm vào rễ hay chưa, trước đây, người ta thường sử dụng phương pháp đo lượng khí acetylen do rễ thải ra nhưng phương pháp này rất tốn kém và mất nhiều công sức. Ngày nay, người ta thường sử dụng phương pháp miễn dịch học hoặc phương pháp sinh học phân tử hoặc kết hợp cả hai để phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum. Đối với Azospirillum lipoferum, người ta dùng cặp mồi chuyên biệt được thiết kế dựa trên trình tự của gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên trang web ngân hàng gen để nhận diện chúng. Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như: IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins. Những kích thích tố đó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ. Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, nhờ đó, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây. Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều kiện khô hạn. Ứng dụng Azospirillum có thể giảm được khoảng 30% lượng đạm hóa học cho nông nghiệp. 2.4.Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus Năm 1988, một giống vi khuẩn cố định đạm quan trọng mới được Cavalcante V.A và Dobereiner J phân lập lần đầu tiên từ rễ và thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil G. diazotrophicus là vi khuẩn G-; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế bào dạng que thẳng tròn đầu (0,7-0,9 µm đến khoảng 1-2 µm) tồn tại ở dạng đơn, đôi hoặc chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng đường (glucose, fructose, sucrose…) ở nồng độ khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở nồng độ sucrose 10% và pH=5,5. Người ta có thể phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus từ nhiều nguồn khác nhau. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 29 TT Nguồn Vị trí 1 Mía Rễ, lông rễ, thân lá 2 Cỏ Cameroon Rễ, thân 3 Khoai lang Rễ, lóng thân 4 Cà phê Rễ, vùng rễ, thân 5 Kê Rễ, vùng rễ, thân 6 Trà Rễ 7 Khóm Trái 8 Xoài Trái 9 Chuối Vùng rễ G. diazotrophicus nội cộng sinh trong mạch gỗ, khí khổng, khoảng gian bào của lá và thân, nhu mô gỗ, gỗ sơ cấp và gỗ thứ cấp (tìm thấy nhiều nhất) của thân, lá và rễ mía với số lượng 106 – 107 tế bào/g khối lượng tươi mô cây.Đối với rễ, G. diazotrophicus bắt đầu xâm nhập vào cây từ những điểm lộ rõ trên rễ, nơi những tế bào vi khuẩn được tìm thấy trong lớp tế bào rễ bên và vỏ rễ chính. G. diazotrophicus). Cũng có thể xâm nhập vào cây thông qua những vết nứt được hình thành từ sự thành lập rễ bên, những tế bào đầu rễ lỏng lẻo và những vị trí bị tổn thương trong suốt thời gian tạo mầm mía. Bằng con đường đó, vi khuẩn có thể tiến vào lục lạp của rễ. Hình thức xâm nhiễm này giống với sự xâm nhiễm của các vi sinh vật cố định đạm khác. Đối với lá, G. diazotrophicus xâm nhập vào lá qua khí khẩu, rồi từ đó định cư ở những khoang khí khẩu phụ và khoảng gian bào. Tế bào chủ sẽ phản ứng lại bằng cách tạo ra những cấu trúc sợi bao quanh vi khuẩn ở cả thân và lá, đặc biệt là ở mô gỗ thứ cấp. Đối với thân, vi khuẩn xâm nhập vào mô mạch thông qua các tế bào ngoại biên bị hư. Vì vi khuẩn này không thể tồn tại bên ngoài môi trường của mô cây nên nó sẽ truyền qua các thế hệ kế tiếp thông qua các mắt mía. Chúng cũng có thể xâm nhiễm vào cây thông qua những sản phẩm từ rễ, bã mía và rệp sáp. Nhờ vào khả năng nội cộng sinh cố định đạm mà không gây hại cho cây, lại sản xuất ra hormone thực vật (auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G. diazotrophicus được xem là một loài vi khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 30 một nửa N cố định được ở dạng hữu ích cho cây. Thực nghiệm ngoài đồng cho thấy lượng N mà G. diazotrophicus tạo ra bằng với đối chứng có bón 275 Kg N/ha. 2.5. Vi khuẩn Herbaspirillum Herbaspirillum là một nhóm beta-Proteobacteria bao gồm 3 loài H. seropedicae , H. rubrisubalbicans và H. frisingense . Những vi khuẩn này là những thể nội cộng sinh có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những cây thân cỏ như: lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm. Cây cộng sinh với Herbaspirillum sp. có thể tăng trưởng tốt và cho năng suất cao. Những hiệu quả này đạt được do một phần đạm tổng hợp từ vi khuẩn. Ngoài ra chúng còn tạo ra những sản phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho sự tăng trưởng của cây. Loài vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae có thể tổng hợp 31-54% đạm tổng số cho cây trồng ở điều kiện phòng thí nghiệm. Việc nhiễm Herbasprillum seropedicae trên những cánh đồng mang lại những hiệu quả như: làm cho chồi, thân và rễ dài thêm, tăng năng suất, tăng trọng lượng hạt. Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, gram âm, rộng khoảng 0,5-0,6µm. Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp N trong một khoảng pH biến thiên từ 5,3-8. Trong môi trường bán đặc vi khuẩn Herbaspirillum tạo thành một lớp màng mỏng , trắng, mịn (pellicle). Khi cấy chuyển lên môi trường đặc JNFb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắng sữa. B. VI KHUẨN HÒA TAN LÂN Trong đất P vô cơ khó tan có thể được vi sinh vật chuyển hóa thành dạng dễ tan. Vi khuẩn có khả năng này, gồm có: Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Thiobacterium, vv… Các vi khuẩn này nuôi trong môi trường dinh dưỡng có chứa apatit (Ca3(PO4)2), hoặc trong môi trường có đá P nghiền mịn, có thể phân hủy để hấp thu P cần cho nhu cầu phát triển của mình, mà còn thừa lượng P dễ tiêu để cung cấp cho môi trường xung quanh. Hiện tượng này có thể thấy được trong đĩa petri, xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ có quầng trong (halo), là nơi mà P khó tan chuyển hóa sang dạng tan được và được vi sinh vật hấp thu một phần. Vi khuẩn giải phóng các enzyme và những acid hữu cơ có khả năng hòa tan những hợp chất lân khó (Yahya và Al-Azawi, 1989). Vi khuẩn hòa tan lân khó tan bằng cách sản xuất ra những acid hữu cơ từ đường như acid organic, acid oxalic, Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 31 acid citric, acid butyric, acid malonic, acid adipic và acid 2-ketogluconic. (Leyval và Berthelin, 1989; Kim và ctv, 1998). Và cụ thể đối với vi sinh vật hóa tự dưỡng có khả năng oxi hóa NH 4 hoặc oxy hóa S, thì các dạng hữu cơ này là acid nitric và acid sulfuric. Các acid này tác dụng lên apatit để cho ra dibasic phosphat và monobasic phosphat là dạng vô cơ dễ tiêu. Như vậy, ngay khi vi sinh vật tiết ra các acid hữu cơ, các acid này tác dụng lên P khó tan và cho ra ngay P dễ tiêu. Mặt khác, các dạng P bị cố định trong đất như phosphat sắt và phosphat nhôm, cũng được chuyễn hóa sang dạng dễ tiêu dưới tác dụng của vi sinh vật trong đất. Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra H 2S tác dụng lên phosphat sắt hoặc phosphat nhôm để cho ra sulfid sắt hoặc nhôm và phóng thích phosphat dưới dạng dễ tiêu. Hiện tượng này xảy ra trong điều kiện thiếu oxy (đất mới ngập nước). Sự chuyển hóa các dạng P khó tan như ferrophosphat, bột xương, apatit và phosphat bicalcit trong điều kiện đất có chứa vi sinh vật. Illmer và Schinner (1992) cho thấy sự hòa tan Ca-Ps bởi Pseudomonas sp. và P. aurantiogriseum bằng cách tiết proton H+. Các proton này được sinh ra từ quá trình đồng hóa-hoán vị NH4+ (Beever và Burns, 1980) hoặc từ sản phẩm hô hấp H2CO3 (Jurinak và ctv, 1986). AlPO4 + 2H+ → Al3+ + H2PO4Ngoài ra, một số vi sinh vật còn tiết ra các phosphatase, chất enzyme, mà chúng xúc tác sự thủy phân 2 chất ester và anhydrides của H 3PO4. Các enzyme được chia làm 5 nhóm: phosphoric monoester hydrolases (EC3.1.3); phosphoric diester hydrelases (EC 3.1.4); triphosphoric monoester (EC 3.1.5); enzymes họat động lên phosphoric_chứa anhydrudes (EC 3.6.1), và enzyme họat động trên những liên kết P_N (EC 3.9), như là phosphoamidase (EC3.9.1.1) (Tabatabai, 1982). C.ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT Để phòng chống lại tác nhân gây hại này con người đã áp dụng thuốc trừ sâu hóa học để bảo vệ cây trồng. Cho đến nay không thể phủ nhận hiệu quả của thuốc trừ sâu hóa học trong việc kiểm soát côn trùng, sâu bệnh gây hại cho cây trồng, tuy nhiên do việc sử dụng quá mức thuốc trừ sâu hóa học đã dẫn đến những mối nguy khác như sự kháng thuốc của côn trùng gây hại, đáng ngại hơn một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy và tồn lưu rất lâu Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 32 trong đất gây tác động đến sức khỏe con người cũng như gây ô nhiễm môi trường sống. Đặc biệt nghiêm trọng hơn là việc sử dụng tùy tiện về liều lượng và thời gian phun thuốc hóa học chống sâu bệnh đã