Xác định chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho (KC25) và giống nhận (BT7) QTL GEN quy định tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn giống lúa cao sản

Ưu điểm của việc sử dụng chỉ thị phân tử đã rút ngắn được thời gian chọn tạo giống, đánh giá được đa dạng di truyền, nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng khó, có thể loại được ảnh h

KHOA SINH - KTNN -

TRIỆU THỊ LAN

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐA HÌNH GIỮA GIỐNG CHO (KC25) VÀ GIỐNG NHẬN (BT7) QTL/GEN QUY ĐỊNH TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CAO SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Đăng Khánh (Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp) và các anh chị trong Bộ môn đã hướng dẫn chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Như Toản và các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian làm việc và thực hiện khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô phản biện, thầy cô là người đã giúp em nhận ra những hạn chế, sai sót cần khắc phục

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người đã giúp đỡ em, động viên em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Song do lần đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực tế cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy, cô và các bạn để bài khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày….tháng 05 năm 2015

Sinh viên

TRIỆU THỊ LAN

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan bài khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng em, kết quả nêu trong bài là trung thực và có cơ sở khoa học rõ ràng, không có sự sao chép hay bịa đặt

Sinh viên

TRIỆU THỊ LAN

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

BẢNG CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc và vai trò cây lúa 4

1.1.1 Nguồn gốc của cây lúa 4

1.1.2 Vai trò cây lúa 4

1.2 Giới thiệu về QTL và bản đồ QTL 4

1.2.1 Giới thiệu về QTL 4

1.2.2 Bản đồ QTL 5

1.3 Chỉ thị phân tử, tính ưu việt và ứng dụng 6

1.3.1 Khái niệm 6

1.3.2 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử 8

1.3.3 Ứng dụng của chỉ thị phân tử 8

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 9

1.4.1.1 Tình hình sản xuất, xuất khẩu lúa gạo trên thế giới 9

1.4.1.2 Nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.4.2.1 Tình hình sản xuất, xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam 12

1.4.2.2 Nghiên cứu về chỉ thị phân tử ở Việt Nam 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Giống (BT7) 15

2.1.1.1 Giới thiệu về lúa BT7 15

2.1.1.2 Đặc tính sinh học 15

2.1.2 Giống (KC25) 16

2.2 Mồi ADN 16

2.3 Nội dung 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 17

2.4.2 Phương pháp PCR với mồi thí nghiệm 19

2.4.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% 20

2.4.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính 21

2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Tách chiết và tinh sạch ADN 24

3.2 Khảo sát đa hình trên 12 NST giữa giống cho và nhận QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông 25

3.2.2 Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đa hình giữa giống BT7 và KC25 trên 12 nhiễm sắc thể 27

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Giống lúa BT7 16 Hình 3.1 Hình ảnh kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phương pháp

CTAB trên gel agarose 0,8% 24 Hình 3.2 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM31; RM148; RM296; RM287; RM247;

RM282 30 Hình 3.8 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM312; RM335; RM349; RM425; RM447;

RM449 30 Hình 3.9 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM333; RM493; RM494; RM526; RM527;

RM528 31 Hình 3.10 Một số hình ảnh sát đa hình với ADN giống cho và nhận gen

với chỉ thị RM22897; RM11504; RM19840; RM20019;

RM21539; RM 22870 31

Hình 3.11 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM11757; RM13155; RM18161; RM19545;

RM20848 32 Hình 3.12 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM21584; RM21645; RM22786; RM24865;

RM25022 32 Hình 3.13 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM11745; RM11799; RM11874; RM20163;

RM20192 33 Hình 3.14 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM11438; RM12769; RM13197; RM13332;

RM14795; RM14820 33 Hình 3.15 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM16589; RM16820; RM17391; RM17411;

RM19034 34 Hình 3.16 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM10741; RM10782; RM10806; RM10815;

RM10820 34 Hình 3.17 Một số hình ảnh khảo sát đa hình với ADN giống cho và nhận

gen với chỉ thị RM10115; RM10649; RM10681; RM10694A;

RM10694; RM10720 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi

SSR 19 Bảng 2.2 Chương trình chạy của phản ứng PCR 20 Bảng 3.1 Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống BT7 và KC25 28

