Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản và làm sạch môi trường

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: - Thiết lập các công thức môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau để tối ưu hóa quá trình lên men chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản và xử lý ô nhiễm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Trung tâm Công nghệ Sinh học

-

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP ĐHQG

nuôi trồng thủy sản và làm sạch môi trường

Hà nội 2/2007

THÔNG TIN VỀ ĐỀ TÀI

1 TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng

thủy sản và làm sạch môi trường

2 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS Đinh Thúy Hằng, cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm

CNSH, ĐHQGHN

3 CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Công nghệ Sinh học

4 CẤP QUẢN LÝ: Đại học Quốc gia Hà nội

5 KINH PHÍ: 25 triệu đồng

6 THỜI GIAN THỰC HIỆN: 1/2006 – 12/2006

7 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

- Thiết lập các công thức môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau để tối ưu hóa quá trình lên men chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản và xử lý ô nhiễm môi trường

- Theo dõi biến đổi về thành phần loài vi sinh vật trong chế phẩm cũng như hoạt tính của chúng thông qua việc ứng dụng trên một số nguồn nước thải khác nhau

8 NHỮNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Thiết lập và thử nghiệm các công thức lên men vi sinh vật để nhân chế phẩm

- Thử nghiệm tác dụng của chế phẩm lên men trên nước thải ô nhiễm

- Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN tổng số từ tập đoàn vi sinh vật trong chế phẩm

- Nhân gen 16S rADN bằng các đoạn mồi đặc hiệu dùng trong phân tích DGGE

- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid biến tính để phân tích và so sánh thành phần loài vi sinh vật trong các chế phẩm

9 CÁN BỘ NGHIÊN CỨU THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI:

Họ và tên, đơn vị công tác Trách nhiệm trong

đề tài

Thời gian tham gia

đề tài

1 Đinh Thúy Hằng, Trung tâm CNSH

2 Nguyễn Minh Giảng, Trung tâm CNSH

3 Nguyễn Thị Vân, Trung tâm CNSH

4 Nguyễn Thị Kim Quy, Trung tâm CNSH

Chủ nhiệm đề tài Tham gia thực hiện Tham gia thực hiện Tham gia thực hiện

12 tháng

10 tháng

10 tháng

10 tháng

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

MỞ ĐẦU

Vai trò của vi sinh vật trong các lĩnh vực chăn nuôi và bảo vệ môi trường ngày càng được khẳng định Nếu như cách đây 10 năm người Việt nam lần đầu tiên mới được nghe đến chế phẩm vi sinh vật có tên gọi EM xuất xứ từ Nhật bản với hiệu quả vô cùng lớn trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống thì hiện nay trên thị trường trong nước đã xuất hiện vô số các sản phẩm vi sinh khác nhau do các nhà khoa học và các cơ sở trong nước nghiên cứu và sản xuất Tuy nhiên những chế phẩm sản xuất trong nước nhiều khi không đem lại kết quả mong muốn, còn chế phẩm ngoại nhập thì không kinh tế vì giá thành thường rất cao so với thu nhập của người nông dân, thậm chí đối với cả nhiểu nhà đầu tư sản xuất lớn trong các lĩnh vực nuôi trồng thủy sản và xử lý ô nhiễm môi trường Nguyên nhân căn bản khiến cho các chế phẩm trong nước kém cạnh tranh là: (i) thành phần loại vi sinh vật trong các chế phẩm chưa thật đầy đủ, do vậy tập đoàn vi sinh vật chưa hoàn toàn thực hiện được chức năng khép kín các quá trình phân rã chất thải trong tự nhiên, ví dụ như các vi sinh vật kỵ khí còn ít được chú trọng mặc dù chúng là những mắt xích quan trọng trong chu trình này, và (ii) trong quá trình sản xuất ở qui mô lớn, chế phẩm sản xuất trong nước nhiều khi không ổn định về thành phần loài vi sinh vật cũng như hoạt tính sinh học của chúng, do vậy chất lượng không đảm bảo khi đến tay người tiêu dùng Bên cạnh đó còn phải kể đến yếu tố kém cạnh tranh của các chủng vi sinh vật sử dụng trong chế phẩm ngoại nhập ở các điều kiện môi trường Việt nam Để khắc phục những hạn chế kể trên, việc chế tạo và hoàn thiện các sản phẩm sinh học trên nguồn vi sinh vật trong nước để thay thế các chế phẩm ngoại nhập có thể coi là giải pháp duy nhất

Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN hiện là nơi có trọng trách lưu giữ nguồn gen

vi sinh vật của cả nước để làm cơ sở cho việc phát triển ngành công nghệ sinh học Bên cạnh việc phân lập và bảo quản các chủng vi sinh vật có ích đối với ngành công nghệ sinh học, Trung tâm còn có nhiệm vụ phát triển sinh phẩm để phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong nước Trong qui trình phát triển chế phẩm vi sinh ở qui mô lớn, việc đảm bảo thành phần và hoạt tính vi sinh vật

là yêu cầu số một Đề tài này được đặt ra với mục tiêu nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện trong qui trình sản xuất lên chế phẩm vi sinh MP – AQ dùng trong nuôi trồng thủy sản và xử lý ô nhiễm môi trường thông qua việc đánh giá tính ổn định của tập đoàn vi sinh vật trong chế phẩm cũng như hoạt tính của chúng qua mỗi bước của qui trình sản xuất Từ các kết quả thu được chúng tôi sẽ đưa ra một qui trình sản xuất tối ưu nhất đối với chế phẩm vi sinh được nghiên cứu này

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nôi trồng thủy sản là một trong các hoạt động kinh tế đang được chú trọng ở nước ta hiện nay nhờ những nguồn thu đáng kể mà nó đem lại cho tổng sản phẩm quốc nội Tuy nhiên đây cũng là ngành kinh doanh sản xuất có rủi ro cao và có quan hệ mật thiết với môi trường tự nhiên Phát triển nuôi trông thủy sản ở qui mô lớn dẫn đến việc gây ô nhiễm nặng các thủy vực, đặc biệt là các khu vực đất ngập mặn, và ngược lại việc ô nhiễm này có tác động vô cùng nguy hại cho sản xuất và kinh doanh thủy sản Trong vài năm gần đây rất nhiều hộ nông dân kinh doanh nuôi trồng thủy sản trở nên trắng tay do tôm cá mắc bệnh chết vì môi trường quá ô nhiễm, bên cạnh đó sản phẩm thu hoạch lại không có giá trị xuất khẩu cao vì người sản xuất đã sử dụng nhiều hóa chất (thuốc kháng sinh, thuốc tăng trọng, v.v.) trong quá trình sản xuất

Trên thế giới việc ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản đã được biết đến từ lâu Các nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong mục đích này là probiotic (vi khuẩn lactic, bacillus), vi sinh vật ôxy hóa H2S (vi khuẩn tía quang hợp kỵ khí), vi sinh vật tham gia vào các chu trình nitơ, phospho và phân giải các hợp chất hữu cơ (pseudomonas, rhodococcus, VK khử nitrat, VK tích lũy phospho) Thông thường các nhà sản xuất sử dụng chế phẩm định kỳ trong suốt thời gian sinh trưởng của vật nuôi để đảm bảo tăng cường sức đề kháng cho tôm cá một cách

tự nhiên và giữ môi trường sinh trưởng trong sạch trong suốt vụ nuôi trồng Các loài vi sinh vật hữu ích dùng để sản xuất chế phẩm thường là các loài được phân lập từ tự nhiên và được sàng lọc trong phòng thí nghiệm dựa trên khả năng thể hiện hoạt tính sinh học cao, do vậy khi được đưa lại môi trường chúng có sức cạnh tranh tốt Tuy nhiên, việc tuyển chọn được các chủng vi sinh vật hữu ích với hoạt tính cao mới chỉ quyết định được một phần thành công của chế phẩm vi sinh vật Các kỹ thuật và điều kiện áp dụng trong qui trình sản xuất chế phẩm ở qui mô lớn đảm bảo được thành phần và hoạt tính của các vi sinh vật này đến tay người sử dụng cũng là một phần không nhỏ quyết định chế phẩm có được đưa vào thực tế hay không Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm phải được lựa chọn theo cả hai tiêu chí giá thành và hiệu quả để đảm bảo được tính cạnh tranh của chế phẩm trên thị trường so với các loại chế phẩm ngoại nhập và chế phẩm nội khác