tạo nên dư lượng thuốc trừ sâu trên rau màu, lương thực gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm cho con người (Georghiou, 1990) Chính từ những mặt hạn chế của thuốc trừ sâu hóa học đã dẫn đến sự ra đời của thuốc trừ sâu sinh học. Theo Nguyễn Lân Dũng (1985) một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại như: Cloastridium bgrevifaciens, Cloastridium malacosomae, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus thuringiensis var. entomodius,…. Trong số nhiều loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho côn trùng thì vi khuẩn Bacillus thuringiensis (thường gọi tắt là B.t) là loài chủ yếu thường được dùng làm chế phẩm diệt sâu hại. Việc sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã mang lại nhiều thuận lợi hơn sử dụng thuốc trừ sâu hóa học ở một số mặt: Bacillus thuringiensis có khả năng sản sinh ra một lượng lớn protein độc tố với tính chuyên biệt với ấu trùng ký chủ rất cao. Do đó chúng an toàn và không gây hại cho các loại côn trùng có ích, động vật có xương sống và không gây ô nhiễm môi trường (Valadares, 2001; de Maagd, 2001; Siegel, 2001). Có hơn 200 loài côn trùng có thể bị vi khuẩn B.t gây chết, trong số này đa số là các loài gây hại cho cây trồng và cây rừng như: sâu xanh hại bông (Heliothis armigera), sâu xám hại rau (Agrotis upsilon), ngài đêm hại su hào, bắp cải (Barathra brassicae), sâu đục thân bắp (Pyrausta nubilalis), sâu xanh hại ớt (Heliothis assulta) (Nguyễn Lân Dũng, 1985). Bacillus thuringiensis đã được ứng dụng trong công nghiệp thuốc trừ sâu lần đầu tiên ở Pháp vào năm 1938 và trong những năm 1950 tại Mỹ. Nhiều năm sau đó thuốc trừ sâu sinh học B.t đã từng bước được đưa vào sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Và cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập và xác định hiệu quả diệt sâu của nhiều loài Bacillus thuringiensis khác nhau để góp phần sản xuất thuốc trừ sâu sinh học ở phạm vi rộng hơn, trên nhiều đối tượng sâu hại hơn. Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis được phân lập trong tự nhiên có khả năng tạo ra rất nhiều loại tinh thể protein gây độc khác nhau. Một trong số chúng có khả năng tiêu diệt nhiều loài côn trùng mục tiêu chuyên biệt (Lambert và Peferoen, 1992). Có 34 loài phụ của chủng Bacillus thuringienis đã được nhận diện, một trong số chúng thường được sử dụng như phụ loài kurstaki (kháng Lepidoptera), loài phụ israelensis (kháng Diptera, đặc biệt là muỗi), phụ loài tenebrionis (kháng Leptinotarsa decemlineata). Hơn Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 33 thế nữa sự kết hợp sử dụng nhiều loại cry protein đã cho thấy mang lại hiệu quả tích cực (Lee et al, 1996). Hằng năm người ta sản xuất cung cấp cho thị trường khoảng 13.000 tấn thuốc Bt bằng kỹ thuật lên men hiếu khí. Các thuốc Bt chủ yếu để tiêu diệt các loại côn trùng thuộc bộ Lepidoptera gây hại cho cây trồng và cây rừng. Tuy nhiên, trong những năm gần đây các thuốc Bt sản xuất ra còn có thể tiêu diệt côn trùng thuộc bộ Coleoptera. Ngoài ra, các thuốc Bt còn sử dụng để tiêu diệt các côn trùng thuộc bộ Diptera và các bệnh do vi rút gây ra trong chương trình bảo vệ sức khõe cộng đồng. Các dạng của thuốc Bt được dùng để tiêu diệt côn trùng bằng cách xịt lên tán lá cây, trong đất, mội trường nước, hay trong các kho chứa thực phẩm. Sau khi một loài Bt được áp dụng, các tế bào dinh dưỡng và các bào tử có thể giảm dần mật số theo tuần, tháng hay năm tùy thuộc vào thành phần của hệ vi sinh thực vật có trong tự nhiên. Bt có nhiều loài phụ cũng được sử dụng làm thuốc diệt trừ côn trùng như: Bacillus thuringiensis loài phụ kurtaki (Btk) được sử dụng để tiêu diệt các côn trùng họ Lepidoptera gây hại trên trái cây, rau cải, bông vải, đậu nành, đậu phộng và các cây hương liệu.