Kỹ Thuật Định Danh Vi Khuẩn

KỸ THUẬT LẤY VÀ CHUYÊN CHỞ BỆNH PHẨM TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG KỸ THUẬT LẤY VÀ CHUYÊN CHỞ BỆNH PHẨM TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG Phạm Thái Bình KỸ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN.

KỸ THUẬT LẤY VÀ CHUYÊN CHỞ BỆNH PHẨM

TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

KỸ THUẬT LẤY VÀ CHUYÊN CHỞ BỆNH PHẨM

TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

Phạm Thái Bình

KỸ THUẬT

ĐỊNH DANH VI KHUẨN

Bệnh phẩm là mẫu thử lấy từ bệnh nhân để phát hiện bằng chứng giúp xác định được tác nhân gây nhiễm trùng.

Cầu khuẩn Gram (-)

Cầu khuẩn Gram (+)

Trực khuẩn Gram (-)

Trực khuẩn Gram (+)

Bệnh phẩm thường gặp trong xét nghiệm vi sinh

Máu

Dịch não tủy

Đường hô hấp trên

Hầu họng Mũi hầu Tai

Xoang

Đàm Dịch phế quản Dịch khí quản

Mủ và tiết dịch

Phân

Đường sinh dục

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG THỬ NGHIỆM SINH HÓA

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG

THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Vì bệnh phẩm được lấy bởi nhiều nguồn khác nhau nên phải lấy

bệnh phẩm đạt yêu cầu trong xét nghiệm vi sinh

Campylobacter Helicobacter

Brucella Bor etella Bartonella rancisella Legionella

Betty A Forbes, et.al., 2002, Bailey & Scott’s, Diagnostic Microbiology, 7thedition, Mosby

(1) HACEK: H aemophilus aphrophilus, A ctinobacillus actinomycetemcomitans,

Pse as Burkhol eria

lavobacterium Alcaligenes Achromobacter Chryseobacterium

Nguyên nhân làm cho bệnh phẩm không đạt

yêu cầu trong xét nghiệm vi sinh

Calgary Laboratory Services, Canada

ð Enterobacteriaceae bao gồm 120 loài khác nhau

ð Các họ phụ chính: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia,

Edwardsiella, Serratia, Shigella, Salmonella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia

ð Để định danh đến loài có thể thực hiện đến 40 phản ứng sinh hóa.

Enterobacteriaceae

Patrick R Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology

Phải chỉ định lấy bệnh phẩm sớm

Pseu omonas Burkhol eria Alcaligenes Comamonas

Sphigobacterium lavobacterium Chryseobacterium

Chỉ định cấy máu ngay khi

có dấu hiệu nhiễm trùng

huyết (septicemia) hoặc du

khuẩn huyết (bacteremia).

ð Sốt, ớn lạnh, lạnh run, tiếng thổi tim (cardiac murmur).

ð Nghi ngờ viêm nội tâm mạc.

ð Có xuất huyết ở da hay niêm mạc, xuất huyết dạng sao (splinder) trên móng tay, choáng.

H aphrophilus

Vi khuẩn khác (không phải

Haemophilus)

(-) (+)

H ducreyi

(+) (-)

Dịch não tủy

Chỉ định cấy dịch não tủy khi có các triệu

chứng nghi ngờ viêm màng não.

Không chỉ định chọc dò DNT:

ð trẻ sơ sinh bị suy tim, suy hô hấp.

ð bệnh nhân có dấu hiệu gia tăng áp lực nội sọ (soi

đáy mắt thấy gai thị bị phù nề).

ð bệnh nhân bị nhiễm trùng vùng da nơi kim chọc dò

đi qua để lấy DNT.

