Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản và làm sạch môi trường

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Trung tâm Công nghệ Sinh học - BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP ĐHQG TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy sản làm mơi trƣờng CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TS Đinh Thúy Hằng Hà nội 2/2007 THÔNG TIN VỀ ĐỀ TÀI TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy sản làm môi trƣờng CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS Đinh Thúy Hằng, cán nghiên cứu thuộc Trung tâm CNSH, ĐHQGHN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Công nghệ Sinh học CẤP QUẢN LÝ: Đại học Quốc gia Hà nội KINH PHÍ: 25 triệu đồng THỜI GIAN THỰC HIỆN: 1/2006 – 12/2006 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: - Thiết lập công thức môi trường điều kiện nuôi cấy khác để tối ưu hóa q trình lên men chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy sản xử lý ô nhiễm môi trường - Theo dõi biến đổi thành phần loài vi sinh vật chế phẩm hoạt tính chúng thơng qua việc ứng dụng số nguồn nước thải khác NHỮNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: - Thiết lập thử nghiệm công thức lên men vi sinh vật để nhân chế phẩm - Thử nghiệm tác dụng chế phẩm lên men nước thải ô nhiễm - Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN tổng số từ tập đoàn vi sinh vật chế phẩm - Nhân gen 16S rADN đoạn mồi đặc hiệu dùng phân tích DGGE - Điện di sản phẩm PCR gel polyacrylamid biến tính để phân tích so sánh thành phần loài vi sinh vật chế phẩm CÁN BỘ NGHIÊN CỨU THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: Họ tên, đơn vị công tác Trách nhiệm đề tài Thời gian tham gia đề tài Chủ nhiệm đề tài 12 tháng Nguyễn Minh Giảng, Trung tâm CNSH Tham gia thực 10 tháng Nguyễn Thị Vân, Trung tâm CNSH Tham gia thực 10 tháng Nguyễn Thị Kim Quy, Trung tâm CNSH Tham gia thực 10 tháng Đinh Thúy Hằng, Trung tâm CNSH KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Vai trò vi sinh vật lĩnh vực chăn nuôi bảo vệ môi trường ngày khẳng định Nếu cách 10 năm người Việt nam lần nghe đến chế phẩm vi sinh vật có tên gọi EM xuất xứ từ Nhật với hiệu vô lớn nhiều lĩnh vực sống thị trường nước xuất vô số sản phẩm vi sinh khác nhà khoa học sở nước nghiên cứu sản xuất Tuy nhiên chế phẩm sản xuất nước nhiều không đem lại kết mong muốn, cịn chế phẩm ngoại nhập khơng kinh tế giá thành thường cao so với thu nhập người nơng dân, chí nhiểu nhà đầu tư sản xuất lớn lĩnh vực nuôi trồng thủy sản xử lý ô nhiễm môi trường Nguyên nhân khiến cho chế phẩm nước cạnh tranh là: (i) thành phần loại vi sinh vật chế phẩm chưa thật đầy đủ, tập đoàn vi sinh vật chưa hoàn tồn thực chức khép kín q trình phân rã chất thải tự nhiên, ví dụ vi sinh vật kỵ khí cịn trọng chúng mắt xích quan trọng chu trình này, (ii) trình sản xuất qui mô lớn, chế phẩm sản xuất nước nhiều không ổn định thành phần lồi vi sinh vật hoạt tính sinh học chúng, chất lượng không đảm bảo đến tay người tiêu dùng Bên cạnh cịn phải kể đến yếu tố cạnh tranh chủng vi sinh vật sử dụng chế phẩm ngoại nhập điều kiện môi trường Việt nam Để khắc phục hạn chế kể trên, việc chế tạo hoàn thiện sản phẩm sinh học nguồn vi sinh vật nước để thay chế phẩm ngoại nhập coi giải pháp Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN nơi có trọng trách lưu giữ nguồn gen vi sinh vật nước để làm sở cho việc phát triển ngành công nghệ sinh học Bên cạnh việc phân lập bảo quản chủng vi sinh vật có ích ngành công nghệ sinh học, Trung tâm cịn có nhiệm vụ phát triển sinh phẩm để phục vụ cho nhu cầu sử dụng nước Trong qui trình phát triển chế phẩm vi sinh qui mơ lớn, việc đảm bảo thành phần hoạt tính vi sinh vật yêu cầu số Đề tài đặt với mục tiêu nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện qui trình sản xuất lên chế phẩm vi sinh MP – AQ dùng nuôi trồng thủy sản xử lý ô nhiễm môi trường thơng qua việc đánh giá tính ổn định tập đoàn vi sinh vật chế phẩm hoạt tính chúng qua bước qui trình sản xuất Từ kết thu đưa qui trình sản xuất tối ưu chế phẩm vi sinh nghiên cứu PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nôi trồng thủy sản hoạt động kinh tế trọng nước ta nhờ nguồn thu đáng kể mà đem lại cho tổng sản phẩm quốc nội Tuy nhiên ngành kinh doanh sản xuất có rủi ro cao có quan hệ mật thiết với môi trường tự nhiên Phát triển nuôi trông thủy sản qui mô lớn dẫn đến việc gây ô nhiễm nặng thủy vực, đặc biệt khu vực đất ngập mặn, ngược lại việc nhiễm có tác động vơ nguy hại cho sản xuất kinh doanh thủy sản Trong vài năm gần nhiều hộ nông dân kinh doanh nuôi trồng thủy sản trở nên trắng tay tơm cá mắc bệnh chết mơi trường q ô nhiễm, bên cạnh sản phẩm thu hoạch lại khơng có giá trị xuất cao người sản xuất sử dụng nhiều hóa chất (thuốc kháng sinh, thuốc tăng trọng, v.v.) trình sản xuất Trên giới việc ứng dụng vi sinh vật nuôi trồng thủy sản biết đến từ lâu Các nhóm vi sinh vật thường sử dụng mục đích probiotic (vi khuẩn lactic, bacillus), vi sinh vật ơxy hóa H2S (vi khuẩn tía quang hợp kỵ khí), vi sinh vật tham gia vào chu trình nitơ, phospho phân giải hợp chất hữu (pseudomonas, rhodococcus, VK khử nitrat, VK tích lũy phospho) Thơng thường nhà sản xuất sử dụng chế phẩm định kỳ suốt thời gian sinh trưởng vật nuôi để đảm bảo tăng cường sức đề kháng cho tôm cá cách tự nhiên giữ môi trường sinh trưởng trong suốt vụ ni trồng Các lồi vi sinh vật hữu ích dùng để sản xuất chế phẩm thường loài phân lập từ tự nhiên sàng lọc phịng thí nghiệm dựa khả thể hoạt tính sinh học cao, đưa lại mơi trường chúng có sức cạnh tranh tốt Tuy nhiên, việc tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu ích với hoạt tính cao định phần thành công chế phẩm vi sinh vật Các kỹ thuật điều kiện áp dụng qui trình sản xuất chế phẩm qui mô lớn đảm bảo thành phần hoạt tính vi sinh vật đến tay người sử dụng phần không nhỏ định chế phẩm có đưa vào thực tế hay khơng Bên cạnh đó, nguồn ngun liệu để sản xuất chế phẩm phải lựa chọn theo hai tiêu chí giá thành hiệu để đảm bảo tính cạnh tranh chế phẩm thị trường so với loại chế phẩm ngoại nhập chế phẩm nội khác Mặc dù chế phẩm ngoại nhập dùng cho nuôi trồng thủy sản phổ biến thị trường Việt nam người sử dụng mong đợi sản phẩm nước thích hợp với điều kiện Việt nam có giá thành giảm so với chế phẩm ngoại nhập Trong tình vậy, với vai trị nhà nghiên cứu lĩnh vực công nghệ sinh học, Trung tâm CNSH tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy sản qui mô nhỏ, làm sở tiến tới sản xuất qui mô lớn với giá thành hợp lý, cạnh tranh với sản phẩm tương tự thị trường PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn vi sinh vật, phƣơng pháp ni cấy xác định hoạt tính Các chủng vi sinh vật dùng làm chế phẩm (bảng 1) lấy từ Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Trung tâm CNSH – ĐHQGHN Các chủng phân lập sàng lọc theo tiêu chí hoạt tính sinh học cao, khả sinh enzym ngoại bào (amylaza, proteaza, cellulaza chitinaza), khả ức chế vi sinh vật gây bệnh (như số loài bacillus lactobacillus), khả phân hủy chất gây độc gây mùi thường có thủy vực nuôi tôm cá (H2S, hợp chất indol) Các nhóm vi sinh vật lựa chọn nuôi cấy môi trường dịch lỏng để thu sinh khối trước tiến hành phối trộn để sản xuất chế phẩm Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm xử lý ô nhiễm đầm nuôi tôm Bảng STT Tên chế phẩm MP-AQ Tác dụng Thành phần vi sinh vật Tăng cường sức đề kháng cho Vi khuẩn Bacillus tôm, ức chế VSV gây bệnh Vi khuẩn lactic xử lý phần ô nhiễm hữu Nấm men 2.2 Thử nghiệm điều kiện lên men Lên men hỗn hợp chủng VSV chế phẩm tiến hành điều kiện khác nhiệt độ, pH môi trường, độ muối nhằm mục đích tìm điều kiện tối ưu, đảm bảo phát triển đồng thời nhóm VSV có chế phẩm Các điều kiện lên men chế phẩm tiến hành thử nghiệm Bảng STT Đệm pH Ký hiệu Độ muối FW-A Khơng có Nước (0,1% NaCl) FW-B 10 mM NaHCO3 Nước (0,1% NaCl) BW-A Khơng có Nước lợ (1,5% NaCl) BW-B 10 mM NaHCO3 Nước lợ (1,5% NaCl) Nguồn chất sử dụng để lên men rỉ đường với nồng độ 5-10% 2.3 Phân tích số lƣợng VSV tính ổn định thành phần lồi VK chế phẩm Số lượng VSV hiếu khí xác định mơi trường thạch đĩa thích ứng với loại VSV Số lượng VSV kỵ khí xác định theo phương pháp MPN môi trường loại bỏ ôxy hoàn toàn theo phương pháp Hungate (Widdel & Bak, 1992) Biến đổi thành phần loài vi khuẩn chế phẩm đánh giá thông qua phương pháp điện di gel biến tính đoạn gen 16S rARN (PCR-DGGE) ADN tổng số loài VSV chế phẩm tách chiết dựa theo phương pháp Zhou công với vài cải tiến Một đoạn gen 16S rARN dài 550 bazơ nitơ nhân cách dùng đoạn mồi GM5F-GC 907R thông qua chương trình PCR “touch down” (Muezer cộng sự, 1993) Đoạn gen thu phân tích gel polyacrylamid biến tính (20% - 70% urê formamid) để phân tách băng đại diện cho nhóm vi khuẩn có mặt chế phẩm Các băng quan trọng thu hồi đọc trình tự để xác định tên khoa học nhóm vi khuẩn mà băng đại diện 2.4 Thí nghiệm nguồn nƣớc ô nhiễm Tác dụng chế phẩm kiểm tra phịng thí nghiệm nguồn nước thải sinh hoạt lấy từ sơng Tơ lịch (Hà nội) có độ nhiễm hữu cao Thể tích lơ thí nghiệm: lít nước thải Liều lượng chế phẩm sử dụng: ppm Quan sát phân tích: pH, BOD thay đổi màu sắc nước ô nhiễm 2.5 Thí nghiệm tơm qui mơ nhỏ Chế phẩm VSV có hiệu cao thí nghiệm nước thải sinh hoạt thử nghiệm đầm tôm qui mô nhỏ Địa điểm thử nghiệm: Đầm tôm Minh Thành, Công ty Đầu tư & Phát triển sản xuất Hạ long Qui mô thử nghiệm: tôm Chỉ tiêu đánh giá: giảm NH4+ tác