BẢNG CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

tính trạng tăng số lƣợng hạt trên bông

chiều dài mảnh phân cắt giới hạn

đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên

chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc

đánh dấu

mảnh cắt giới hạn

giản

MAS : Marker Assisted Selection

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng

cho khoảng 2/3 dân số thế giới Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, thế giới có khoảng 156,1 triệu ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lượng là 697,9 triệu tấn, 90% diện tích này thuộc các nước châu Á với 651 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo thế giới [16]

Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo lớn đứng thứ hai hoặc thứ ba thế giới chỉ sau Thái Lan và Ấn Độ trong hơn một thập kỉ qua Với diện tích đất canh tác lúa năm 2013 chiếm khoảng 7,9 triệu ha, cung cấp 44,076 triệu tấn thóc, xuất khẩu 9,61 triệu tấn gạo (Tổng cục Thống kê, 2013) Thị trường xuất khẩu gạo chính của Việt Nam bao gồm các quốc gia Đông Nam Á (chiếm khoảng 40-50%), các quốc gia Châu Phi (chiếm khoảng 20-30%), ngoài ra còn có các thị trường khác như Trung Đông và Bắc Mỹ [10]

Tuy nhiên, nghề trồng lúa Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung đang đứng trước nhiều thách thức như diện tích trồng lúa giảm nhanh do quá trình

đô thị hóa, công nghiệp hóa và chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi biến đổi khí hậu làm năng suất lúa giảm đáng kể, cùng với áp lực dân số ngày càng tăng đòi hỏi nguồn cung cấp lương thực ngày càng lớn Vì vậy, chọn tạo giống lúa

có tiềm năng nâng cao năng suất là hết sức cần thiết, cấp bách đối với an ninh lương thực thế giới và nâng cao đời sống nông dân Trong khi đó, việc nâng cao năng suất lúa dựa vào quy trình phân bón và tưới tiêu đã tới hạn và con đường phát triển nguồn giống cho năng suất cao và chất lượng tốt nhờ vào cải tiến di truyền gần như là con đường duy nhất Đứng trước những thách thức

đó, các nhà khoa học đã và đang ứng dụng kỹ thuật và công nghệ tiên tiến để cải tạo, lựa chọn các giống mới, một trong số đó là sử dụng chỉ thị phân tử

ADN cho phân tích di truyền và những tính trạng nông học quan trọng, yếu tố cấu thành năng suất là một công cụ rất hiệu quả trong chọn giống lúa Ưu điểm của việc sử dụng chỉ thị phân tử đã rút ngắn được thời gian chọn tạo giống, đánh giá được đa dạng di truyền, nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng khó, có thể loại được ảnh hưởng của nhân tố môi trường trong quá trình chọn lọc Chỉ thị phân tử cũng cho phép nhà chọn giống lập bản đồ hay quy tụ chính xác những locut gen quy định tính trạng di truyền số lượng vào những giống thích hợp hơn Chính vì thế chỉ thị phân tử là phương pháp tiếp cận không thể thiếu được trong các nỗ lực chọn tạo giống, tạo ra nhiều giống cải tiến tốt hơn về mặt di truyền và hy vọng giống siêu năng suất sẽ sớm trở thành hiện thực Có nhiều yếu tố cấu thành năng suất lúa nhưng được quy bởi

3 yếu tố chính: Số bông/khóm, số hạt trắc/bông, khối lượng 1000 hạt Hơn nữa chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locut gen quy định tính trạng di truyền

số lượng (QTL) hay gen vào giống mới và là kỹ thuật hiệu quả so với phương pháp chọn giống truyền thống Bởi vì, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá thể trong quần thể, và có thể sử dụng một lượng lớn chỉ thị để kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ Từ đó có thể kiểm soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể Kiểm tra theo phương pháp đó kết hợp lai trở lại 2 đến 3 thế hệ là có thể thu được cá thể với nền di truyền của dòng mẹ và mang gen chuyển Các dòng này có thể cho tự thụ, thu hạt để làm thí nghiệm thử nghiêm trên đồng ruộng Bằng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC), các nhà chọn giống tại IRRI đã thành công mang lại kết quả trong việc tạo ra các giống lúa vừa có năng suất cao, vừa có khả năng chống chịu với các điều kiện phi sinh học bất lợi Những giống lúa cải tiến này được tạo ra bằng sự kết hợp

cả hai phương pháp chọn giống truyền thống và hiện đại Việc chọn giống lúa

siêu cao sản có thể thực hiện được sau khi locut điều khiển tính trạng tăng năng suất (QTL) được xác định Bằng việc sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại đã góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao

Với những lý do trên tôi xin thực hiện đề tài: “Xác định chỉ thị phân tử

đa hình giữa giống cho (KC25) và giống nhận (BT7) QTL/gen quy định tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định các chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho và nhận (KC25 và BT7) QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản

3 Ý nghĩa của đề tài

trên bông triển vọng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc và vai trò cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc của cây lúa

Cây lúa (Oryza Sativa L.) là lọai cây lương thực có lịch sử trồng trọt lâu

đời nhất (7.000 - 10.000) năm.Trung tâm khởi nguyên cây lúa là Trung Quốc

và Ấn Độ (Nam Á) Việt Nam và Nam Á là một trong các vùng trồng lúa cổ nhất Ở thế kỉ thứ I cây lúa được trồng ở Ai Cập, Italia, Tây Ban Nha Thế kỉ thứ

XV cây lúa được du nhập vào Bungari, Rumani, Sec… Cho đến thế kỉ XVII cây lúa được trồng ở Mỹ và phát triển sang nhiều nước trong khu vực… Hiện nay cây lúa là cây lương thực có diện tích canh tác lớn thứ 2 trong thế giới

1.1.2 Vai trò cây lúa

Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước

cổ xưa nhất thế giới Nông nghiệp trồng lúa nước vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước Dân số nước ta đến nay hơn 80 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm 70% lực lượng lao động cả nước Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân

1.2 Giới thiệu về QTL và bản đồ QTL

1.2.1 Giới thiệu về QTL

Di truyền tính trạng số lượng QTL (Quantitative trait loci) là sự định vị của gen có ảnh hưởng lên một tính trạng được đo lường trên một phạm vi số lượng

Dựa vào công thức sau:

P= µ + G + e = µ + a +d + i + e

QT: Tính trạng số lượng (tính trạng thể hiện sự phân bố chuẩn, liên

tục trong quần thể lớn và chưa qua chọn lọc nào)

kiểu hình, được đo lường thông qua độ lệch với giá trị trung bình quần thể)

[a], ảnh hưởng tương tác giữa hai alen trong cùng locut)

thể kết hợp ngẫu nhiên để tạo ra sự tăng, hoặc giảm kiểu gen nào

đó, do sự liên kết quá chặt hoặc yếu tố khác, so với trường hợp

nó không liên kết Mức độ sai lệch trong liên kết được xác định bằng mức độ liên kết, sự chọn lọc,vv…)[14]

1.2.2 Bản đồ QTL

Bản đồ QTL (quantitative trait loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (ví dụ như tính chống chịu mặn, chịu hạn…) Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những locut riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên NST và liên kết của nó với những gen khác Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm thể trong gen cây trồng sẽ cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng

di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên NST, và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác

Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng

của gen, và hoạt động của những locut bao gồm tương tác gen (epistasis) và tương tác QTL x E (môi trường) Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những marker mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào

đó, sao cho việc áp dụng MAS trở nên có hiệu qủa, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, v.v Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là nhân bản các gen điều khiển tính trạng số lượng

vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật “map-based cloning”

Nguyên tắc lập bản đồ QTL với marker phân tử ADN là phát hiện cho được những kết hợp giữa marker và tính trạng trên cơ sở liên kết gen, thông qua các phương pháp bố trí thí nghiệm và phương pháp phân tích thống kê chính xác Các phương pháp phân tích thống kê phải đáp ứng yêu cầu chính xác, đáng tin cậy, thông qua phân tích từng marker đơn, phân tích bản đồ cách quãng, và mô hình tuyến tính

1.3 Chỉ thị phân tử, tính ưu việt và ứng dụng

1.3.1 Khái niệm

Chỉ thị phân tử là một đặc điểm phân tử hay đặc điểm hóa học có khả năng định lượng và di truyền như nhân tố Mendel [5] Chỉ thị phân tử có thể hiểu đơn giản như các cột mốc nằm trên trình tự ADN trong hệ gen Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong quần thể Sinh vật

có khả năng nhân bản ADN của chúng với độ chính xác cao nhưng có nhiều

cơ chế xảy ra có thể làm biến đổi cấu trúc ADN, đơn giản như các cặp bazơ hay phức tạp như đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc mất đoạn Do đó chỉ thị phân

tử được xem là công cụ cực kì hiệu quả trong việc đánh giá tính đa dạng sinh học phục vụ cho công tác chọn tạo giống cây trồng

Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của các gen hay các trình

tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gen mong muốn,

sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình Điều này giúp công tác chọn tạo giống một cách chính xác, rút ngắn thời gian

và chi phí

Chỉ thị phân tử ADN rất phong phú do sự đa dạng của ADN, có tính ổn định và không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường cũng như giai đoạn phát triển của sinh vật

Một chỉ thị ADN lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong gen, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một chỉ thị phân tử nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện trên [1]

Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN hay chỉ thị RFLP (Restriction

Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)

- Các chỉ thị dựa trên kỹ thuật PCR:

+ Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN - Đa hình các đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên)

+ Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)

+ Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site - Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu)

+ Chỉ thị CAP (Cleaved Amplification Polymorphisms - Đa hình độ dài mảnh cắt giới hạn)

+ Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog - Vùng tương đồng gen kháng)

- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại:

+ Chỉ thị SSR (Simple sequence repeats - Lặp lại những trình tự đơn giản)

1.3.2 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen sinh vật sử dụng các chỉ thị phân tử được phát triển ma ̣nh mẽ Trên rất nhiều loại cây trồng người

ta đã thiết lập được bản đồ chi tiết về các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gen quy định các tính trạng nông sinh học khác nhau trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này Nhờ vào những ưu điểm của chỉ thị phân tử:

+ Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một đoạn ADN đánh dấu nào đó liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó

+ Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào, trong bất kỳ môi trường hay điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật

+ Loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của một locut hoặc giữa các locut khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng

+ Tăng được hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc, đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình

+ Giúp cho nhà chọn giống phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai

cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc cây tái tổ hợp, phân biệt được giữa các alen, các chủng sinh lý gây bệnh

1.3.3 Ứng dụng của chỉ thị phân tử

+ Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là lập bản đồ di truyền Bản đồ di truyền hiện đại được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP )

Trong quá trình giảm phân, các gen trên cùng NST thường được phân ly cùng nhau như một nhóm liên kết gen Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn

do kết quả của quá trình trao đổi chéo giữa các NST tương đồng Kết quả của hiện tượng này là sự tái tổ hợp giữa các gen trong một cặp NST Tần số trao đổi chéo giữa hai gen nào đó phản ánh khoảng cách tương đối giữa chúng Như vậy, bản đồ di truyền của NST biểu thị vị trí tương đối của các gen Sự liên kết của những gen nằm trên cùng một NST được trình bày thành một bản

đồ liên kết hay bản đồ NST thể hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên kết được coi là đơn

vị bản đồ, nó được xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ hợp, trong đó 1cM tương đương với 1% tái tổ hợp Bản đồ di truyền hiện đại được lập trên

cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm soát các tính trạng nghiên cứu Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể được biểu hiện

ở kiểu hình Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ thị liên kết gen Khoảng cách giữa các chỉ thị và gen được thể hiện bằng tần số tái

tổ hợp giữa chúng

+ Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể, xác định mối quan hệ

họ hàng giữa các cá thể trong quần thể từ đó lựa chọn ra các cặp bố mẹ có khả năng cho ưu thế lai cao phục vụ cho công tác chọn tạo giống

+ Sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng quan tâm để phát hiện tính trạng đó trong quần thể, từ đó lựa chọn đúng cá thể mang kiểu gen quy định tính trạng mong muốn

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.4.1.1 Tình hình sản xuất, xuất khẩu lúa gạo trên thế giới

Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới từ năm 2010 đến năm 2015 đã

có sự thay đổi đáng kể về sản lượng Tuy có nhiều bất ổn do thời tiết không

thuận lợi nhưng châu Á vẫn là khu vực sản xuất được tới 90,3% tương đương với 435/481 triệu tấn gạo trong tổng số sản lượng lúa gạo của thế giới năm

2015 Trong đó, các nước: Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan và Việt Nam là những nước dẫn đầu về sản lượng lúa gạo ở khu vực

