Phương pháp tách chiết ADN tổng số

3. Ý nghĩa của đề tài

2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN lúa đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trƣờng đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ) do tác giả Gawei và cs đƣa ra năm 1991 và đã có sự cải tiến

Các bước tiến hành

Phƣơng pháp CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) cải tiến trên cơ sở phƣơng pháp của Shagai – Maroof (năm 1984).

Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các hóa chất để phá vỡ các vật liệu là màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng trong các eppendorf. Đồng thời kết hợp ly tâm để tách các hóa chất và loại bỏ các thành phần không muốn, từ đó thu nhận ADN

Quy trình thực hiện gồm các bƣớc:

- Lá của các giống lúa nghiên cứu đƣợc cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3 tuần. Mẫu đƣợc lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN.

- Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.

- Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA (Ethylendiamin Tetraacetic Acit), pH 8,0): 0,07%  - Mercaptol ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50l SDS 10%.

- Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 65⁰C, thỉnh thoảng đảo cho dịch đƣợc trộn đều.

- Ly tâm 13.500 vòng/phút trong 20 phút.

- Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tƣợng kết tủa muối.

- Ly tâm 13.500 vòng/phút trong 25 phút.

- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dƣới đáy eppendorf. Cho 400l

đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ 650C ủ

trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bƣớc này có thể giữ ở 40C qua đêm.

- Cho 3l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng.

- Thêm 400l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều.

- Cho vào tủ hút, thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.

- Ly tâm ở 13.500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Nếu chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1).

- Ly tâm 13.500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng ở đáy ống.

- Rửa tiếp bằng 400l cồn 70% rồi đƣa vào máy ly tâm 13.500 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100l TE (10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.

- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 20⁰C) để sử dụng cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo.