Sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn

... 3.1 Biến động hoạt độ enzym catalaza mầm đậu tƣơng pha gây mặn pha phục hồi sau nhiễm mặn 3.1.1 Biến động hoạt độ enzym catalaza mầm đậu tương pha gây mặn Bảng Hoạt độ enzym catalaza pha gây mặn. .. động hoạt độ enzym peroxidaza mầm đậu tƣơng pha gây mặn pha phục hồi sau nhiễm mặn 3.2.1 Biến động hoạt độ enzym peroxidaza mầm đậu tương pha gây mặn Bảng Hoạt độ enzym peroxidaza pha gây mặn. .. catalaza pha gây mặn Hình 3.2 Sự biến động hoạt độ enzym catalaza pha phục hồi Hình 3.3 Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza pha gây mặn Hình 3.4 Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza pha phục hồi Hình

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ===***=== LÙ THỊ DUYÊN SỰ BIẾN ĐỘNG HOẠT ĐỘ CATALAZA, PEROXIDAZA Ở MẦM ĐẬU TƢƠNG DT84 TRONG PHA GÂY MẶN VÀ PHA PHỤC HỒI SAU NHIỄM MẶN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI - 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ===***=== LÙ THỊ DUYÊN SỰ BIẾN ĐỘNG HOẠT ĐỘ CATALAZA, PEROXIDAZA Ở MẦM ĐẬU TƢƠNG DT84 TRONG PHA GÂY MẶN VÀ PHA PHỤC HỒI SAU NHIỄM MẶN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS.TS. NGUYỄN VĂN MÃ HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới khoa Sinh- KTNN, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện đề tài này. Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc sự chỉ bảo, góp ý kiến của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em đƣợc hoàn thiện hơn. Xuân Hòa, ngày…tháng…năm Sinh viên Lù Thị Duyên LỜI CAM ĐOAN Tôi đã thực hiện đề tài: "Sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn”. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực, không trùng lặp với các tác giả khác. Xuân Hòa, ngày…tháng…năm Sinh viên Lù Thị Duyên DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ĐC: Đối chứng TN: Thí nghiệm GM: Gây mặn PH: Phục hồi NXB: Nhà xuất bản CAT: Catalaza POD: Peroxidaza DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn Bảng 2: Hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi Bảng 3: Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn Bảng 4: Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi Bảng 5: Tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tƣơng Bảng 6: Chiều dài mầm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn Hình 3.2. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn Hình 3.4. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi Hình 3.5. Ảnh hƣởng của mặn đến tỷ lệ nảy mầm Hình 3.6. Ảnh hƣởng của mặn đến sự sinh trƣởng của mầm MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................Error! Bookmark not defined. 1. Lý do chọn đề tài ................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................... 3 3. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................... 3 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................. 3 NỘI DUNG ................................................................................................ 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................... 4 1.1. Sự nảy mầm và đặc điểm sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng. ................. 4 1.2.Tác hại của mặn đối với thực vật. ....................................................... 5 1.3. Vai trò của catalaza và peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật. ...... 7 1.3.1. Vai trò của enzym catalaza .......................................................... 7 1.3.2. Vai trò của enzym peroxidaza ...................................................... 7 1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của catalaza và peroxidaza đối với thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. ....................................................... 8 1.4.1. Trên thế giới. ............................................................................. 8 1.4.2. Ở Việt Nam ................................................................................. 9 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 11 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu...................................................................... 11 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. ................................................................ 11 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................. 11 2.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ........................... 12 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu. ........................................................ 16 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................... 17 3.1. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. ..................................................... 17 3.1.1. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương trong pha gây mặn. .................................................................................................. 17 3.1.2. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương trong pha phục hồi sau nhiễm mặn. .................................................................... 19 3.2. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. ..................................................... 20 3.2.1. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương trong pha gây mặn. ............................................................................................ 20 3.2.2. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương trong pha phục hồi sau nhiễm mặn. .................................................................... 21 3.3. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. ............................................... 22 3.3.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương. ...................................... 22 3.3.2. Sự sinh trưởng chiều dài mầm đậu tương ................................... 24 KẾT LUẬN.............................................................................................. 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 28 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây đậu tƣơng (Glicine max L.Merrill) là loài cây họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ Châu Á và đƣợc trồng cách đây 5000 năm. Các phân tích hóa sinh cho thấy rằng hạt đậu tƣơng chứa từ 38-40% protein. Hơn nữa đậu tƣơng còn chứa đầy đủ và cân đối những axit amin cần thiết (trong đó có những axit amin không thay thế nhƣ lyzin, tryptophan) và nhiều loại vitamin B1, B2, A, C, D, E, K. Trong đậu tƣơng cũng chứa 12-25% lipit, 10-15% gluxit, các muối khoáng Ca, Mg, Fe, P, K, Na, S; các enzym, sáp, nhựa, có giá trị dinh dƣỡng cao, có tác dụng tốt với sức khỏe con ngƣời. Đậu tƣơng là loài cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, khó có thể tìm thấy loại cây nào có tác dụng nhiều mặt nhƣ cây đậu tƣơng. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho các ngành sản xuất công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm. Hạt đậu tƣơng là sự kết hợp độc đáo các đặc tính làm cho chúng trở thành loại thực phẩm đa năng nhất trong các loại thực phẩm. Sản phẩm hạt đậu tƣơng đƣợc sử dụng trực tiếp dạng hạt thô hay dùng để chế biến các sản phẩm khác nhƣ: sữa đậu nành, bánh kẹo, đậu phụ. Ngoài ra đậu tƣơng còn đƣợc dùng trong sản xuất dƣợc liệu với nhiều vị thuốc có giá trị ở nƣớc ta. Cùng với sự ấm dần lên của Trái Đất, cây trồng cũng phải thích nghi với điều kiện môi trƣờng. Cây trồng có sức chống chịu tốt mới có thể tồn tại và nâng cao năng suất. Để nâng cao năng suất của cây đậu tƣơng một trong các biện pháp là làm tăng khả năng chống chịu của chúng với điều kiện ngoại cảnh bằng cách cải tiến kĩ thuật, chọn giống mới hoặc lựa chọn những nơi có điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Ở nƣớc ta diện tích đất mặn tƣơng đối lớn, xấp xỉ 2 triệu hecta, chiếm gần 6% tổng diện tích đất tự nhiên. Mặn ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng. Mặn ảnh hƣởng đến một số nhân tố hạn chế sinh 1 trƣởng nhƣ: nƣớc , cytokinin, phosphate…, ảnh hƣởng đến sự vận chuyển vật chất trong cây. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của muối đối với thực vật để tìm ra loại cây trồng phù hợp cho vùng đất nhiễm mặn là một yêu cầu cấp thiết. Những nghiên cứu về khả năng chịu mặn đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới với nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có đậu tƣơng. Ngày nay, các nghiên cứu về khả năng chịu mặn của cây trồng nói chung, của đậu tƣơng nói riêng ngày càng đƣợc mở rộng vì tính ứng dụng cao của cây trồng họ Đậu. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật các nhà khoa học có điều kiện để tìm hiểu về cơ chế sinh lý, sinh hóa chịu mặn ở thực vật nhƣ: Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã[16], Trần Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải[10]; Bates L.S. (1973)[19]; Naylor A.W(1996)[21]; Gerelet J và cộng sự (2005)[26] …, nghiên cứu về tình hình chịu hạn, chịu mặn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì, đậu tƣơng và thực vật nói chung. Nghiên cứu sự biến động của các enzym chống oxi hóa trong mầm đậu tƣơng khi nhiễm mặn để thấy đƣợc sự hoạt động và vai trò của chúng đối với quá trình nảy mầm của hạt đậu tƣơng dƣới điều kiện stress. Hiện nay, ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới đã có những nghiên cứu về enzym chống oxi hóa, tuy nhiên chƣa có các công trình nghiên cứu về động thái hoạt độ của chúng ở 2 pha gây mặn và phục hồi đối với đậu tƣơng, nhất là đối với giống DT 84; một giống có tiềm năng năng suất cao đang đƣợc gieo trồng rộng rãi ở nƣớc ta. Cây ở những giai đoạn khác nhau cũng có những phản ứng khác nhau với nồng độ muối, đặc biệt giai đoạn nảy mầm rất mẫn cảm với nồng độ muối. Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của thực vật nói chung và của đậu tƣơng nói riêng. Những biến đổi của giai đoạn này sẽ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây về sau. Xuất phát từ các nội dung nêu trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây m ặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn”. 2 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sự biến động hoạt độ catalaza và peroxidaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Động thái hoạt độ enzym catalaza, peroxidaza trong 2 pha sinh trƣởng của đậu tƣơng (pha gây mặn và pha phục hồi ). - Xác định một số chỉ tiêu sinh trƣởng nhƣ: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài mầm ở pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tƣợng: Giống đậu tƣơng DT84 Phạm vi nghiên cứu: giai đoạn nảy mầm của đậu tƣơng. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Bổ sung nguồn tƣ liệu về ảnh hƣởng của muối tới quá trình nảy mầm đậu tƣơng và vai trò của enzym chống oxy hóa trong quá trình này. - Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm các thông tin, các dữ liệu khoa học làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sự nảy mầm và đặc điểm sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng. Nảy mầm là giai đoạn quan trọng trong chu trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. Giai đoạn nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa nên ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng của cây sau này. Khả năng nảy mầm của hạt giống là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tiêu chuẩn một giống tốt. Giống có sức nảy mầm khỏe , tỷ kệ nảy mầm cao, tập trung là giống tốt. Đối với các loại cây trồng nói chung và cây đậu tƣơng nói riêng, nảy mầm là giai đoạn khởi đầu của quá trình sinh trƣởng. Thời kì mọc mầm đƣợc tính từ khi gieo hạt đến khi xuất hiện mầm trên mặt đất. Tỷ lệ mọc mầm cao hay thấp, thời gian mọc mầm nhanh hay chậm đều liên quan tới tốc độ sinh trƣởng của giống và sự đồng đều của các giống cây trong quần thể. Giai đoạn nảy mầm của cây đậu tƣơng thƣờng kéo dài 5-7 ngày, thời gian nảy mầm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là nhiệt độ và độ ẩm. Nhiêt độ thích hợp để đậu tƣơng nảy mầm là 26280C, trên 300C hạt nảy mầm nhanh nhƣng mầm yếu. Phạm vi nhiệt độ tối thiểu và tối đa thời kì mọc mầm là 100C-400C. Trên 400C hạt không nảy mầm đƣợc và dƣới 100C sự vƣơn dài của trục dƣới lá mầm bị ảnh hƣởng đáng kể. Điều kiện nhệt độ cao có thể rút ngắn quá trình sinh trƣởng sinh dƣỡng (Ball RA và các cs 2000 [18], Board J.E và cs, 1996 [22]). Độ ẩm không khí khoảng 81-85%. Đậu tƣơng thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các đặc trƣng của cây hai lá mầm, cũng gồm các pha nhƣ sự nảy mầm của cây hai lá 4 mầm, đó là: pha trƣơng hạt, pha hình thành và hoạt hóa enzim, pha tích lũy chất dinh dƣỡng, pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc biệt cho cơ thể. Sự nảy mầm của đậu tƣơng cũng bắt đầu bằng sự hấp thụ nƣớc nhờ cơ chế hút nƣớc của hạt làm hạt trƣơng lên, rễ mọc ra, thân vƣơn lên đội hai lá mầm lên khỏi mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân chính. Trong giai đoạn này, cây non sống chủ yếu vào nguồn chất dinh dƣỡng dự trữ ở trong hai lá mầm, đến khi hết chất dinh dƣỡng các lá mầm này chuyển sang màu vàng rồi rụng và đồng thời cũng là lúc mà bộ rễ phát triển đủ để có khả năng hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng từ trong đất lên để nuôi cây. Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Nếu gieo vào vụ hè, giai đoạn này ngắn hơn vụ đông. Thông thƣờng thời gian này khoảng 15-20 ngày sau khi gieo. Thời kì này sẽ quyết định mật độ cây non cũng nhƣ sức sinh trƣởng của cây đậu tƣơng sau này. 1.2.Tác hại của mặn đối với thực vật. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao, đặc biệt là NaCl, điều đó đã hạn chế khả năng hút nƣớc và chất dinh dƣỡng của cây. Đất bị nhiễm mặn sẽ gây nên hai tác hại đối với thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. Tác hại thứ nhất, mặn gây ra hiện tƣợng hạn sinh lý. Đất nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao nên áp suất thẩm thấu môi trƣờng lớn. Nếu áp suất thẩm thấu nội bào không thắng nổi áp suất môi trƣờng thì cây sẽ bị khô héo do nƣớc từ trong tế bào ra ngoài. Thiếu nƣớc nhẹ làm giảm tốc độ sinh trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất nguyên sinh làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi bị khô kiệt nƣớc nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và chết. 5 Tác hại thứ hai liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng cao các ion đặc biệt là Na + và Cl-, ngoài ra còn có các ion khác: SO 42-, HCO3-, Li+…hàm lƣợng cao các ion này đều gây hại cho sự sinh trƣởng và phát triển ở thực vật. Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây rối loạn trao đổi chất của tế bào. Các ion độc sẽ ức chế hoạt động các enzym, dẫn đến làm rối loạn hoạt động trao đổi chất-năng lƣợng, các hoạt động sinh lý bình thƣờng của tế bào. Các chất độc còn ảnh hƣởng theo chiều hƣớng bất lợi đến nguyên sinh chất nhƣ làm giảm độ nhớt, tính thấm của nguyên sinh chất tăng mạnh nhất là tăng ngoại thẩm làm cho tế bào mất chất dinh dƣỡng. Các hoạt động sinh lý của tế bào cũng bị ảnh hƣởng: qúa trình quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố ít do các chất độc ức chế quá trình tổng hợp sắc tố, các quá trình xảy ra trong quang hợp bị giảm sút do ảnh hƣởng của chất độc và thiếu nƣớc. Qúa trình hô hấp lúc đầu tăng mạnh, các cơ chất bị phân hủy mạnh nhƣng hiệu quả năng lƣợng thấp, phần lớn năng lƣợng của các quá trình phân hủy đều thải ra dƣới dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu ATP. Qúa trình phân hủy mạnh, tổng hợp lại yếu nên không đủ bù lƣợng vật chất do phân hủy, chất dự trữ dần hao hụt, cây không sinh trƣởng đƣợc dẫn đến còi cọc, năng suất thấp. Nếu cây bị mặn nặng hoặc mặn kéo dài sẽ dẫn đến chết. Về khả năng chịu mặn của thực vật trƣớc hết phải nói đến cơ chế tích lũy và duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sự cạnh tranh nƣớc với môi trƣờng nhiễm muối và chống lại hiện tƣợng hạn sinh lý. Hàm lƣợng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thƣờng xuyên trên đất phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na +, Cl- cao hơn nhiều, đồng thời phải có những thay đổi về hoạt động sinh lý nhƣ: hô hấp, quang hợp, thoát hơi nƣớc của lá để phù hợp với điều kiện thiếu nƣớc của cây. Đồng thời với quá trình biến đổi sinh lý, cây cũng có những biến đổi sinh hóa cụ thể nhƣ khi gặp môi trƣờng mặn, trong cây lập tức tổng hợp các chất 6 hữu cơ để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu của chính mình. Các chất tích lũy chủ yếu là các axit hữu cơ, axit amin, các đƣờng. Ngoài ra, các hợp chất proline, betaine, putressin cũng đƣợc hình thành khi bị mặn. 1.3. Vai trò của catalaza và peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật. 1.3.1. Vai trò của enzym catalaza Catalaza là enzym chủ yếu loại bỏ H2O2 đƣợc tạo ra nhiều trong peroxisom bởi quá trình quang hô hấp. Hoạt động của enzym này giảm xuống khi bị ức chế, chẳng hạn khi nồng độ CO 2 cao. Catalaza thực vật đƣợc mã hóa bởi một họ gen nhỏ, thƣờng gồm 3 gen isozym, có mô hình biểu hiện rất khác nhau về không gian cũng nhƣ thời gian trong suốt đời sống của thực vật. Khi thực vật bị stress nƣớc, ở mức độ nội bào sẽ tạo ra oxi gây hại chẳng hạn nhƣ gốc supeoxit (O 2.-), H2O2 và gốc .OH tự do, đây là nguyên nhân gây hƣ hại cho màng sinh chất. Và một trong những cơ chế giải độc của thực vật đó là hệ thống enzym chống oxi hóa: superoxit dismustaza chuyển gốc supeoxit thành O 2 và H2O2, sau đó H2O2 đƣợc giải độc nhờ enzym catalaza và ascorbat peroxidaza. CAT đƣợc tìm thấy trong peroxisome, bào tƣơng và ty thể, kết hợp hoạt động của catalaza và superoxide dismutaza là rất quan trọng trong giảm nhẹ tác động của stress oxy hóa. 1.3.2. Vai trò của enzym peroxidaza Peroxidaza có rất nhiều dạng trong thực vật. Khi cây bị stress thì hoạt độ peroxidaza tăng lên. Peroxidaza đƣợc coi nhƣ một thông số sàng lọc với các stress sinh lý khác nhau. Hoạt động của enzym này tăng khi cây bị cảm ứng với lạnh, hạn, muối và thiếu oxi. Hoạt động của enzym này cũng đƣợc dùng nhƣ là chỉ thị cho các kiểu ô nhiễm khác nhau. 7 1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của catalaza và peroxidaza đối với thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng. 1.4.1. Trên thế giới. Nghiên cứu về tính chịu mặn của thực vật có ý nghĩa không những về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn bởi lẽ nƣớc biển và đại dƣơng chứa 3-4% muối. Biển và đại dƣơng chiếm khoảng 75% bề mặt hành tinh chúng ta, 25% mặt đất bị nhiễm mặn, còn 1/3 đất canh tác đƣợc tƣới nƣớc trên toàn thế giới tích tụ muối do kém tiêu nƣớc. Ảnh hƣởng độc hại của nồng độ cao các muối có thể xuất hiện kể cả khi bón phân với liều lƣợng cao. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của muối đối với thực vật để tìm ra loại cây trồng phù hợp cho vùng đất nhiễm mặn là một yêu cầu cấp thiết. Những nghiên cứu về khả năng chịu mặn đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới với nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có đậu tƣơng. Những nghiên cứu về tác động của muối lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng nhƣ lúa mạch, tế bào cam nuôi cấy, về trao đổi ion ở lúa cho thấy cây trồng có khả năng thích ứng trong một giới hạn nhất định với các tác động của muối trong môi trƣờng đất, nƣớc. Tuy nhiên mức độ đó phụ thuộc vào loại cây trồng nghiên cứu. Trên thế giới đã có khá nhiều những nghiên cứu về hoạt tính catalaza và peroxidaza ở thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng nhƣ: Chkhubianishvili và cs, nghiên cứu hoạt tính peroxidaza, catalaza và hàm lƣợng protein tổng số trong lá một số cây thân thảo vùng núi cao Caucasus[24]; Almeselmani và cs đã nghiên cứu vai trò bảo vệ của các enzym chống oxy hóa dƣới stress nhiệt độ cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ catalaza (CAT), superoxide dismutaza (SOD), ascorbate peroxidaza (APX) tăng dƣới stress nhiệt độ cao, tuy nhiên glutathione reductase (GR) và peroxidaza (POD) hoạt động giảm so với cây trồng bình thƣờng [27]; Poodeetip và cs, hydrogen peroxide và hoạt độ peroxidaza nhƣ chỉ thị tiềm 8 năng về khả năng thích ứng của cây trong điều kiện stress mặn[29]; ( Glycine max L.), những thay đổi trong các enzym chống oxy hóa và khả năng chống chịu stress mặn và kẽm ứng dụng trong đậu tƣơng; Çelik và cs, nghiên cứu về ảnh hƣởng của từ trƣờng đến hoạt độ của superoxide dismutaza và catalaza trong Glycine max (L.) Merr [23] … Nhiều nghiên cứu đã gợi ý rằng SOD, POD, và CAT tăng lên đáng kể ở một số thực vật khi chịu mặn (Gao et al.,2008[25]; Azooz et al., 2009[17] ). Những phát hiện này gợi ý rằng một hệ thống enzym chống oxy hóa hiệu quả trong các loài thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiệt hại oxy hóa do căng thẳng muối. Báo cáo trƣớc đó cho rằng cây bảo vệ khỏi bị hƣ hại oxy hóa do muối căng thẳng bằng cách tăng SOD, POD và CAT ở Jatropha curcas, ngô và các loài thực vật khác (Parvaiz và Satyawati, 2008[28]; Gao et al, 2008. Azooz et al., 2009)[31]. Những kết quả này gợi ý rằng stress muối có thể dẫn đến thay đổi đáng kể trong SOD, POD và CAT các hoạt động tham gia vào quá trình loại bỏ ROS[31]. 1.4.2. Ở Việt Nam Các nghiên cứu về đậu tƣơng trong những năm qua chủ yếu đi sâu về phƣơng diện hình thái, di truyền, chọn giống, sinh học phân tử, một số nghiên cứu về sinh lý học, khả năng cộng sinh cố định đạm của một số dòng vi khuẩn ở đậu tƣơng. Những năm gần đây nhờ sự trợ giúp của các thiết bị hiện đại, nhiều nghiên cứu sâu hơn về tính chịu mặn đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng ở Việt Nam đƣợc tiến hành sâu rộng ở các đối tƣợng lúa, đậu tƣơng, lạc, thuốc lá, nhãn…trong đó đậu tƣơng là cây trồng đƣợc chú trọng khá nhiều. Chẳng hạn nhƣ nghiên cứu đặc điểm di truyền và khả năng chịu hạn ở đậu tƣơng ( Nguyễn Huy Hoàng) [5], nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn với thành phần điện di của protein đậu tƣơng (Trần Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải)[10], sự biến đổi hoạt độ enzym protein, 9 amilaza và hàm lƣợng prolin của đậu tƣơng khi gặp hạn ở thời kì ra hoa ( Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã)[16], khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng (Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Văn Đính, Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, Nguyễn Thị Hồng Thắm (1999)[12]…Các kết quả nghiên cứu đã đƣợc ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo đƣợc nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác ở Việt Nam. Đã có những nghiên cứu về sự biến đổi hàm lƣợng catalaza và peroxidaza ở lá muồng trâu, cây nha đam, cây chè xanh, cây cà chua, lúa…[4], [6], [7], [8], [9], [13], Ngô Thành Trí và cs nghiên cứu về diễn biến hoạt tính của catalaza và peroxidaza trong kích thích kháng bệnh lƣu dẫn của clorua đồng, acibenzolar-s-metyl và nấm colletotrichumsp đối với bệnh đạo ôn lúa (Pyriculariagrisen)[15]. Theo nghiên cứu của Võ Minh Thứ (1999), về khả năng chịu mặn của cây lúa cho thấy những giống lúa chịu mặn khi bị xử lí NaCl hoặc KClO 3 thì có hiện tƣợng gia tăng nhiều chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh: khả năng hút nƣớc, hàm lƣợng nƣớc, hàm lƣợng nito, axit hữu cơ, diệp lục, hoạt tính catalaza, peroxidaza, amilaza. Ở đậu tƣơng cũng đã có một số nghiên cứu về 2 enzym này nhƣ: Nguyễn Văn Mã[11], Phạm Thị Trân Châu[1], Mai Văn Chung và cs nghiên cứu về phản ứng siêu nhạy cảm ở rễ cây đậu tƣơng Nam Đàn đối với chì[3] và về các gốc oxy tự do trong phản ứng bảo vệ của cây đậu đối với rệp hại [2]; Vũ Thanh Trà, nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tƣơng có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau[14]. 10 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Giống đậu tƣơng DT 84, là giống đậu tƣơng đƣợc chọn tạo bằng phƣơng pháp xử lý đột biến dòng 8-33 (DT80 x ĐH4) bằng tia Gamacol 18Kr, áp dụng chọn lọc 3 hoặc 1 hạt đến M8 thì chọn đƣợc DT 84 ổn định. Đây là giống ngắn ngày, thích ứng rộng có nhiều tiềm năng. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, tiến hành gieo hạt trong dung dịch muối theo phƣơng pháp của Volcova có cải tiến. Chọn hạt giống đều, chắc, không bị sâu bệnh. Khử trùng khay bình, dụng cụ… bằng cồn. Giâý lọc đƣợc sấy ở 1300 trong vòng 1 giờ, hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch KMnO 4 5% trong 5 phút. Dung dịch NaCl chọn 3 nồng độ để đạt tỷ lệ nảy mầm 60-70% Khay cho hạt nảy mầm, giấy thấm, nƣớc cất… Hạt giống có khả năng nảy mầm cao. Cách tiến hành: Chọn hạt khỏe cho vào túi vải màn rồi xử lý bằng dung dịch KMnO 4 5% trong 5 phút làm khô nhẹ rồi đặt vào khay. Trƣớc đó khay đƣợc khử trùng bằng cách sấy khô 1050 trong vòng 1 giờ cùng với giấy thấm. Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần: Phần 1: Lô đối chứng cho hạt nảy mầm trong nƣớc cất. Phần 2: Lô thí nghiệm cho hạt nảy mầm trong dung dịch muối với các nồng độ 0,4; 0,6; 0,8 (%) và đặt tên tƣơng ứng là các mẫu thí nghiệm M0,4; M0,6; M0,8. Chúng tôi tiến hành chọn 3 nồng độ muối này để nghiên cứu là 11 do chúng nằm trong khoảng nảy mầm tƣơng đối tốt ( khoảng 60-70%). Đồng thời ở các nồng độ này thấy rõ ảnh hƣởng của mặn đến các chỉ tiêu cần nghiên cứu. Hạt nảy mầm trong dung dịch muối NaCl và trong nƣớc cất phải thƣờng xuyên bổ sung lƣợng nƣớc hoặc lƣợng dung dịch muối với các nồng độ tƣơng ứng ở các lô nhƣ nhau. Đƣa các khay có hạt vào buồng sinh trƣởng ở nhiệt độ 26-280C. Đo kết quả từ ngày thứ 2 sau gieo, mỗi ngày đo 1 lần, liên tiếp trong 3 ngày. Chú ý đo vào một thời điểm nhất định. Quy ƣớc 3 ngày đo trong pha gây mặn lần lƣợt là: GM1, GM2, GM3. Sau đó lô TN rửa bằng nƣớc cất rồi đƣa vào nảy mầm trong nƣớc cất và đo các chỉ tiêu đó trong 3 ngày liền. Quy ƣớc 3 ngày đo trong pha phục hồi là: PH1, PH2, PH3. 