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

CẦU KHUẨN GRAM (-)

(+)

Acinetobacter ( * ) M catarrhalis

Neisseriaceae (-)

Oxidase

N gonorrhoeae N meningiti is N lactamica N sicca M catarrhalis

Cầu khuẩn Gram (-)

( * ) cầu trực khuẩn

Nước tiểu

Chỉ định cấy nước tiểu khi nghi ngờ nhiễm trùng tiểu cấp tính, mạn tính có hoặc không có triệu chứng

ð Nhiễm trùng bàng quang (đái ra mủ, ra máu, đái khó, đái đau, đau tức vùng xương mu hay bụng dưới).

ð Nhiễm trùng thận (đau lưng, tức căng vùng góc sống-sườn).

Gar nerella vaginalis Lactobacillus

Trực khuẩn Gram (+)

Chỉ định cấy phân khi bị tiêu chảy hoặc bị rối loạn tiêu hoá nghi ngờ do nhiễm trùng

ð Tiêu chảy.

ð Lỵ với phân có mủ, nhầy hoặc máu.

ð Bị đau bụng cơn.

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

CẦU KHUẨN GRAM (+)

Catalase

Planococcus Micrococcus

Stomatococcus

Staphylococcus

Streptococcus Enterococcus

Aerococcus Lactococcus

Pe iococcus Leuconostoccus Genella

Patrick R Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition,

American Society for Microbiology

Di động

6.5% NaCl

(-) (+)

(+) (-)

(-) (+)

(-)

(+)

Oxidase

Chỉ định cấy đường hô hấp trên khi có nhiễm trùng vùng hầu họng, tai, mũi xoang

Đường hô hấp trên

ð Viêm tai ngoài cấp tính.

ð Viêm tai giữa cấp tính hoặc mạn tính

ð Viêm xoang cấp tinh hoặc mạn tính.

ð Viêm mũi cấp tính hoặc mạn tính.

ð Viêm nhiễm vùng hầu họng (đau rát vùng hầu họng, niêm mạc hầu họng sưng đỏ, phù nề, viêm amydan, có màng mủ hay màng giả, phù nề tiểu thiệt, luỡi đỏ dâu tây, và sưng hạch cổ).

ð Tìm người lành mang trùng.

S schlei eri

Ornithin decarboxylase

S lu unensis

S hominis

Urease Polymycin B

S haemolyticus

Staphylococcus

coagulase negative khác

Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2ndedition, WHO

(+)

(-)

(S)

(-) (-)

(R)

(S)

Chỉ định cấy đường hô hấp dưới khi có viêm nhiễm đường hô hấp dưới (viêm phổi, viêm phế quản cấp, cơn cấp của viêm phế quản mạn)

Đường hô hấp ưới

ð Ho có máu, ho nhiều, đau ngực, khó thở

ð Có dấu hiệu đặc phổi, phim phổi có thâm nhiễm

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Streptococcus Enterococcus

(-)I

Viridans streptococcus

R

Viridans streptococcus

(+)I

S pseudopneumoniae

S

S pneumoniae

Bile solutionOptochin

Vi khuẩn

(+)(-)

SXT

(-)R/S

C/F/G streptococcus

(+)R

S agalactidae

(-)S

S pyogenes

CAMPBacitracin

Vi khuẩnTiêu huyết α Optochin Bile solution

(-)(-)

Viridans streptococcus

(+)(-)

S agalactidae

(-)(+)

Non enterococcus

CAMP

(+)(+)

Enterococcus

6.5% NaClBile esculin

Chỉ định cấy mủ và tiết dịch trong các trường hợp:

Mủ và tiết ịch

ð Mẫu nạo mủ xương khi giải phẫu

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG

KITS THƯƠNG MẠI

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG

KITS THƯƠNG MẠI

Chỉ định cấy đường sinh dục nghi ngờ bệnh lây truyền bằng đường sinh dục (ở đàn ông và đàn bà) hoặc bị huyết trắng nghi do nhiễm trùng (ở đàn bà).