Gần đây, nhập khẩu gạo của các quốc gia châu Phi khoảng 10,5 triệu tấn, giảm 2% so với năm 2010 Nguyên nhân giảm nhập khẩu gạo đó là hầu hết chính phủ các quốc gia này quan tâm sản xuất trong nước làm sản lượng lúa nội địa tăng lên Quốc gia nhập khẩu nhiều gạo nhất châu Phi là Nigeria đặt mục tiêu năm 2020 có thể tự cung về gạo và nâng mức thuế nhập khẩu gạo vào quốc gia này Điều này sẽ gây khó khăn cho xuất khẩu gạo Việt Nam

và chịu sự cạnh tranh quyết liệt từ các nước có nguồn cung cấp gạo dồi dào như Thái Lan, Ấn Độ và các quốc gia khác

Tại các nước Mỹ La tinh nhập khẩu khoảng 3,7 triệu tấn năm 2012 tăng 8% so với năm 2010 do sản lượng gạo một số nước có xu hướng giảm như: Braxin, Haiti, Panama, Đối với việc xuất khẩu gạo vào châu Âu thì khó khăn hơn vì các quốc gia này tăng cường các biện pháp nghiêm ngặt hơn Đặc biệt là gạo và các sản phẩm từ gạo có nguồn gốc Trung Quốc

1.4.1.2 Nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên thế giới

Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới triển khai rộng rãi Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm soát các tính trạng khác nhau đã được định vị thay thế các phương pháp đánh giá theo hình thái cổ điển thông thường [17 - 18] Các nhà khoa học ở Trường Đại học Tổng Hợp Cornel (Mỹ) là những người đầu tiên định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa Trong chương trình gen lúa

do Nhật Bản chủ trì, các nhà khoa học đã phát hiện và tách dòng hơn 3.000 đoạn ADN bổ trợ Đến nay đã có khoảng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vệ

tinh) ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng [18] Hiện nay có khoảng 20 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu, và một số QTL kháng đạo ôn đã được phát hiện [6 - 12] Ngoài ra gen thơm của giống Jasmine, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu mặn, chịu hạn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhạy cảm với nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống Nhiều chỉ thị phân tử liên kết với các gen trên

đã được phát hiện bởi các tác giả trong nước [3 - 6]

Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen Với sự ra đời của hàng loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên kết đến các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất Trong nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL/gen điều khiển một tính trạng năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất Đây là một việc làm khó

vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di truyền số lượng,

nó là tổ hợp tính trạng như: Số hạt chắc trên bông, số bống trên khóm, khối lượng nghìn hạt Những nằm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã được xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai giữa giống hay các loài phụ QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất được xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa

Gần đây, Viện Nghiên cứu Lúa gạo Quốc tế (IRRI) đã tập chung nghiên cứu và đã khắc phục được một số nhược điểm của các giống lúa trong đó có giống IR8 Những giống lúa cải tiến này có tên “siêu lúa” Đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm quy tụ nhiều tính trạng kinh tế vào 1 giống [13]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.4.2.1 Tình hình sản xuất, xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam

Lúa gạo là một mặt hàng xuất khẩu chủ lực trong ngành nông nghiệp của Việt Nam và là một trong những nước có diện tích gieo trồng và sản lượng lúa gạo cao nhất thế giới Năm 2010 Việt Nam sản xuất được 39,710 triệu tấn thóc, xuất khẩu khoảng 6,493 triệu tấn đứng thứ 2 trên thế giới về xuất khẩu gạo sau Thái Lan Năm 2011 sản xuất lúa gạo đạt 41,5 triệu tấn, xuất khẩu trên 7 triệu tấn Năm 2012 diện tích đất trồng lúa cả nước tăng 117 nghìn ha so với năm 2011, đạt khoảng 7,76 triệu ha, năng suất bình quân đạt 56,6 tạ/ha và tổng sản lượng lúa ước đạt khoảng 43,96 triệu tấn, xuất khẩu khoảng 7,8 triệu tấn đứng thứ hai thế giới sau Ấn Độ (9,5 triệu tấn) Năm

2013, sản lượng lúa tăng so với năm 2012 và đạt hơn 44 triệu tấn; xuất khẩu khoảng 9,6 triệu tấn đứng thứ 3 thế giới chỉ sau Ấn Độ và Thái Lan Như vậy, kim ngạch xuất khẩu gạo của Việt Nam không ngừng tăng lên, thị trường xuất khẩu gạo không ngừng được mở rộng, góp phần đưa nền kinh tế Việt Nam vượt qua khó khăn, tạo sự ổn định về kinh tế, chính trị, xã hội Xuất khẩu gạo

có vai trò quan trọng trong việc phát triển kinh tế nông nghiệp nông thôn và là công cụ để đưa đất nước hội nhập vào nền kinh tế quốc tế