2.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 2.2.2.1. Xác định tỷ lệ nảy mầm Tỷ lệ nảy mầm đƣợc xác định theo phƣơng pháp volcova(1984)[30]. Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm cho đến khi không còn có thêm hạt nào nảy mầm mới. Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều dài rễ mầm đạt 3mm trở lên. Tỷ lệ nảy mầm (N) trong dung dịch muối NaCl đƣợc tính theo công thức: a N= .100% b Trong đó: N: Tỷ lệ nảy mầm của hạt a: Số hạt nảy mầm trong lô thí nghiệm b: Số hạt nảy mầm trong lô đối chứng 12 2.2.2.2. Xác định chỉ tiêu sinh trƣởng của mầm Chiều dài mầm (mm): Sử dụng thƣớc đo chia đơn vị đến mm để đo chiều dài mầm vào 2 ngày cuối của pha gây mặn và pha phục hồi. 2.2.2.3. Xác định hoạt độ emzym catalaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ (theo Nguyễn Quang Vinh và cộng sự)[11]. * Nguyên tắc thí nghiệm: Catalaza xúc tác cho phản ứng: Catalaza 2H2O2 O2 + 2H2O Để định lƣợng catalaza có thể dùng KMnO 4 0,1N để xác định lƣợng H2O2 trƣớc và sau khi enzym tác dụng, từ đó tính lƣợng H2O2 bị chuyển hóa. 5H2O2 + 2KMnO4 3H2SO4, 8H2O 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 * Cách tiến hành: a, Pha hóa chất -Đệm photphat 50mM (pH7,0); (a) hòa tan 6,81g KH2PHO4 trong 1000ml nƣớc cất; (b) hòa tan 11,41g K2HPO4.3H2O trong 1000ml nƣớc cất; trộn dung dịch a với b cho đến khi đạt pH 7,0. -KMnO4 0,1N, H2SO4 10%, H2O2 0,1% trong đệm photphat 50mM (pH 7). b, Quy trình -Cân 200mg mầm, nghiền trong 10ml đệm photphat (pH 7,0) 50mM, sau đó ly tâm lạnh ở 17000g/15 phút/20C. -Lấy 2 bình nón dung tích 100ml: Bình thí nghiệm: Dung dịch H2O2 0,1%: 10ml Dịch chiết enzym: 10ml Giữ ở 300C trong 30 phút Axit H2SO4 10%: 5ml Chuẩn độ H2O2 dƣ thừa bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền. 13 Bình đối chứng: Dịch chiết enzym: 10ml Đun sôi cách thủy trong 5 phút để biến tính enzym, lấy ra để nguội. Dung dịch H2O2 0,1%: 10ml Giữ ở 300C trong 30 phút Axit H2SO4 10%: 5ml Chuẩn độ H2O2 dƣ thừa bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền. * Tính hoạt độ enzym: -Tính số mg H2O2 bị phân giải dƣới tác dụng của enzym có trong a (g) mẫu: X= Trong đó, A: số ml KMnO 4 0,1N dùng chuẩn độ H2O2 dƣ thừa trong bình đối chứng B: số ml KMnO4 0,1N dùng chuẩn độ H2O2 dƣ thừa trong bình thí nghiệm V1: số ml dịch chiết enzym từ mẫu (10ml) V2: số ml dịch chiết enzym dùng cho phản ứng (5ml) a: khối lƣợng (g) mẫu (200mg = 0,2g) Số đơn vị catalaza trong 1g mẫu (số µmol H2O2 bị phân giải trong 1 phút): C(U/mg) = Trong đó, 30: thời gian enzym tác dụng; 0,034:1 µmol đƣơng lƣợng H2O2 2.2.2.4. Xác định hoạt độ enzym peroxidaza bằng phƣơng pháp so màu dùng pyrogallol làm cơ chất[20]. * Hóa chất. -NaOH, H2O2, KH2PO4, pyrogallol. 14 * Pha hóa chất. -NaOH 2M: Cân 8g NaOH pha với 90ml nƣớc sau đó dâng nƣớc đến vạch 100ml (bảo quản ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tháng). -Đệm photphat (pH=6) 0,1M: Hòa 6,8g KH2PO4 vào 450ml nƣớc cất, sau đó thêm NaOH 2M để đạt pH=6 rồi dâng nƣớc đến vạch 500ml. -H2O2: Pha 0,66ml H2O2 30% với 5ml nƣớc cất (chuẩn bị mới mỗi ngày, cho vào bình tối). -Pyrogallol 5,33%: Hòa 1,333g pyrogallol trong 20ml nƣớc cất, sau đó dâng lên vạch 25ml (bảo quản lạnh trong lọ tối và pha mới mỗi ngày). * Cách tiến hành Nghiền mẫu với đệm pH 6 theo tỷ lệ 1 phần mẫu:5 phần đệm. Ly tâm dịch nghiền 10000 vòng ở 00C trong 15 phút. Tách lấy dịch chiết đo quang phổ ở bƣớc sóng 420nm. Thành phần các chất ở blank và ống thí nghiệm. Blank TN Đệm pH6 0,1M 2,5ml 2,4ml Pyrogallol 5,33% 0,3ml 0,3ml H2O2 0,2ml 0,2ml Dịch chiết enzym 0ml 0,1ml Tổng 3ml 3ml Đo kinetis ở bƣớc sóng 420nm trong khoảng 3 phút, 20s nghi lại 1 lần để tính toán. * Tính hoạt độ enzym U/ml=X =ΔE420/20s x 2,5 x df U/mg = X/mg mẫu. 15 5 df= = 50 0,1 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2003 theo các tham số : giá trị trung bình ( ), sai số trung bình (m), sai số của hiệu các trung bình số học (md), độ chính xác của thí nghiệm (m%), độ tin cậy của hai số trung bình (td) đƣợc tính theo các công thức sau : = m% = md = m= td = Trong đó: Xi: là giá trị đo đƣợc qua mỗi lần đo N: là số lần nhắc lại (trong đó : trung bình thí nghiệm, mẫu đối chứng, m2: sai số mẫu thí nghiệm). 16 : trung bình đối chứng, m1: sai số CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Khả năng chống oxy hóa của thực vật thể hiện qua hoạt tính của các enzym oxy hóa khử nhƣ catalaza, peroxidaza hoặc một số chất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhƣ vitamin C, glutation dạng khử (GSH), chỉ số peroxyd hóa lipit…Đây là những thành phần quan trọng giúp cơ thể thực vật khử các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất của cây. 3.1. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. 3.1.1. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương trong pha gây mặn. Bảng 1. Hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn Đơn vị (U/mg) GM1 Mẫu (X ±m) GM2 % So với ĐC (X ± m) GM3 % So với ĐC (X ± m ) % So với ĐC ĐC 5,76 ± 0,57 100 6,09 ± 0,43 100 7,76 ± 0,38 100 M0,4 8,31 ± 0,36 144,27 8,03 ± 0,50 131,86 8,53 ± 0,22 109,92 M0,6 8,49 ± 0,50 147,40 8,49 ± 0,36 139,41 11,98 ± 0,41 154,38 M0,8 10,32 ± 0,49 179,17 11,21 ± 0,30 184,07 13,48 ± 0,34 173,71 17 Hình 3.1. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn Kết quả bảng 1 cho thấy hoạt độ catalaza nhìn chung tăng dần theo thời gian, trong đó chủ yếu tăng rõ rệt ở ngày thứ 3, đặc biệt ở hai mẫu thí nghiệm M0,6 và M0,8, còn ở ngày 1 và 2 sự khác biệt thể hiện không rõ. Trong cùng một ngày hoạt độ catalaza tăng theo nồng độ muối. Ngày thứ nhất và ngày thứ 2 hoạt độ catalaza của các mẫu thí nghiệm M0,4, M0,6, M0,8 cao hơn so với đối chứng, còn ở ngày thứ 3 chỉ có 2 mẫu M0,6 và M0,8 cao hơn đối chứng. Điều đó cho thấy trong điều kiện stress mặn đã làm tăng hoạt độ catalaza, do mặn làm tăng hàm lƣợng các gốc tự do trong tế bào gây hại cho màng tế bào, làm giảm độ nhớt của nguyên sinh chất, giảm tính thấm của màng. Sự tăng hoạt độ catalaza tỷ lệ thuận với nồng độ muối. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả của nhiều nghiên cứu (Gao et al.,2008[25]; Azooz et al., 2009[17]), (Parvaiz và Satyawati[28], 2008). 18 3.1.2. Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương trong pha phục hồi sau nhiễm mặn. Bảng 2. Hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi Đơn vị (U/mg) PH1 Mẫu PH2 % So PH3 % % So với So (X ±m) với ĐC ( X ± m ) với ĐC ( X ± m ) ĐC 8,00 ± 0,25 100 7,88 ± 0,25 100 8,03 ± 0,27 100 106,50 8,65 ± 0,33 109,77 8,29 ± 0,28 103,63 M0,6 11,97 ± 0,22 149,63 11,95 ± 0,30 151,65 10,05 ± 0,22 125,16 M0,8 13,38 ± 0,34 167,25 12,82 ± 0,27 162,69 10,73 ± 0,27 133,62 ĐC M0,4 8,52 ± 0,14 16 Hàm lượng catalaza trong pha phục hồi 13,38 Hoạt độ catalaza(U/mg) 14 12 10,05 10 8 12,82 11,97 11,95 8,00 7,88 8,03 10,73 8,52 8,65 8,29 PH1 6 PH2 4 PH3 2 0 ĐC M0,4 M0,6 M0,8 Mẫu TN Hình 3.2. Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi. Trong pha phục hồi, ở lô đối chứng hoạt độ catalaza hầu nhƣ không biến động. Ở các lô thí nghiệm M0,6; M0,8 hoạt tính catalaza nhìn chung giảm dần, hoạt độ giảm rõ nhất ở ngày thứ 3 của pha phục hồi nhƣng vẫn luôn cao hơn so với đối chứng. Chứng tỏ ở nồng độ 0,6% và 0,8% mặn ảnh hƣởng lớn đến 19 đậu tƣơng DT84. Do vậy khi đã loại bỏ môi trƣờng mặn hạt hút nƣớc, sinh tổng hợp các chất và phục hồi nhƣng vẫn chƣa thể phục hồi nhƣ hạt sống trong điều kiện bình thƣờng. 3.2. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. 3.2.1. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương trong pha gây mặn. Bảng 3. Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn. Đơn vị (U/mg) GM1 Mẫu ĐC (X ±m) GM2 % So với ĐC 0,069 ± 0,002 100 (X ±m) GM3 % So với ĐC 0,081 ± 0,001 100 (X ±m) % So với ĐC 0,121 ± 0,003 100 0,174 ± 0,002 143,80 0,173 ± 0,002 213,58 0,184 ± 0,003 152,07 M0,8 0,124 ± 0,002 179,71 0,205 ± 0,001 253,09 0,252 ± 0,001 208,26 M0,4 0,091 ± 0,002 131,88 0,158 ± 0,001 195,06 M0,6 0,122± 0,003 176,81 Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn. 20 Qua bảng số liệu ta thấy hoạt độ peroxidaza tăng lên theo nồng độ muối và theo thời gian. Hoạt độ peroxidaza tăng nhanh cả ở 3 lô thí nghiệm và tăng nhanh từ ngày thứ 2, tăng gần nhƣ gấp đôi so với đối chứng. Tăng nhanh và mạnh nhất ở lô thí nghiệm có nồng độ 0,8%. Do khi nhiễm mặn hàm lƣợng H2O2 trong hạt tăng lên gây hại cho tế bào. Vì vậy tế bào tăng sản sinh enzym peroxidaza phân hủy H2O2, bảo vệ tế bào. Tốc độ tăng của POD so với đối chứng ở ngày thứ 2 là lớn nhất có thể do sự lipit hóa trong hạt lớn làm tăng hàm lƣợng các ion độc, dẫn đến sự tăng hoạt độ POD để bảo vệ tế bào. Ở ngày thứ 3 hoạt độ POD tiếp tục tăng nhƣng tốc độ tăng so với đối chứng nhỏ hơn ngày 2, có thể do trong hạt đã hình thành những cơ chế chống oxy hóa khác để bảo vệ tế bào. 3.2.2. Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương trong pha phục hồi sau nhiễm mặn. Bảng 4. Hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi. Đơn vị (U/mg) PH1 Mẫu ĐC PH2 % So (X ±m) với ĐC 0,134 ± 0,005 100 PH3 % So (X ± m) với ĐC % So (X ± m ) với ĐC 0,182 ± 0,003 100 0,183 ± 0,002 100 M0,4 0,178 ± 0,003 132,84 0,163 ± 0,003 89,56 0,162 ± 0,001 88,52 M0,6 0,180 ± 0,001 143,33 0,179 ± 0,004 98,35 0,175 ± 0,001 95,63 M0,8 0,249 ± 0,005 185,82 0,247 ± 0,001 135,71 0,242 ± 0,002 132,24 21 Hình 3.4. Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi. Trong pha phục hồi hoạt độ peroxidaza giảm nhƣng không rõ rệt. Ở ngày thứ 1, hoạt độ peroxidaza ở các lô thí nghiệm vẫn cao hơn ĐC do trong hạt vẫn còn nhiều gốc tự do còn lại ở pha gây mặn nên cây vẫn tăng cƣờng hoạt độ enzym này để bảo vệ chống oxy hóa cho tế bào. Ở ngày thứ 2 và 3, hoạt độ enzym ở hai lô thí nghiệm M0,4 và M0,6 thấp hơn đối chứng, nhƣng ở lô thí nghiệm M0,8 vẫn cao hơn so với đối chứng, chứng tỏ nồng độ muối 0,8% đã ảnh hƣởng lớn đến đậu tƣơng DT84. Kết quả thực nghiệm cho thấy: Hàm lƣợng enzym catalaza cao hơn nhiều so với enzym peroxidaza. Điều đó chứng tỏ enzym này có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây chống lại các tác dụng độc từ bên ngoài. 3.3. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn. 3.3.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương. Nảy mầm là chu trình sinh lý quan trọng trong chu trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật nói chung và của đậu tƣơng nói riêng, đảm bảo duy trì sự sống, tạo cơ sở đầu cho một cơ thể mới. Đây là một trong những giai đoạn 22 sinh trƣởng cây trồng nhạy cảm nhất với muối và ức chế nghiêm trọng với sự gia tăng độ mặn (Parvaiz và Satyawati, 2008)[28]. Chúng tôi tiến hành đếm số hạt nảy mầm từ ngày thứ 2 sau khi gieo, kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 5, hình 3.5. Bảng 5. Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tƣơng Đơn vị:(%) Mẫu GM 1 GM 2 GM 3 PH 1 PH 2 PH 3 ĐC 43,69 98,55 99,03 100 100 100 M0,4 37,12 72,41 85,66 91,67 96,48 96,48 M0,6 30,00 48,53 73,86 92,15 95,00 95,00 M0,8 7,21 45,09 70,35 90,00 91,67 91,67 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của mặn đến tỷ lệ nảy mầm 23 Khi nồng độ muối tăng từ 0,4% - 0,8% tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu giảm và luôn thấp hơn so với gieo hạt trong nƣớc cất. Hơn nữa tốc độ nảy mầm của hạt trong điều kiện mặn cũng không cao. Trong pha gây mặn hạt nảy mầm mạnh ở ngày thứ 3. Sang ngày thứ 6 các hạt chƣa nảy mầm có lớp dịch nhày bao quanh và bắt đầu có dấu hiệu hỏng. Khi nồng độ muối môi trƣờng càng cao khả năng hút nƣớc của tế bào càng giảm, để đảm bảo cho sự nảy mầm, tế bào phải tăng cƣờng tích lũy một số chất phản ứng chống lại điều kiện khắc nghiệt. Do đó bị thiếu hụt nhiều năng lƣợng làm giảm tốc độ và tỷ lệ nảy mầm của hạt. Ở pha phục hồi chúng tôi tiến hành rửa hạt dƣới dòng nƣớc chảy khoảng 5 phút đảm bảo rửa sạch muối trên bề mặt hạt đậu tƣơng. Sau khi phục hồi số hạt nảy mầm tăng lên rõ rệt đặc biệt ở 2 lô thí nghệm có nồng độ 0,6% và 0,8% tăng khoảng 20%, trong khi đó ở mẫu M0,4 chỉ tăng 6%. Điều này lại càng chứng tỏ mặn ảnh hƣởng rất lớn đến sự nảy mầm của hạt ở pha gây mặn trƣớc đó. Sang pha phục hồi, khi loại bỏ môi trƣờng mặn, hạt bắt đầu hút nƣớc mạnh tổng hợp các chất cho quá trình sinh trƣởng, do đó làm cho tốc độ và tỷ lệ nảy mầm của hạt tăng lên rõ rệt. 3.3.2. Sự sinh trưởng chiều dài mầm đậu tương Tiến hành đo chiều dài thân mầm vào 2 ngày cuối cùng của pha gây mặn và pha phục hồi. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 6, hình 3.6. 