Mặc dù hiện nay các chế phẩm ngoại nhập dùng cho nuôi trồng thủy sản đang rất phổ biến trên thị trường Việt nam nhưng người sử dụng vẫn đang rất mong đợi một sản phẩm trong nước thích hợp với điều kiện Việt nam và có giá thành giảm so với chế phẩm ngoại nhập Trong tình hình như vậy, với vai trò là các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học, Trung tâm CNSH đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản

ở qui mô nhỏ, làm cơ sở tiến tới sản xuất ở qui mô lớn với giá thành hợp lý, cạnh tranh được với các sản phẩm tương tự trên thị trường

PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguồn vi sinh vật, phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt tính

Các chủng vi sinh vật dùng làm chế phẩm (bảng 1) được lấy từ Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Trung tâm CNSH – ĐHQGHN Các chủng này được phân lập và sàng lọc theo tiêu chí hoạt tính sinh học cao, như khả năng sinh enzym ngoại bào (amylaza, proteaza, cellulaza và chitinaza), khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh (như một số loài bacillus và lactobacillus), khả năng phân hủy các chất gây độc và gây mùi thường có ở các thủy vực nuôi tôm cá (H2S, các hợp chất indol) Các nhóm vi sinh vật đã lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng để thu sinh khối trước khi tiến hành phối trộn để sản xuất chế phẩm

Bảng 1 Vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm xử lý ô nhiễm tại các đầm nuôi tôm STT Tên chế phẩm Tác dụng Thành phần vi sinh vật

1 MP-AQ Tăng cường sức đề kháng cho

tôm, ức chế VSV gây bệnh và

xử lý một phần ô nhiễm hữu cơ

Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn lactic Nấm men

2.2 Thử nghiệm các điều kiện lên men

Lên men hỗn hợp các chủng VSV trong chế phẩm được tiến hành trong các điều kiện khác nhau

về nhiệt độ, pH môi trường, độ muối nhằm mục đích tìm ra điều kiện tối ưu, đảm bảo sự phát triển đồng thời của các nhóm VSV có trong chế phẩm

Bảng 2 Các điều kiện lên men chế phẩm đã tiến hành thử nghiệm

Nguồn cơ chất sử dụng để lên men là rỉ đường với nồng độ 5-10%

2.3 Phân tích số lượng VSV và tính ổn định về thành phần loài VK trong chế phẩm

Số lượng VSV hiếu khí được xác định trên môi trường thạch đĩa thích ứng với mỗi loại VSV Số lượng VSV kỵ khí được xác định theo phương pháp MPN trên môi trường được loại bỏ ôxy hoàn

toàn theo phương pháp Hungate (Widdel & Bak, 1992) Biến đổi về thành phần loài vi khuẩn trong các chế phẩm được đánh giá thông qua phương pháp điện di gel biến tính một đoạn gen 16S rARN (PCR-DGGE) ADN tổng số của các loài VSV trong mỗi chế phẩm được tách chiết dựa theo phương pháp của Zhou và công sự với một vài cải tiến Một đoạn gen 16S rARN dài

550 bazơ nitơ được nhân bằng cách dùng 2 đoạn mồi GM5F-GC và 907R thông qua chương trình PCR “touch down” (Muezer và cộng sự, 1993) Đoạn gen thu được sẽ được phân tích trên gel polyacrylamid biến tính (20% - 70% urê và formamid) để phân tách các băng đại diện cho mỗi nhóm vi khuẩn có mặt trong chế phẩm Các băng quan trọng sẽ được thu hồi và đọc trình tự để xác định tên khoa học của nhóm vi khuẩn mà băng đó đại diện