* Bacillus thuringiensis loài phụ israelensis (Bti) được sử dụng để tiêu diệt muỗi, ruồi đen và vài loại côn trùng khác. Ở Trung quốc khoảng 10 tấn thuốc trừ sâu Bti được sử dụng để tiêu diệt muỗi Anopheles sinensis. *Bacillus thuringiensis loài phụ tenebrionis (Btt) tiêu diệt một số loài bọ cánh cứng *Bacillus thuringiensis loài phụ japonensis (Btj) có thể diệt một số loại bọ hung. * Bacillus thuringiensis loài phụ aizawai (Bta) giết ấu trùng các loài bướm đêm Thuốc trừ sâu sinh học Bt không ảnh hưởng đến con người, chim, trùn đất, nhện, động vật hoang dã, cá và động vật Tuy nhiên, nhiều thí nghiệm hơn nữa cần được tiến hành để nghiên cứu số phận của các nội bào tử và các độc tố của Bt khi phóng thích ra ngoài môi trường để có thể tạo niềm tin cho người sử dụng cũng như cộng đồng. Ưu điểm của thuốc trừ sâu sinh học Bt * Không độc cho người, chim, động vật nuôi và hoang dã * Không cần thời gian chờ đợi khi đi vào khu vực vừa mới áp dụng thuốc - Do thuốc có tính chuyên biệt nên chỉ diệt loại côn trùng nhất định mà không ảnh hưởng các côn trùng có lợi. * Không làm tổn thương cây và không gây ô nhiểm môi trường như thuốc trừ sâu có nguồn gốc hoá học Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 34 Nhược điểm của thuốc trừ sâu sinh học Bt Mặc dù thuốc trừ sâu sinh học Bt có nhiều ưu điểm nhưng chúng cũng có một số nhược điểm như sau - Chi phí sản xuất thuốc trừ sâu Bt còn khá đắt - Cần máy móc thiết bị nông nghiệp để sử dụng - Cần phải sử dụng thuốc nhiều lần mỗi vụ mùa - Nước mưa hay sương làm trôi các protein độc tính vì vậy thời gian ảnh hưởng của thuốc trên lá cây bị giảm đi. - Thời gian tồn trử ngắn hơn các thuốc trừ sâu có nguồn gốc hóa học và cần phải trử lạnh, nơi khô ráo và tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời. - Do tính chuyên biệt cao nên thuốc trừ sâu sinh học Bt chỉ diệt được côn trùng nhất định chớ không diệt được các côn trùng khác. - Chỉ hữu hiệu trên ấu trùng còn non của các bộ Diptera Lepidoptera, và Coleoptera Tính kháng của côn trùng đối với thuốc trừ sâu Bt Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm trong suốt 15 năm gần đây cho thấy nhiều côn trùng thuộc các loài khác nhau có khả năng kháng với Bt ở những mức độ khác nhau. Các loài Plodia interpunctella, Cadra cautella, Leptinotarsa decemlineata, Chrysomela scripta, Tricholplusia ni, Spodoptera littoralis, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis và Culex quinquefasciatus có khả năng kháng với Btk, Bti, Ttte và các loài phụ Bt khác. Trong những năm gần đây mật số của loài Diamondback moth (Plutella xylostella) kháng với Btk và Bta đã được phát hiện ở nhiều vùng địa lý khác nhau khi được xử lý với Bt rất mạnh như ở Hawaii, Philippines, Indonesia, Malaysia, Trung Mỹ và một số bang tại Mỹ. Điều này cho thấy rõ ràng là việc xuất hiện rộng rãi của các côn trùng kháng thuốc đã cảnh tỉnh chúng ta phải lưu ý hơn nữa về cách sử dụng Bt và các gen tạo độc tố của Bt trong công tác quản lý dịch bệnh. Để tăng năng suất cây trồng người ta có thể chọn lọc, lai tạo nhằm tìm ra một giống mới có mang các tính trạng ta mong muốn. Phương pháp nầy tốn rất nhiều thời gian và đôi khi việc chọn lọc cũng không mang lai kết quả mong muốn. Ä Một phương pháp khác rút ngắn được thời gian là cải tạo di truyền các giống cây trồng thông qua việc chuyển các gen mong muốn vào cây trồng ta cần. Việc chuyển một gen đặc biệt nào đó vào một cây chủ mới đã đựơc ứng dụng trong nông nghiệp, y học đã giúp thay đổi cuộc sống và bảo vệ sức khõe cho hằng tỉ người trên thế Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 35 giới. Việc chuyển một gen lạ vào cây chủ có thể tiến hành bằng cách sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens hay dùng súng bắn gen. Trong nông nghiệp người ta có 2 hướng để tạo cây trồng chuyển gen là: - Tạo cây kháng thuốc diệt cỏ chủ yếu ở đậu nành, cây cọ dầu, củ cải đường - Tạo cây kháng côn trùng bằng cách chuyển gen tạo độc tố của vi khuẩn B. thuringiensis vào các cây trồng như bắp, đậu nành và bông vải. Lợi ích - Giúp tăng năng suất cây trồng. - Giảm được lượng thuốc trừ dịch hại có nguồn gốc hóa học. - Không gây ô nhiểm môi trường. - Giảm được chi phí đầu tư cho sản xuất - Cây chuyển gen có phẩm chất tốt hơn - Không độc đối với người, động vật, thú nuôi trong nhà, côn trùng có lợi, chim Bất lợi - Mặc dù chưa có nhiều bằng chứng cụ thể nhưng người ta cho là cây chuyển gen có thể gây dị ứng cho một số người. - Gen kháng kháng sinh sử dụng trong qui trình chuyển gen lạ vào cây chủ có thể truyền sang côn trùng làm côn trùng có thể kháng lại kháng sinh nầy. - Gen kháng thuốc diệt cỏ nếu vì lý do gì đó mà chuyển sang cỏ dại thì làm thế nào để diệt cỏ. CHƯƠNG 4 ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN VÀ XỬLÝ MÔI TRƯỜNG I. Ứng dụng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản: Chế phẩm sinh học (probiotics) Fuller (1989), chế phẩm sinh học là một thức ăn bổ sung có chứa vi sinh v ật s ống có ích cho sinh vật chủ vì giúp cải thiện cân bằng đường ru ột c ủa sinh v ật ch ủ. Nhi ều nghiên cứu cho thấy không chỉ có tác dụng vào hệ thống đường ruột, chế phẩm sinh h ọc còn có tác dụng trên mang cá hay da của chúng cũng như môi trường chung quanh c ủa sinh vật chủ. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 36 Nhiều vi sinh vật thuộc nhóm chế phẩm sinh học có nguồn g ốc t ừ môi tr ường ch ớ không phải từ nguồn thức ăn cung cấp như Fuller (1989) đã đề cập. Một định nghĩa mới được người ta cải tiến cho phù hợp với chức năng của ch ế phẩm sinh học “Chế phẩm tiền sinh học là một thức ăn chứa sinh vật s ống có ích cho sinh vật chủ thông qua việc cải thiện mối quan hệ giữa chúng với sinh v ật chủ hay với c ộng đồng vi sinh vật môi trường xung quanh hoặc bảo đảm cải thiện việc sử dụng thức ăn hay nâng cao giá trị dinh dưỡng hoặc tăng khả năng miễn d ịch đối v ới bệnh ho ặc c ải thi ện môi trường xung quanh”. Như vậy, chế phẩm sinh học bao gồm các nhóm vi sinh vật có khả năng chống các mầm bệnh sinh sôi nẩy nở nhanh trong đường ruột, các vi sinh vật giúp tăng giá trị sử dụng thức ăn (giúp tiêu hóa tốt) hay cải thiện chất lượng nước hay kích thích tính miễn nhi ểm của sinh vật chủ. Ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản Chế phẩm sinh học được áp dụng bằng nhiều cách khác nhau. Người ta có thể bổ sung chúng vào thức ăn, cho vào nguồn nước để xử lý nước hay tiêu diệt mầm bệnh thủy sản có trong ao nuôi. Một số nhóm vi sinh vật đã được sử dụng làm chế phẩm sinh học Lactobacillus plantarum Thêm vào môi trường nước ương cá bơn (halibut) để tăng độ sống sót của ấu trùng cá bơn 2 tuần sau khi nở Streptococcus lactis và Lactobacillus bulgaricus Tăng độ sống sót của ấu trùng turbot 17 ngày sau khi nở nhờ tăng mật số rotifers và Artemia Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis Thêm vào nước ao nuôi cá da trơn (catfish) giúp tăng độ sống sót và sản lượng cá Bacillus dòng 11 Thêm vào thức ăn giúp gia tăng trọng lượng trung bình và độ sống sót của ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú (Panaeus.monodon) Bacillus Thêm vào nước ao nuôi giúp tăng độ sống sót của tôm sú và làm giảm mật số nhóm vi khuẩn phát sáng Vibrio Moriaty (1998) đã bảo vệ cho tôm sú nuôi phát triển tốt suốt 160 ngày ở Indonesia khi sử dụng một số giống Bacillus trong quá trình nuôi tôm trong khi ở các ao không sử dụng Bacillus thì hầu như hoàn toàn bị thất bại do vi khuẩn phát sáng Vibrio giết chết ở Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 37 ngày thứ 80 ngày trước khi thu hoạch .Dòng vi khuẩn BY-9 được người ta sản xuất với một số lượng lớn dùng chủng cho bể ương tôm sú đạt mật số 10 6 CFU/ml đã khẳng định khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio harveyi giúp cho ấu trùng tôm sú phát triển tốt tới giai đoạn thứ 10 hậu ấu trùng (PL-10). Cơ chế tác dụng của chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản đến nay vẫn chưa rõ ràng dù đã được tranh luận trong hơn một thập qua. Người ta cho rằng chế phẩm sinh học có tác dụng tốt cho hệ tiêu hóa của động vật cũng có tác dụng tương đương đối với các thủy sản nuôi. Chế phẩm sinh học có thể có là sản xuất ra các chất ức chế, kích thích hệ miễn dịch, cải thiện chất lượng nước, các enzyme giúp tiêu hóa, nguồn dinh dưỡng đa hay vi lượng, cạnh tranh nơi bám với sinh vật gây bệnh. Một trong các tác dụng quan trọng của chế phẩm sinh học đối với môi trường nuôi thủy sản là cải thiện chất lượng nước ao nuôi Các giống vi khuẩn Bacillus, thuộc gram âm góp phần phân hủy hợp chất hữu cơ tốt hơn các vi khuẩn gram âm. Ngoài giống Bacillus nhiều giống vi khuẩn khác có khả năng khử đạm, một tác nhân quan trọng ảnh hưởng to lớn đến quá trình nuôi thủy sản. Các giống thường được sử dụng gồm Nitrobacter, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Enterobacter… II. Ứng dụng vi khuẩn trong xử lý môi trường: Chất thải và công nghệ xử lý chất thải A. Chất thải lỏng 1.1. Các loại nước thải Nước thải là nước sau khi sử dụng của nhu cầu sinh hoạt cá nhân và quá trình sản xuất