24 Bảng 6: Chiều dài mầm ĐV: (mm/mầm) Mẫu TN GM2 GM3 PH2 PH3 ĐC 18,00 ±1,00 43,00 ± 2,65 97,67 ± 2,52 119,67 ± 2,52 M0,4 9,33 ± 1,53 22,40 ± 1,00 54,33 ± 2,31 59,33 ± 0,58 M0,6 9,33 ± 1,15 12,35 ± 1,53 31,33 ± 1,53 40,00 ± 2,65 M0,8 3,00 ± 2,08 7,30 ± 2,08 21,00 ± 2,65 31,33 ± 1,53 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của mặn đến sự sinh trƣởng của mầm. Kết quả bảng 6 cho thấy: khi sinh trƣởng trong môi trƣờng mặn, chiều dài mầm giảm sút rõ rệt. Trong 3 nồng độ muối nghiên cứu, nồng độ 0,8% làm suy yếu nhiều nhất tới chiều dài mầm. Trong môi trƣờng mặn sự sinh trƣởng của mầm gặp nhiều khó khăn nên sự gia tăng chiều dài của mầm bị kìm hãm và sự kìm hãm này tỉ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ muối NaCl. Nồng độ muối càng cao thì sự sinh trƣởng của mầm càng chậm, do nồng độ muối cao kìm hãm quá trình hút nƣớc của hạt làm giảm khả năng sinh trƣởng 25 của mầm. Ở những nồng độ muối thấp sự ảnh hƣởng đến sinh trƣởng còn ít nên sự biểu hiện về tăng chiều dài mầm rõ. Khi phục hồi, chiều dài mầm tăng trở lại khá mạnh (tăng 2→3 lần) so với ngày hôm trƣớc, tuy nhiên vẫn nhỏ hơn rất nhiều so với đối chứng, đặc biệt ở 2 nồng độ 0,6 và 0,8% ( nhỏ hơn 3→4 lần). Tốc độ tăng cao thấy ở M0,8 tăng gấp 3 lần so với ngày hôm trƣớc gây mặn. Điều này chứng tỏ mặn ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng. Khi đã loại bỏ môi trƣờng gây mặn, hạt hút nƣớc mạnh sinh tổng hợp các chất, làm chiều dài mầm đậu tăng trƣởng mạnh. 26 KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: 1. Trong pha gây mặn hoạt độ catalaza nhìn chung tăng dần theo thời gian, hoạt độ enzym này tăng rõ rệt ở ngày thứ 3, ngày 1 và 2 tăng không rõ. Sang pha phục hồi ở mẫu M0,4 hoạt độ catalaza hầu nhƣ không biến động. Ở các mẫu M0,6; M0,8 hoạt độ catalaza lại giảm dần và giảm rõ nhất ở ngày thứ 3 của mẫu M0,8 nhƣng vẫn luôn cao hơn so với đối chứng. 2. Trong pha gây mặn hoạt độ peroxidaza tăng lên theo nồng độ muối và theo thời gian. Hoạt độ peroxidaza tăng nhanh từ ngày thứ 2, tăng nhanh và mạnh nhất ở lô thí nghiệm có nồng độ 0,8%. Khi phục hồi, hoạt độ POD giảm dần nhƣng thể hiện không rõ. Hoạt độ peroxidaza giảm thấp hơn so với đối chứng ở ngày 2 và ngày 3 của 2 lô thí nghiệm M0,4 và M0,6; còn ở lô thí nghiệm M0,8 thì vẫn lớn hơn so với đối chứng. 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO A-Tài liệu trong nƣớc 1. Phạm Thị Trân Châu (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1997), Thực hành sinh hóa học, NXB Giáo dục Hà Nội. 2. Mai Văn Chung (2014), Các gốc oxy tự do trong phản ứng bảo vệ của cây đậu đối với rệp hại, Tạp chí KH-CN Nghệ An, số 3. 3. Mai Văn Chung, Nguyễn Đức Diện, Nguyễn Đình San (2014), "Phản ứng siêu nhạy cảm ở rễ cây đậu tƣơng Nam Đàn đối với chì", Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 12, số 7: 1023-1028. 4. Đỗ Qúy Hai, Đỗ Tấn Thảo, Phan Văn Cƣ (2006), "Hoạt Tính chống oxy hóa của cây chè xanh ( Camellia sinensis O.Ktze)", Tạp chí khoa học đại học Huế. Số 33, 51-59. 5. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu và đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng nhập nội ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó Tiến sĩ, Hà Nội. 6. Hoàng Thị Kim Hồng, Võ Mai Hƣơng (2007), Biến động một số thành phần sinh lý-hóa sinh của cây nha (Aloe vera) theo thời gian sinh trƣởng, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2007, NXB KH&KT, 883-886. 7. Võ Thị Mai Hƣơng (2009), Thành phần hóa sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá muồng trâu, Tạp chí khoa học đại học Huế, số 52. 8. Võ Thị Mai Hƣơng, Trần Thanh Phong (2007), Nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của cây nha đam (Aloe vera), Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2007, NXB KH&KT, 883-886. 9. Nguyễn Nhƣ Khanh, Phùng Gia Tƣờng, so sánh sự chuyển hoá hóa sinh theo pha phát triển của quả một số giống cà chua trong vụ đông xuân tại Hà Nội. Báo cáo khoa học Trường ĐHSP Hà Nội. 28 10. Trần Thị Phƣơng Liên, Ngô Thu Huyền, Nguyễn Huy Hoàng, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Muội (1999), Hàm lƣợng protein, lipit và thành phần axit amin của một số giống đậu tƣơng chịu hạn, chịu nóng, Tạp chí sinh học số 2, tr. 17-20. 11. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, NXB Đại Học Quốc Gia, Hà Nội. 12. Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Văn Đính, Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, Nguyễn Thị Hồng Thắm (1999), Khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng, Thông báo khoa học của các trường đại học, tr. 35-38. 13. Võ Thị Kim Phƣơng (2003), Luận văn bƣớc đầu khảo sát ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng lên hoạt tính của enzim catalaza, peroxydaza và lên tính kích kháng lƣu dẫn chống bệnh cháy lá lúa do xử lý nấm eolletotrichum sp và acibenzolar-s-me. 14. Vũ Thanh Trà, Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tƣơng có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau, Luận án Tiến sĩ Sinh học. 15. Ngô Thành Trí, Trần Vũ Phến, Nguyễn Chí Cƣơng, Phạm Văn Kim (2003), Diễn biến hoạt tính của catalaza và peroxidaza trong kích thích kháng bệnh lƣu dẫn của clorua đồng, acibenzolar-s-metyl và nấm colletotrichumsp đối với bệnh đạo ôn lúa (Pyriculariagrisen), Kỷ yếu hội thảo quốc gia về bệnh cây và sinh học phân tử, NXB Nông nghiệp, tr. 116123. 16. Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã (2008), Sự biến đổi của hoạt độ enzym proteaza, amilaza, hàm lƣợng prolin của đậu tƣơng khi gặp hạn ở thời kì ra hoa, Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP Hà Nội 2, số 3, tr. 115-119. 29 B-Tài liệu nƣớc ngoài. 17. Azooz MM, Ismail AM. and Abou-Elhamd MF (2009), Growth, lipid peroxidation and antioxidant enzym activities as a selection criterion for the salt tolerance of three maize cultivars grown under salinity stress, international Journal of Agriculture and Biology 11: 21–26. 18. Ball R.A., Purcell L.C., Vories E.D (2000), Optimizing soybean plant population for a short-season system in the southem USA, Crop Science, (40), pp. 757-764. 19. Bates L.S. (1973), Rapid determination of free protein for water-stress studies, plant and soid, 39, pp. 205-207. 20. BBI Solutions, Blaenavon AP 132 Analytical procedures, peroxidase (pyrogallol procedure) Issue date; 1st May 2013. 21. Bernet N.M; Naylor A.W. (1996), Amino acid and protein metabolism in bermuda during water stress, plant physiologyl, 41. 1222-1230. 22. Board J.E., Harville B.G. (1996), Growth dynamics during the vegetative period affects yield of narrow-row, late-planted soybean, Agronomic Journal, (88), pp.567-572. 