2.4 Thí nghiệm trên nguồn nước ô nhiễm

Tác dụng của chế phẩm được kiểm tra trong phòng thí nghiệm trên nguồn nước thải sinh hoạt lấy

từ sông Tô lịch (Hà nội) có độ ô nhiễm hữu cơ cao

Thể tích mỗi lô thí nghiệm: 2 lít nước thải

Liều lượng chế phẩm sử dụng: 1 ppm

Quan sát và phân tích: pH, BOD và sự thay đổi màu sắc của nước ô nhiễm

2.5 Thí nghiệm trên tôm ở qui mô nhỏ

Chế phẩm VSV có hiệu quả cao nhất trong thí nghiệm trên nước thải sinh hoạt được thử nghiệm

ở đầm tôm trên qui mô nhỏ

Địa điểm thử nghiệm: Đầm tôm Minh Thành, Công ty Đầu tư & Phát triển sản xuất Hạ long Qui mô thử nghiệm: 2 tấn tôm

Chỉ tiêu đánh giá: giảm NH4+ và tác dụng đối với độ bền của tảo Nanochloropsis sp (các chỉ

tiêu này do cơ sở sản xuất tự tiến hành để đảm bảo tính khách quan)

PHẦN III KẾT QUẢ THU ĐƯỢC

3.1 Thí nghiệm lên men đối với các chế phẩm

Chế phẩm MP-AQ được tiến hành lên men hỗn hợp trên môi trường chứa 5% rỉ đường làm nguồn cacbon và năng lượng có bổ sung vitamin và vi lượng (Widdel & Bak, 1992) cần thiết cho

sự sinh trưởng của vi sinh vật Điều kiện lên men thay đổi về độ muối và độ ổn định pH (bảng 2) qua 3 thế hệ liên tiếp Thành phần loài VSV trong chế phẩm qua mỗi thế hệ lên men cũng như hoạt tính của chế phẩm được đánh giá và so sánh với hai đối chứng (A) hỗn hợp vi sinh vật gốc

và (B) chế phẩm nhân trong môi trường chỉ có nước máy và rỉ đường (Trung tâm phát triển CN

Việt-Nhật) Các phương án thí nghiệm (bảng 3) đều được tiến hành ở nhiệt độ 28 C trong thời gian 4 ngày

Bảng 3 Thí nghiệm lên men chế phẩm MP-AQ3

STT Phương án TN Đệm pH Độ muối Thế hệ pH sau lên men

Chú thích: (+): có bổ sung 10 mM NaHCO3 làm đệm pH trong môi trường lên men

(): không bổ sung đệm pH nào

Hình 1 Các phươn án lên men chế phẩm MP – AQ sau 1 ngày ở 28 C

Trong mọi phương án lên men, vi sinh vật phát triển nhanh, bắt đầu tạo sinh khối và bọt khí ngay sau ngày lên men đầu tiên (hình 1) Kết quả phân tích cho thấy các phương án lên men

có bổ sung đệm pH có giá trị pH trong sản phẩm sau lên men cao hơn các phương án không bổ

sung đệm, tuy nhiên sự khác biệt này không đáng kể Do vậy các phân tích tiếp theo được tiến hành đối với các phương án lên men không có đệm pH

3.2 Phân tích VSV và tính ổn định về thành phần loài của chế phẩm

Thành phần VSV trong chế phẩm MP – AQ qua các thế hệ lên men được xác định bằng phương pháp nhân gen và điện di biến tính trên gel polyacrylamid (PCR-DGGE) (hình 2)

Hình 2 Gel điện di biến tính phân tích thành phần vi khuẩn trong các sản phẩm lên men

của chế phẩm MP – AQ Thứ tự các giếng tra mẫu trên gel như sau: 1 – MP-AQ gốc; 2 – K1; 3 – BW1-A; 4 – K2; 5 – BW2-A; 6 – K3; 7 – BW3-A

Kết quả phân tích cho thấy nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong mẫu gốc ban đầu là lactobacillus plantarum vẫn được duy trì qua 3 thế hệ lên men theo công thức BW (mẫu số 3, 5 và

7 trên gel điện di), trong khi đó lên men theo cách thông thường thì không duy trì được (mẫu số 2,

4 và 6 trên gel điện di)