của nhà máy. Tùy theo mục đích sử dụng mà ta có nhiều loại nước thải a. Nước thải loại 1: gồm nước rửa chai, lọ, hộp sắt. Nước nầy ít khác với tự nhiên (tương đối sạch). Nếu không sử dụng lại có thể cho chảy thẳng ra sông, rạch, ao, ruộng. Nếu sử dụng lại phải chứa vào các bể chứa khuấy đều, làm sạch và bảo hòa không khí để oxid hóa các khí có hại, mangan, sắt hòa tan và một phần chất hữu cơ. Sau đó, lọc nước qua cát trước khi sử dụng lại. b. Nước thải loại 2: bao gồm nước rửa bao bì. Trong nước nầy có chứa chất hữu cơ, vô cơ và một ít vi sinh vật. Do trong loại nước nầy có các loại chất hữu cơ, vô cơ không tan nên trước khi cho chảy vào ao, hô,ö sông, rạch người ta phải làm thật sạch như làm sạch nước uống trước khi sử dụng bằng cách để lắng hay làm kết tủa bằng phèn chua, khử trùng nước bằng chlor... Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 38 c. Nước thải loại 3: là nước từ các máy rửa thiết bị và nguyên liệu và nước dùng sinh hoạt. Ngoài chất vô cơ, nước còn chứa các hợp chất hữu cơ dễ lên men thối rữa và chứa nhiều vi sinh vật. Nước từ các phân xưởng chế biến thực phẩm cũng thuộc loại nước nầy. Nước thải loại 3 phải được làm sạch theo các qui tắt nhất định: để lắng và sau đó làm sạch sinh học. 1. Xử lý chất thải dạng lỏng Mục đích của xử lý nước thải là loại bỏ chất rắn, các khoáng chất dạng hóa tan và chất hữu cơ trước khi cho chảy vào sông ngòi, kênh rạch. a. Giai đoạn một: loại bỏ các vật liệu có kích thước lớn như xác bả thức ăn, sỏi sạn cát... Bằng cách sử dụng các sông chắn rác, bể lắng ăn (hố ga). b. Giai đoạn hai: tách rời các chất rắn lơ lửng và chất béo khỏi nước thải bằng cách giữ nước thải yên trong một bể nhiều giờ để các hạt lơ lửng có thể lắng xuống đáy bể và chất béo sẽ nổi lên trên mặt bể. Sau đó chúng sẽ được xử lý như một dạng chất bùn c. Giai đoạn ba: dùng vi sinh vật để oxít hóa các chất hữu cơ hòa tan trong nước. Các vi sinh vật thích hợp sẽ được nuôi cấy và cho vào nước thải lọc nhỏ giọt hay bùn hoạt động (activated sludge). Các vi sinh vật sẽ sử dụng chất hữu cơ trong nước thải làm thức ăn. Có 3 hướng để xử lý hoàn toàn nước thải trong vi sinh vật gần đây. * Hệ thống phim cố định Người ta nuôi cấy vi sinh vật trên các cơ chất như đá, cát hay nylon. Nước thải được phun đều lên bề mặt cơ chất và chảy qua lớp phim vi sinh vật cố định trên cơ chất. Do chất hữu cơ và chất dinh dưỡng trong chất thải được hấp thu bởi vi sinh vật phát triển và dầy lên. Tiêu biểu cho loại hệ thống này là hệ thống lọc nhỏ giọt, lọc cát hệ thống tiếp xúc sinh học xoay. * Hệ thống phim lơ lững Hệ thống phim lơ lững xoay và trộn các vi sinh vật trong nước thải. Trong khi vi sinh vật hấp thu chất hữu cơ và chất dinh dưỡng từ nước thải, vi sinh vật sẽ tăng trưởng và sinh sản. Sau khi vi sinh vật trộn lơ lững trong nước thải nhiều giờ, chúng bị cố định thành một loại bùn hoạt động. Một phần bùn hoạt động được bơm lại các bể chứa nước thải mới để cung cấp các vi sinh vật giống tiếp tục xử lý nước thải. Các hệ thống phim vi sinh vật lơ lững điển hình là bể bùn hoạt động, bể xục khí, các hố oxit hóa. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 39 * Hệ thống hồ cạn Hệ thống này chứa nước thải trong nhiều tháng để nước thải phân huỷ một cách tự nhiên. Hệ thống xử lý loại nầy có ưu điểm là tận dụng sự thông khí tự nhiên và các vi sinh vật có sẵn để xử lý nước thải. d. Giai đoạn 4 : Đây là giai đoạn loại bỏ các vi sinh vật gây bệnh có trong nước thải. Người ta có thể tiêu diệt các vi sinh vật bằng cách sử dụng chlorine hay dùng tia tử ngoại. Nồng độ cao của chlorine có thể có hại cho các thủy sinh ở ao hồ, sông rạch. B. Chất thải rắn Bao gồm chất thải thành thị như rác rưởi, phế thải từ các lò sát sinh, các nhà máy chế biến thực phẩm (lông thú, lông vũ, máu, móng, xương, gân, mỡ...), xác bả thực vật, lá cây sau vụ mùa, phân chuồng các loại, giấy, nylon, chai lọ, kim loại... Nguyên tắc cơ bản là làm giảm thể tích nước, mất mùi, tiêu diệt được các vi sinh vật và mầm bệnh để sau cùng chất thải có thể dự trử lại, vận chuyển và loại bỏ đi. 1. Giai đoạn 1: phân loại rác Nhiều nước người ta phân loại rác ngay từng hộ gia đình cũng như các khu tập thể hay xưởng chế biến. Chai lọ thuỷ tinh được để trong thùng rác riêng, các bao bì, chai lọ bằng kim loại để riêng, các rác thải hữu cơ để riêng và các loại giấy để riêng. Khi các xe thu rác họ sẽ mang về khu tập trung tái chế hay tái sử dụng bằng các biện pháp khác nhau. 2. Giai đoạn 2: xử lý rác thải a. Đốt Nhược điểm: gây ô nhiễm không khí và đòi hỏi rác phải khô nên gặp nhiều trở ngại khi lượng nước trong chất thải cao hoặc vào mùa mưa bão. b. Ủ phân: Bề cao của các đống phân ủ trong bình khoảng 2m * Đống phân để hở cho khô tự nhiên * Đống phân ủ để yên * Đống phân ủ có che phủ nhưng không cần thiết phải chứa trong các bể đặc biệt nào. * Ủ phân trong các bể chứa đặc biệt nằm ngang hay đứng, có thông gió hay không. * Phân ủ trong các thùng ủ: đây là hình thức ủ phân tiền thân của cách ủ trong các bể chứa nước. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 40 Nhiệt độ của các đống phân ủ có khi lên đến trên 800C sẽ giết chết nhiều loại vi sinh vật. Ủ phân để xử lý chất thải rắn có một vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra phân bón hữu cơ để cải tạo đất, làm đất tơi xốp, tăng độ phì nhiêu và khả năng giữ nước c. Nuôi trùng đất: có thể tiến hành nuôi tự nhiên ở quy mô nhỏ hay ở quy mô công nghiệp. - Nuôi tự nhiên: Phủ một lớp bùn cống lên vùng đất cần cải tạo rồi thả trùng đất vào. Trùng đất sẽ tạo ra một lớp đất tơi xốp giàu chất hữu cơ. - Nuôi công nghiệp: thả trùng đất vào các khay hay ô có chứa chất thải hữu cơ trong trại có mái che. Tạo điều kiện môi trường thích hợp như nhiệt độ, độ ẩm, độ pH... và bổ sung thức ăn cho trùng đất. Sau một thời gian người ta thu hoạch trùng đất làm thức ăn bổ sung nguồn đạm trong khẩu phần thức ăn gia súc. Chất thải do trùng đất phân hủy dùng làm phân bón cho cây trồng. KHÍ SINH HỌC (BIOGAS) Matter % Methane, CH4 50-75 Carbon dioxide, CO2 25-50 Nitrogen, N2 0-10 Hydrogen, H2 0-1 Hydrogen sulphide, H2S 0-3 Oxygen, O2 0-2 Xử lý các hợp chất hóa học sử dụng trong nông nghiệp *DDT: 1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl)ethane, một hợp chất hóa học được sử dụng từ rất lâu trên thị trường có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn Aerobacter aerogenes và nhiều loại tảo nước mặn. Vi khuẩn Phanerochaete chrysosporium oxid hóa DDT để tạo Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 41 ra nhiều sản phẩm biến dưỡng. Ngoài ra, vi khuẩn Alcaligenes eutrophus cũng có khả năng phân hủy hiếu khí DDT * 2,4,5-T : 2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid có thể được phân hủy bởi vi khuẩn Burkholderia cepacia AC 1100. * 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid được phân hủy bởi các giống vi khuẩn như Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacteria, Corynebacteria và Arthrobacteria. * Dioxin: 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo, p-dioxin được nhiều loài vi sinh vật phân hủy như Pseudomonas putida, Trichoderma viride, Bacillus megaterium và Nocardiopsis. * Lindane: 7-hexachlorocyclohexane hai loài vi khuẩn có khả năng phân hủy lindane là Bacillus cereus và Clostridium rectum. * Aldrin và Dieldrin được các loài nấm Aspergillus niger, A. flavus và Penicillium notatum phân hủy * Heptachlor: được phân hủy bởi Rhizopus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma, Nocardia, Streptomyces, Bacillus và Micromonospora. * Chlordane: có thể bị phân hủy bởi Nocardiopsis. Giáo trình: Vi khuẩn học. 2010 Biên soạn: PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ [...]... có thể kháng lại kháng sinh nầy - Gen kháng thuốc diệt cỏ nếu vì lý do gì đó mà chuyển sang cỏ dại thì làm thế nào để diệt cỏ CHƯƠNG 4 ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN VÀ XỬLÝ MÔI TRƯỜNG I Ứng dụng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản: Chế phẩm sinh học (probiotics) Fuller (1989), chế phẩm sinh học là một thức ăn bổ sung có chứa vi sinh v ật s ống có ích cho sinh vật chủ vì giúp cải thiện cân... trình: Vi khuẩn học 2010 Biên soạn: PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Vi n Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 12 Phân loại theo hệ thống Bergey Giới: Vi sinh vật sơ hạch Division: Vi khuẩn 1 Vi khuẩn quang dưỡng 2 Vi khuẩn trượt (Gliding) 3 Vi khuẩn có vỏ bao (Sheath) 4 Vi khuẩn nẩy chồi (budding) 5 Spirochetes 6 Vi khuẩn xoắn 7 Vi khuẩn gram âm hình que và hình cầu 