23. Çelik O., N. Buyukuslu, Ç. Atak, A. Rzakoulieva, Effects of Magnetic Field on Activity of Superoxide Dismutase and Catalase in Glycine max (L.) Merr. Roots. 24. Chkhubianishvili E., N. Kacharava, G. Badridze, S. Chanishvili, T. Kurdad (2011), Activity of peroxidase, catalase and content of total proteins in leaves of some herbaceous plants of high mountains of the Caucasus, plant physiology. 25.Gao S, Ouyang C, Wang S, Xu Y, Tang L. and Chen F. (2008), Effects of salt stress on growth, antioxidant enzyme and phenylalanine ammonialyase activities in Jatropha curcas L.seedlings, plant soil and environment 54:374–381. 30 26. Gerelet J, Abenamar, E Tyssirr, Mh Arelange-Macherel (2005), Indentification in pea seed mitochondrina of late embryogennesis abundant protein able to protect enzyme from during, plant physiologyl, 137: 157167. 27. Moaed A., P.S. Deshmukh, R.K. Sairam, S.R. Kushwaha (2006), T.P. Singh Protective role of antioxidant enzymes under high temperature stress, Division of Plant Physiology, Indian Agricultural Research Institute, New Delhi 110012, India, Plant Science 171. 382–388. 28. Parvaiz A. and Satyawati S. (2008), Salt stress and phyto-biochemical responses of plants – a review, plant soil and environment 54: 89–99. 29. Poodeetip N., K. Kong-Ngern, S. Homchuen, B. Toparkngam, V. Treloges (2012), Hydrogen peroxide and peroxidase activity as potential indicators on adaptability of plants to salinity stress condition. ijerd – international journal of environmental and rural development 3-1. 30. Volcova A.M (1984), Xác định khả năng chịu hạn, chịu nóng của các giống cây trồng bằng phƣơng pháp cho nảy mầm trong dung dịch saccarozo và xử lý nhiệt, NXB Leningrat (bản dịch từ tiếng Nga). 31. Xiao-dong Wang, Chao Ou-yang, Zhe-ren Fan, Shun Gao, Fang Chen Lin (2010), Effects of exogenous silicon on seed germination and antioxidant enzyme activities of Momordica charantia under salt stress, Journal of Animal & Plant Sciences. Vol. 6, Issue 3: 700- 708. 31 [...]... trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn 3 Nhiệm vụ nghiên cứu - Động thái hoạt độ enzym catalaza, peroxidaza trong 2 pha sinh trƣởng của đậu tƣơng (pha gây mặn và pha phục hồi ) - Xác định một số chỉ tiêu sinh trƣởng nhƣ: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài mầm ở pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tƣợng: Giống đậu tƣơng DT84 Phạm vi nghiên cứu: giai đoạn nảy mầm. .. chung và của đậu tƣơng nói riêng Những biến đổi của giai đoạn này sẽ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây về sau Xuất phát từ các nội dung nêu trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài: Sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza ở mầm đậu tương DT84 trong pha gây m ặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn 2 2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sự biến động hoạt độ catalaza và peroxidaza ở mầm đậu tƣơng trong. .. của pha phục hồi nhƣng vẫn luôn cao hơn so với đối chứng Chứng tỏ ở nồng độ 0,6% và 0,8% mặn ảnh hƣởng lớn đến 19 đậu tƣơng DT84 Do vậy khi đã loại bỏ môi trƣờng mặn hạt hút nƣớc, sinh tổng hợp các chất và phục hồi nhƣng vẫn chƣa thể phục hồi nhƣ hạt sống trong điều kiện bình thƣờng 3.2 Biến động hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn 3.2.1 Biến động hoạt. .. 21 Hình 3.4 Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha phục hồi Trong pha phục hồi hoạt độ peroxidaza giảm nhƣng không rõ rệt Ở ngày thứ 1, hoạt độ peroxidaza ở các lô thí nghiệm vẫn cao hơn ĐC do trong hạt vẫn còn nhiều gốc tự do còn lại ở pha gây mặn nên cây vẫn tăng cƣờng hoạt độ enzym này để bảo vệ chống oxy hóa cho tế bào Ở ngày thứ 2 và 3, hoạt độ enzym ở hai lô thí nghiệm M0,4 và M0,6 thấp... lần) Tốc độ tăng cao thấy ở M0,8 tăng gấp 3 lần so với ngày hôm trƣớc gây mặn Điều này chứng tỏ mặn ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng Khi đã loại bỏ môi trƣờng gây mặn, hạt hút nƣớc mạnh sinh tổng hợp các chất, làm chiều dài mầm đậu tăng trƣởng mạnh 26 KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu sự biến động hoạt độ catalaza, peroxidaza trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn chúng... kết luận nhƣ sau: 1 Trong pha gây mặn hoạt độ catalaza nhìn chung tăng dần theo thời gian, hoạt độ enzym này tăng rõ rệt ở ngày thứ 3, ngày 1 và 2 tăng không rõ Sang pha phục hồi ở mẫu M0,4 hoạt độ catalaza hầu nhƣ không biến động Ở các mẫu M0,6; M0,8 hoạt độ catalaza lại giảm dần và giảm rõ nhất ở ngày thứ 3 của mẫu M0,8 nhƣng vẫn luôn cao hơn so với đối chứng 2 Trong pha gây mặn hoạt độ peroxidaza. .. catalaza trong pha phục hồi 13,38 Hoạt độ catalaza(U/mg) 14 12 10,05 10 8 12,82 11,97 11,95 8,00 7,88 8,03 10,73 8,52 8,65 8,29 PH1 6 PH2 4 PH3 2 0 ĐC M0,4 M0,6 M0,8 Mẫu TN Hình 3.2 Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha phục hồi Trong pha phục hồi, ở lô đối chứng hoạt độ catalaza hầu nhƣ không biến động Ở các lô thí nghiệm M0,6; M0,8 hoạt tính catalaza nhìn chung giảm dần, hoạt độ giảm rõ nhất ở ngày... nhƣ catalaza, peroxidaza hoặc một số chất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhƣ vitamin C, glutation dạng khử (GSH), chỉ số peroxyd hóa lipit…Đây là những thành phần quan trọng giúp cơ thể thực vật khử các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất của cây 3.1 Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tƣơng trong pha gây mặn và pha phục hồi sau nhiễm mặn 3.1.1 Biến động hoạt độ enzym catalaza ở mầm. .. 176,81 Hình 3.3 Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza trong pha gây mặn 20 Qua bảng số liệu ta thấy hoạt độ peroxidaza tăng lên theo nồng độ muối và theo thời gian Hoạt độ peroxidaza tăng nhanh cả ở 3 lô thí nghiệm và tăng nhanh từ ngày thứ 2, tăng gần nhƣ gấp đôi so với đối chứng Tăng nhanh và mạnh nhất ở lô thí nghiệm có nồng độ 0,8% Do khi nhiễm mặn hàm lƣợng H2O2 trong hạt tăng lên gây hại cho tế... 0,34 173,71 17 Hình 3.1 Sự biến động hoạt độ enzym catalaza trong pha gây mặn Kết quả bảng 1 cho thấy hoạt độ catalaza nhìn chung tăng dần theo thời gian, trong đó chủ yếu tăng rõ rệt ở ngày thứ 3, đặc biệt ở hai mẫu thí nghiệm M0,6 và M0,8, còn ở ngày 1 và 2 sự khác biệt thể hiện không rõ Trong cùng một ngày hoạt độ catalaza tăng theo nồng độ muối Ngày thứ nhất và ngày thứ 2 hoạt độ catalaza của các mẫu