Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính

3. Ý nghĩa của đề tài

2.4.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính

 Chuẩn bị kính

- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.

- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.

Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.

- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) đƣợc tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.

- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.

- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.

 Chuẩn bị gel polyacrylamide

- Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nƣớc)

- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’- Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.

- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. - Cài lƣợc vào giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lƣợc.

- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.

Điện di

- Tháo lƣợc và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dƣới. - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.

- Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W.

- Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.

Sản phẩm PCR lúc này đã đƣợc trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).

- Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã đƣợc làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.

Chú ý. Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội

đi nhiều.

- Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thƣớc từng mồi sử dụng.

 Phương pháp nhuộm bạc

+ Chuẩn bị các dung dịch

- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nƣớc cất.

- Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.

- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất và làm lạnh ở -200

C.

Chú ý: (Trƣớc khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và

200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).

+ Tiến hành nhuộm

- Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch.

Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bƣớc sau.

- Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nƣớc cất trong 5 - 10 giây.

- Đƣa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.