dụng độ bền tảo Nanochloropsis sp (các tiêu sở sản xuất tự tiến hành để đảm bảo tính khách quan) PHẦN III KẾT QUẢ THU ĐƢỢC 3.1 Thí nghiệm lên men chế phẩm Chế phẩm MP-AQ tiến hành lên men hỗn hợp môi trường chứa 5% rỉ đường làm nguồn cacbon lượng có bổ sung vitamin vi lượng (Widdel & Bak, 1992) cần thiết cho sinh trưởng vi sinh vật Điều kiện lên men thay đổi độ muối độ ổn định pH (bảng 2) qua hệ liên tiếp Thành phần loài VSV chế phẩm qua hệ lên men hoạt tính chế phẩm đánh giá so sánh với hai đối chứng (A) hỗn hợp vi sinh vật gốc (B) chế phẩm nhân mơi trường có nước máy rỉ đường (Trung tâm phát triển CN Việt-Nhật) Các phương án thí nghiệm (bảng 3) tiến hành nhiệt độ 28 C thời gian ngày Bảng Thí nghiệm lên men chế phẩm MP-AQ3 Phƣơng án TN FW1-A FW1-B BW1-A BW1-B FW2-A FW2-B BW2-A BW2-B FW3-A FW3-B BW3-A BW3-B MP-AQ (đối chứng A) K1 (Đối chứng B) K2 K3 STT 10 11 12 13 13 14 15 Chú thích: Đệm pH  +  +  +  +  +  +     Độ muối 0,1% 0,1% 1,5% 1,5% 0,1% 0,1% 1,5% 1,5% 0,1% 0,1% 1,5% 1,5%  0 Thế hệ 1 1 2 2 3 3 pH sau lên men 3.5 – 4 – 4.5 3.5 – 4 – 4.5 3.5 3.5 4 4.5 3.5 4 4.5 5 (+): có bổ sung 10 mM NaHCO3 làm đệm pH môi trường lên men (): không bổ sung đệm pH Hình Các phươn án lên men chế phẩm MP – AQ sau ngày 28 C Trong phương án lên men, vi sinh vật phát triển nhanh, bắt đầu tạo sinh khối bọt khí sau ngày lên men (hình 1) Kết phân tích cho thấy phương án lên men có bổ sung đệm pH có giá trị pH sản phẩm sau lên men cao phương án không bổ sung đệm, nhiên khác biệt không đáng kể Do phân tích tiến hành phương án lên men khơng có đệm pH 3.2 Phân tích VSV tính ổn định thành phần lồi chế phẩm Thành phần VSV chế phẩm MP – AQ qua hệ lên men xác định phương pháp nhân gen điện di biến tính gel polyacrylamid (PCR-DGGE) (hình 2) Lactobacillus plantarum Hình Gel điện di biến tính phân tích thành phần vi khuẩn sản phẩm lên men chế phẩm MP – AQ Thứ tự giếng tra mẫu gel sau: – MP-AQ gốc; – K1; – BW1-A; – K2; – BW2-A; – K3; – BW3-A Kết phân tích cho thấy nhóm vi khuẩn quan trọng mẫu gốc ban đầu lactobacillus plantarum trì qua hệ lên men theo công thức BW (mẫu số 3, gel điện di), lên men theo cách thơng thường khơng trì (mẫu số 2, gel điện di) 3.3 Kiểm tra tác dụng chế phẩm nguồn nƣớc thải sinh hoạt ô nhiễm chất hữu Công thức xử lý nước thải sinh hoạt (lấy từ sông Tô lịch Hà nội) chế phẩm MP–AQ sau Thí nghiệm tiến hành bơ can thủy tinh thể tích lít Lượng nước thải đưa vào để xử lý bơ can lít Các phương án chế phẩm MP–AQ (qua chu trình lên men khác nhau) bổ sung vào nước ô nhiễm để xử lý nồng độ 50 ppm Đối chứng âm nước thải không bổ sung chế phẩm, đối chứng dương nước thải có bổ sung chế phẩm MP–AQ gốc Thay đổi số BOD thí nghiệm xử lý theo thời gian trình bày bảng Bảng STT Thay đổi BOD công thức xử lý chế phẩm MP – AQ sau ngày Tên mẫu Thay đổi màu sắc nƣớc xử lý BOD (mg/l) Nước thải ban đầu 300 Xám đục Đối chứng âm 150 Xám đục Đối chứng dương 15 Xanh rêu, trong, đáy có lớp cặn lắng đen FW1 – A 25 Xanh rêu, BW1 – A 15 Xanh rêu, FW2 – A 82 Xanh nhạt, đục BW2 – A 25 Xanh rêu, FW3 – A 70 Xám nhạt, đục BW3 – A 30 Xanh rêu, 10 K1 85 Xám nhạt, trắng đục nhẹ 11 K2 98 Xám nhạt, đục 