1.4.2.2 Nghiên cứu về chỉ thị phân tử ở Việt Nam

Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống cũng được triển khai và thu được những kết quả khả quan Tại một số Viện nghiên cứu và trường (Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long ) đã triển khai sử dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ gen kháng bạc lá đối với cây lúa [9] Đã có những báo cáo về ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, và đã có một số dòng kháng có triển vọng được tạo ra bằng kĩ thuật này [11]

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu sử dụng chỉ thị phân tử để xác đinh lập bản đồ và chuyển những gen kháng đạo ôn vào những giống có tính trạng ưu việt Các nhà khoa học đã phân tích phân tử ADN của

các dòng lúa chọn lọc đã phát hiện dòng B12 mang đoạn ADN dài 1200bp là đoạn ADN liên kết chặt với gen kháng Pi-2(t) và dòng B12 kháng 100% với 4

loài nấm lây bệnh [2]

Ở Việt Nam việc nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng rầy nâu, lần đầu tiên được tiến hành tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, các nhà khoa học đã sử dụng STS để phân tích sự du nhập gen kháng

rầy nâu từ loài hoang dại O australiensis vào giống lúa trồng O sativa L

[13] Bên cạnh đó, các nhà khoa học đã lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng

rầy nâu bphX, bph4, bph6 và phát hiện được một loạt phân tử SSR liên kết

gần với các gen kháng đó Ngoài ra, Nguyễn Thị Lang với sự cộng tác của các tác giả thuộc Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI đã thành công trong việc lập

bản đồ gen kháng bph10- 1 gen kháng tốt đối với bệnh bạc lá của cây lúa ở

Đông Bằng Sông Cửu Long [9]

Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống ( kỹ thụât sinh học phân tử ) thực tế đã được triển khai từ những năm cuối của thế kỷ trước tại một số viện nghiên cứu và trường đại học Tuy nhiên, các kỹ thuật công nghệ này mới thực sự phát triển và được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu vào những năm gần đây Phần lớn các nghiên cứu xác định chỉ thị liên kết gen và lập bản đồ gen của các tác giả Việt Nam được tiến hành trên đối tượng cây lúa trong khuôn khổ các dự án nghiên cứu và dự án hợp tác quốc tế Nghiên cứu về đa dạng di truyền và lập bản đồ gen, QTL bằng việc sử dụng chỉ thị RAPD, RGA, SSR, AFLP, RFLP là những công cụ hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong

việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống cũng được triển khai và thu được những kết quả khả quan

Trong thời gian qua Việt Nam đã có những thành tựu đáng kể trong chọn tạo giống lúa:

- Nghiên cứu các giống lúa phẩm chất cao phục vụ Đồng Bằng Sông Cửu Long của Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long với phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học (marker phân tử, nuôi cấy túi phấn) kết hợp với khảo nghiệm đồng ruộng để chọn tạo giống lúa ngắn ngày, năng suất cao, chất lượng gạo tốt như: OM1490, OM2517, OM3536, OM2717, OM2718, OM3405, OM4495, OM4498, OM2514 trồng rộng rãi ở vùng sản xuất ngập lũ Đồng Bằng Sông Cửu Long [15]

- Phân tích QTL (Quantitative Trait Loci) tính trạng chống chịu mặn của cây lúa của Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long dùng phương pháp marker RFLP, microsatellite phân tích bản đồ di truyền của tổ hợp lai IR 28/ Đốc Phụng xác định marker RM223 liên kết vơi gen chống chịu mặn với khoảng cách di truyền 6,3cm NST số 8 ở giai đoạn mạ [15]

- Áp dụng chỉ thị phân tử để chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá của Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long dùng phương pháp chỉ thị marker kết hợp với chọn giống truyền thống thanh lọc và đánh giá kiểu hình, kiểu gen

các giống lúa mùa địa phương xác định gen kháng bạc lá Xa5, Xa13 trên NST

số 5, 8 và việc liên kết các gen mục tiêu làm tăng tính kháng rộng của giống lúa [15]