Đường sinh ục

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Định danh bằng kits thương mại giúp

định danh nhanh chóng và chính

xác hơn nhờ hệ thống mã định danh

Phải lấy đúng bệnh phẩm

2

Trực khuẩn Gram (-), ễ mọc

bằng hệ thống IDS14GNR (Nam Khoa)

Oxidase

LDC

Di động

VP 9

Vòng vàng Vòng đỏ

Kovac Indol

8

Không đen Đen

H2S 8

Không đen Đen

Esculin 7

Xanh lá/ vàng Xanh biển

Citrate 6

Vàng nhạt Xanh lá

FeCl3PAD

5

Vàng/đỏ nhạt Đỏ hồng

Sinh Urease 4

Trắng Vàng

ONPG 3

Vàng Đỏ

Tìm nitrite Nitrate → Nitrite

2

Tím Vàng

Glucose 1

(-) (+)

Thuốc thử Thử nghiệm

Giếng số

Tìm tác nhân gây nhiễm trùng vết

thương phải lấy mủ hoặc dịch tiết

gần lớp mô, không lấy mủ trên bề

mặt vết thương.

Tìm tác nhân gây viêm xoang phải lấy quệt mũi sau, không lấy quệt mũi trước.

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Mỗi nhóm gồm có 03 phản ứng

ð Các phản ứng (-): 0 điểm

ð Phản ứng (+): 1 điểm (thứ nhất của nhóm); 2 điểm (thứ hai của nhóm); 3 điểm (thứ ba của nhóm).

ð Tổng điểm của nhóm được số định danh thứ nhất.

ð Tập hợp các số định danh được mã số định danh.

IDS 14GNR- Hệ thống định danh

trực khuẩn Gram (-), dễ mọc Số: ……… ……

Tên: ……… ISO 9001:2000

WHO GMP/GLP

OXI 1

GLU 2

NIT 4

ONPG

1

URE 2

PAD 4

CIT 1

ESC 2

H2s 4

IND 1

VP 2

MLO 4

LDC 1

MOB 2

Kết quả định anh :

Enterobacter cloaceae(ID: 100
, P: 0.67)

Tìm tác nhân gây viêm phổi phải lấy đàm hoặc dịch hút khí phế quản, không lấy nước bọt

Phải lấy bệnh phẩm đúng thời điểm

hiện iện trong bệnh phẩm

3

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG

MÁY ĐỊNH DANH TỰ ĐỘNG

BioMerieux VITEK2

PHOENIX

Tìm S typhi gây thương hàn

Cấy máu nếu ở tuần thứ nhất sau khi khởi bệnh

Cấy phân nếu ở tuần

Thời điểm tốt nhất để lấy máu là khi bệnh nhân bị ớn lạnh hoặc đang lạnh run trước khi sốt, hoặc lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt.

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Gen 16S rRNA gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn.

Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác

vi khuẩn

1542bps 120bps

2904bps

Nguyên tắc

Nước tiểu

Thời điểm tốt nhất để

lấy nước tiểu là vào

buổi sáng, bệnh nhân

cố nhịn tiểu trong đêm

cho đến lúc lấy mẫu.

Các bệnh phẩm khác

Thời điểm tốt nhất để lấy

mẫu là càng vào giai

đoạn sớm của bệnh

càng tốt, nghĩa là ngay

khi có chẩn đoán

Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm

vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Tách chiết DNA :

– Đun sôi 10min – Để lạnh 5min – Ly tâm 5min.

Phải lấy bệnh phẩm trước khi bệnh nhân

sử ụng kháng sinh

Điện di mao quản trên CEQ 8000

Xuất kết quả giải trình tự để phân tích Đăng NCBI BLAST SEARCH nhập vào

Xác định tên vi khuẩn cần định nh

Việc điều trị kháng sinh theo kinh nghiệm có thể không tiệt trừ hoàn toàn nhưng ức chế sự phát triển của tác nhân nhiễm trùng khi nuôi cấy và có thể cho kết quả âm tính giả.

Phải lấy bệnh phẩm nuôi cấy

trước khi điều trị kháng sinh, nhất

là với kháng sinh phổ rộng.

Phải lấy bệnh phẩm đúng phương pháp

được bệnh phẩm cần lấy