8 Vi khuẩn gram âm hình que kỵ khí tùy ý 9 Vi khuẩn. .. que kỵ khí 10 Vi khuẩn gram âm hình cầu 11 Vi khuẩn gram âm hình cầu kỵ khí 12 Vi khuẩn hóa dị dưỡng 13 Vi khuẩn sinh methane 14 Vi khuẩn hình cầu gram dương 15 Vi khuẩn hình cầu và hình que có khả năng tổng hợp nội bào tử 16 Vi khuẩn hình que không có nội bào tử 17 Xạ khuẩn 18 Rickettsia 19 Mycoplasmas PHÂN LOẠI VI KHUẨN Giáo trình: Vi khuẩn học 2010 Biên soạn: PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Vi n Công nghệ... các vi khuẩn hình que, gram âm, rộng khoảng 0,5-0,6µm Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp N trong một khoảng pH biến thiên từ 5,3-8 Trong môi trường bán đặc vi khuẩn Herbaspirillum tạo thành một lớp màng mỏng , trắng, mịn (pellicle) Khi cấy chuyển lên môi trường đặc JNFb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường đặc BMS thu được khuẩn. .. các vi sinh vật giúp tăng giá trị sử dụng thức ăn (giúp tiêu hóa tốt) hay cải thiện chất lượng nước hay kích thích tính miễn nhi ểm của sinh vật chủ Ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản Chế phẩm sinh học được áp dụng bằng nhiều cách khác nhau Người ta có thể bổ sung chúng vào thức ăn, cho vào nguồn nước để xử lý nước hay tiêu diệt mầm bệnh thủy sản có trong ao nuôi Một số nhóm vi sinh... học Cần Thơ 13 VI KHUẨN GRAM ÂM Giáo trình: Vi khuẩn học 2010 Biên soạn: PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Vi n Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 14 Giáo trình: Vi khuẩn học 2010 Biên soạn: PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Vi n Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 15 Giáo trình: Vi khuẩn học 2010 Biên soạn: PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Vi n Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 16 CHƯƠNG BA ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG SẢN XUẤT NÔNG... các tế bào vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5-0,9 x 1,2-3,0 µm, không tạo bào tử, gram âm, có thể di động được nhờ có chiên mao Các vi khuẩn giống này thuộc loại hiếu khí Các khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, trong mờ, có tạo chất nhầy Kích thước khuẩn lạc 2-4 mm sau khi nuôi cấy trên môi trường YEM agar 3 - 5 ngày Vi khuẩn tạo acid khi môi trường nuôi có nguồn carbohydrat là mannitol và một số... cung cấp cho môi trường xung quanh Hiện tượng này có thể thấy được trong đĩa petri, xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ có quầng trong (halo), là nơi mà P khó tan chuyển hóa sang dạng tan được và được vi sinh vật hấp thu một phần Vi khuẩn giải phóng các enzyme và những acid hữu cơ có khả năng hòa tan những hợp chất lân khó (Yahya và Al-Azawi, 1989) Vi khuẩn hòa tan lân khó tan bằng cách sản xuất ra... trường đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắng sữa B VI KHUẨN HÒA TAN LÂN Trong đất P vô cơ khó tan có thể được vi sinh vật chuyển hóa thành dạng dễ tan Vi khuẩn có khả năng này, gồm có: Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Thiobacterium, vv… Các vi khuẩn này nuôi trong môi trường dinh dưỡng có chứa apatit (Ca3(PO4)2), hoặc trong môi trường có đá P nghiền mịn, có thể phân hủy để hấp... các giống cây trồng thông qua vi c chuyển các gen mong muốn vào cây trồng ta cần Vi c chuyển một gen đặc biệt nào đó vào một cây chủ mới đã đựơc ứng dụng trong nông nghiệp, y học đã giúp thay đổi cuộc sống và bảo vệ sức khõe cho hằng tỉ người trên thế Giáo trình: Vi khuẩn học 2010 Biên soạn: PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Vi n Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 35 giới Vi c chuyển một gen lạ vào cây chủ có ... Gen kháng thuốc diệt cỏ lý mà chuyển sang cỏ dại làm để diệt cỏ CHƯƠNG ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN VÀ XỬLÝ MÔI TRƯỜNG I Ứng dụng vi khuẩn nuôi trồng thủy sản: Chế phẩm sinh học... dưỡng Vi khuẩn trượt (Gliding) Vi khuẩn có vỏ bao (Sheath) Vi khuẩn nẩy chồi (budding) Spirochetes Vi khuẩn xoắn Vi khuẩn gram âm hình que hình cầu Vi khuẩn gram âm hình que kỵ khí tùy ý Vi khuẩn. .. lớn đến trình nuôi thủy sản Các giống thường sử dụng gồm Nitrobacter, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Enterobacter… II Ứng dụng vi khuẩn xử lý môi trường: Chất thải công nghệ xử lý chất thải A