12 K3 105 Xám nhạt, đục Kết phân tích BOD cho thấy phương pháp lên men bổ sung muối có hiệu xử lý tốt phương pháp lên men không bổ sung muối nước thải sinh hoạt có nhiễm hữu Tác dụng xử lý tương đối ổn định qua hệ lên men chế phẩm MP–AQ 3.4 Kiểm tra tác dụng chế phẩm đầm tôm qui mô nhỏ (2 tấn) Chế phẩm MP–AQ lên men hệ thử nghiệm qui mô nhỏ đầm tôm Minh Thành (Công ty đầu tư phát triển sản xuất Hạ long) Để đảm bảo khách quan, tác dụng chế phẩm đánh giá phịng kỹ thuật Cơng ty Kết phân tích ammonium cho thấy chế phẩm MP–AQ3 có hiệu tương đương với chế phẩm Công ty dùng có nguồn gốc từ nước ngồi (hình 3) Như chế phẩm MP–AQ3 có khả chấp nhận để thay chế phẩm ngoại nhập công ty ĐT&PTSX Hạ long sử dụng Ammonium (mg/l) Đối chứng Ngoại nhập MP-AQ3 0 Thời gian (ngày) Hình Tác dụng chế phẩm MP–AQ3 nồng độ ammonium đầm nuôi tôm IV KẾT LUẬN Đưa qui trình lên men đảm bảo ổn định thành phần loài vi sinh vật tác dụng chế phẩm, làm sở để phát triển sản xuất qui mô lớn Chế phẩm vi sinh sản xuất thử nghiệm theo qui trình lên men đề có tác dụng tốt môi trường ô nhiễm (giảm BOD) đầm ni tơm (giảm NH4+) có khả thay chế phẩm ngoại nhập dùng cho mục đích nuôi trồng thủy sản làm môi trường V TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ vi sinh vật hữu hiệu EM (effective microorganisms) Trung tâm phát triển công nghệ Việt-Nhật, 2004 James G Cappuccino and Natalie Sherman, 2002 Microbiology: A Laboratory Manual, 6th ed Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA Masachika Maeda Microbial Processes in Aquaculture 1999 Society for the Biological Creation and Enhancement of the Aquatic Environment (BIOCREATE), UK and Japan Michael T Madigan, John M Martinko & Jack Parker 1997 Brock Biology of microorganisms, 8th edition Prentice Hall International, Inc Muyzer G., E.C De Waal and A.G Uitterlinden, 1993 Profoling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA Appl Environ Microbiol 59: 695-700 10 Walter P Hammes and Christian Hertel The genera Lactobacillus and Carnobacterium Dworkin W., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H & Stackebrandt E (ed.) 2000 The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community Springer-Verlag, New York Widdel F and F Bak 1992 Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria, p 3352-3378 In A Balows, H.G.Trueper, M Dworkin, W H arder, and K.-H Schleifer (ed.), The Prokaryotes, 2nd ed., vol.1 Springer-Verlag, New York Hà nội, ngày tháng năm 2007 Giám đốc TT CNSH Chủ trì đề tài Đinh Thuý Hằng 11 ... qui trình sản xuất lên chế phẩm vi sinh MP – AQ dùng nuôi trồng thủy sản xử lý ô nhiễm môi trường thông qua vi? ??c đánh giá tính ổn định tập đoàn vi sinh vật chế phẩm hoạt tính chúng qua bước qui. .. vai trị nhà nghiên cứu lĩnh vực cơng nghệ sinh học, Trung tâm CNSH tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy sản qui mô nhỏ, làm sở tiến tới sản xuất qui mô lớn với giá...THÔNG TIN VỀ ĐỀ TÀI TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy sản làm môi trƣờng CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS Đinh Thúy Hằng, cán nghiên cứu thuộc Trung tâm CNSH, ĐHQGHN