3.3 Kiểm tra tác dụng của chế phẩm trên nguồn nước thải sinh hoạt ô nhiễm chất hữu cơ

Công thức xử lý nước thải sinh hoạt (lấy từ sông Tô lịch Hà nội) bằng chế phẩm MP–AQ như sau Thí nghiệm được tiến hành trong các bô can thủy tinh thể tích 5 lít Lượng nước thải đưa vào để

xử lý trong mỗi bô can là 2 lít Các phương án của chế phẩm MP–AQ (qua các chu trình lên men khác nhau) được bổ sung vào nước ô nhiễm để xử lý ở nồng độ 50 ppm Đối chứng âm là nước thải không bổ sung chế phẩm, đối chứng dương là nước thải có bổ sung chế phẩm MP–AQ gốc Thay đổi về chỉ số BOD trong các thí nghiệm xử lý theo thời gian được trình bày ở bảng 5

1 2 3 4 5 6 7

Lactobacillus plantarum

Bảng 5 Thay đổi BOD trong các công thức xử lý bằng chế phẩm MP – AQ sau 6 ngày STT Tên mẫu BOD (mg/l) Thay đổi về màu sắc của nước xử lý

3 Đối chứng dương 15 Xanh rêu, trong, đáy có lớp cặn lắng đen

Kết quả phân tích BOD cho thấy phương pháp lên men bổ sung muối có hiệu quả xử lý tốt hơn phương pháp lên men không bổ sung muối đối với nước thải sinh hoạt có ô nhiễm hữu cơ Tác dụng xử lý tương đối ổn định qua ít nhất là 3 thế hệ lên men chế phẩm MP–AQ

3.4 Kiểm tra tác dụng của chế phẩm trên đầm tôm ở qui mô nhỏ (2 tấn)

Chế phẩm MP–AQ lên men ở thế hệ 3 được thử nghiệm trên qui mô nhỏ tại đầm tôm Minh Thành (Công ty đầu tư và phát triển sản xuất Hạ long) Để đảm bảo khách quan, tác dụng của chế phẩm được đánh giá ngay tại phòng kỹ thuật của Công ty Kết quả phân tích ammonium cho thấy chế phẩm MP–AQ3 có hiệu quả tương đương với chế phẩm hiện Công ty đang dùng có nguồn gốc từ nước ngoài (hình 3) Như vậy chế phẩm MP–AQ3 có khả năng được chấp nhận để thay thế chế phẩm ngoại nhập hiện đang được công ty ĐT&PTSX Hạ long sử dụng

0 1 2 3 4 5

Thời gian (ngày)

Đối chứng Ngoại nhập MP-AQ3

Hình 3 Tác dụng của chế phẩm MP–AQ3 đối với nồng độ ammonium tại đầm nuôi tôm

IV KẾT LUẬN

1 Đưa ra qui trình lên men đảm bảo sự ổn định về thành phần loài vi sinh vật và tác dụng của chế phẩm, làm cơ sở để phát triển sản xuất ở qui mô lớn hơn

2 Chế phẩm vi sinh sản xuất thử nghiệm theo qui trình lên men đề ra có tác dụng tốt đối với

môi trường ô nhiễm (giảm BOD) và đầm nuôi tôm (giảm NH4+

) do vậy có khả năng thay

thế chế phẩm ngoại nhập dùng cho mục đích nuôi trồng thủy sản và làm sạch môi trường

V TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Công nghệ vi sinh vật hữu hiệu EM (effective microorganisms) Trung tâm phát triển công nghệ Việt-Nhật, 2004

2 James G Cappuccino and Natalie Sherman, 2002 Microbiology: A Laboratory Manual,

6th ed Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA

3 Masachika Maeda Microbial Processes in Aquaculture 1999 Society for the Biological Creation and Enhancement of the Aquatic Environment (BIOCREATE), UK and Japan

4 Michael T Madigan, John M Martinko & Jack Parker 1997 Brock Biology of microorganisms, 8th edition Prentice Hall International, Inc

5 Muyzer G., E.C De Waal and A.G Uitterlinden, 1993 Profoling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain