Kỹ Thuật Định Danh Vi Khuẩn

KỸ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN Phạm Thái Bình Cầu khuẩn Gram (-) Trực khuẩn Gram (-) Cầu khuẩn Gram (+) Trực khuẩn Gram (+) PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG THỬ NGHIỆM SINH HÓA TRỰC KHUẨN GRAM (-) H❛ ♠✁ph✐✂✂✉✄ HACEK(1) Trực khuẩn Gram(-) Sphin❣✁♠✁♦❛✄ M✁ra① ✂✂❛ (+) (-) Pa✄t ✉r ✂✂❛ Cam♣☎✂✁❜❛✆t r H ✂✐✆✁❜❛✆t r Mac Conkey Agar A✆✐n t✁❜❛✆t r(2) (-) (-) (+) St ♦✁tr✁p❤✁♠✁♦❛✄ ❋✂a✓i♠✁♦❛✄ Oxidase (Ci✞✟✠✡☛☞✞❡✟, En✞❡✟✠✡☛☞✞❡✟✌ K❧❡✡✍i❡❧❧a, ❊✍☞h❡✟ i☞hia, S❡✟✟☛✞ia, E✎w☛✟✍i❡❧❧a, M✠✟✑an❡❧❧a, P✟✠✞❡✏✍✌ P✟✠✈i✎❡n☞ia, Sa❧m✠✒❡❧❧a, Shi✑❡❧❧a, Y❡✟✍inia ) Glucose (-) Glucose (+) Chr☎✄ ✁♠✁♦❛✄ Ent r✁❜❛✆t r✐❛✆ ❛ ✝ (+) Br✉✆ ✂✂❛ Vi❜r✐✁ A r✁♠✁♦❛✄ P✂ ✐✁✄✁♠✁♦❛✄ Chr✁♠✁❜❛✆t ri✉♠ B✁r❞ t ✂✂❛ Bart✁♦ ✂✂❛ ❋ran✆✐✄ ✂✂❛ ▲ ❣i✁♦ ✂✂❛ P✄ ✉❞✁♠✁♦❛✄ (+) B✉r❦❤✁✂❞ ria ❋✂a✓✁❜❛✆t ri✉♠ A✂✆❛✂✐❣ n ✄ A✆hr✁♠✁❜❛✆t r Trực khuẩn Gram (-) dễ mọc Chr☎✄ ✁❜❛✆t ri✉♠ (1)HACEK: Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella sp (2)cầu trực khuẩn Betty A Forbes, et.al., 2002, Bailey & Scott’s, Diagnostic Microbiology, 7th edition, Mosby En✔✕✖✗✘✙✚✔✕✖✛✙✚✕✙✕ ð ð ð Enterobacteriaceae bao gồm 120 loài khác Các họ phụ chính: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Serratia, Shigella, Salmonella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia Để đònh danh đến loài thực đến 40 phản ứng sinh hóa Patrick R Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology N✗✜❢✕✖m✕n✔a✔i✢✕ G✖am n✕✣a✔i✢✕ A❝in✥✦✧★✩❝✦✥✪ (-) (+) (-) (-) ❙✦✥♥✧✦✪✧p✫✧m✧♥✩✬ Sphi✱✧★✩❝✦✥✪i✲✶ ✮✯a✰✧★✩❝✦✥✪ i✲✶ Ch✪✭✬✥✧★✩❝✦✥✪i✲✶ Oxidase Di động (+) ✘✙✚✛✤✤✛ Di động (+) P✬✥✲✴✧m✧♥✩✬ Ch✪✭✬✥✧m✧♥a✬ B✲✪✳✫✧✯✴✥✪ia ✮✯a✰im✧ma✬ ❆✯❝✩✯✵✱✥n✥✬ Sphi✱✧m✧♥✩✬ C✧mam✧♥✩✬ B✲✪✳✫✧✯✴✥✪ia ❝✥p✩❝ia B✲✪✳✫✧✯✴✥✪ia ✱✯a✴i✧✯✵ ❍✷✸m✹p✺✻✼✽✾ ❳ V H Influenzae H Haemoliticus Vi khuaån (+) (+) H H H H H (-) (+) (+) (-) (-) (-) XV V X XV X V parainfluenzae parahaemoliticus segnis paraprophilus paraphrophaemolyticus H ducreyi H aphrophilus Vi khuaån khác (không phải Haemophilus) XV V X XV X V CẦU KHUẨN GRAM (-) Cầu khuẩn Gram (-) A✿in❀❁❂❃❄✿❁❀❅(*) (-) (+) M ✿a❁❄❅❅ha❇❈❉ N❀i❉❉❀❅ia✿❀❄❀ Oxidase N ●■❏■❑❑▼■◆❖◆ N m◆nin●i€i◗❘❚ N ❯❖❱€❖mi❱❖ N ❚i❱❱❖ M ❱a€❖❑❑ha❯❘❚ (*)cầu trực khuẩn TRỰC KHUẨN GRAM (+) Trực khuẩn Gram (+) (+) (+) B❲❨❩❬❬❭❪ (-) Catalase (-) Sinh bào tử E②③④ip⑤⑥⑦⑧h②i⑨ ②hu④i⑦pa⑧hi⑩⑤ (+) ✇i❪s❥❴ia Di động (-) C❫❴❵n❥qa❨s❥❴ium A②❶⑩❷⑦❸⑩❶⑧⑤②ium Ga②❹n⑤②⑤⑥⑥a ❺a❻ina⑥❼④ ❽⑩❶⑧⑦❸⑩❶❼⑥⑥❾④ CẦU KHUẨN GRAM (+) Mi❨❴❫❨❫❨❨a❨❥❲❥ (-) (+) Ss❴❥ps❫❨❫❨❨a❨❥❲❥ Catalase (+) (-) Oxidase (-) Ss❴❥ps❫❨❫❨❨❭❪ ❿❬a➀❫❨❫❨❨❭❪ Di động (+) Mi❨❴❫❨❫❨❨❭❪ Ens❥❴❫❨❫❨❨❭❪ A❥❴❫❨❫❨❨❭❪ ✇❲❨s❫❨❫❨❨❭❪ P❥➁i❫❨❫❨❨❭❪ (-) Ss❫mas❫❨❫❨❨❭❪ 6.5% NaCl (+) Ssaph❵❬❫❨❫❨❨❭❪ ✇❥u❨❫➀❫❪s❫❨❨❭❪ G❥n❥❬❬❲ Patrick R Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology S➂aph➃➄➅➆➅➆➆➇➈ (R) S au➉➊➋➌ (+) S ➌ap➉➍ph➎➏i➐➋➌ (-) (S) Coagulase Novobiocin Mannitol Salt (-) (+) S➙➛ph➜➝➞➟➞➟➟u➠ ➟➞a➡u➝➛➠➢ n➢➡a➙➤➥➢ khaù➟ S ➊pi➑➊➉➒i➑➓➌ (R) (-) Polymycin B (-) Urease (+) (S) S h↕➊m➍➔➎➏i➐➋➌ (-) Ornithin decarboxylase (+) S ↔➍ min➓➌ (+) S ➌➐h➔➊i→➊➉➓ Alkaline phosphatase S ➔u➣➑un➊n➌➓➌ Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO S➦➧➨p➦➩➫➩➫➫u➭ ➯ En➦➨➧➩➫➩➫➫➲➭ Vi khuẩn Optochin Tiêu huyết α Optochin Bile solution S pseudopneumoniae I Viridans streptococcus R Viridans streptococcus I Vi khuẩn CAMP SXT Tiêu huyết β S pyogenes S agalactidae C/F/G streptococcus Enterococcus Bacitracin Bile esculin (-) Bacitracin CAMP S➳➵ S (-) S R (+) R R/S (-) R R (-) Bile esculin (-) (+) Bile esculin 6.5➸ NaCl (+) (+) Non enterococcus (+) (-) S agalactidae (-) (+) Viridans streptococcus (-) (-) Enterococcus Pyruvate Vi khuẩn Tiêu huyết γ 6.5% NaCl (+) Enterococcus Bile esculin CAMP Bile solution S S pneumoniae E faecalis (+) E faecium (-) CAMP Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG KITS THƯƠNG MẠI Đònh danh kits thương mại giúp đònh danh nhanh chóng xác nhờ hệ thống mã đònh danh Trực khuẩn Gram (-), dễ mọc hệ thống IDS14GNR (Nam Khoa) 200ml/giếng 35oC/12-16h Giếng số Oxidase Di động LDC 35oC/ 12-16h Thử nghiệm Thuốc thử (+) (-) Glucose Nitrate → Nitrite ONPG Vàng Trắng Sinh Urease Đỏ hồng Vàng/đỏ nhạt PAD Xanh Vàng nhạt Citrate Xanh biển Xanh lá/ vàng Esculin Đen Không đen H2S Đen Không đen Indol VP 10 Malonate Tìm nitrite FeCl3 Kovac α-napthtol+KOH Vàng Tím Đỏ Vàng Vòng đỏ Vòng vàng Đỏ Vàng Xanh biển Xanh lá/ vàng Mỗi nhóm gồm có 03 phản ứng ð Các phản ứng (-): điểm ð Phản ứng (+): điểm (thứ nhóm); điểm (thứ hai nhóm); điểm (thứ ba nhóm) ð Tổng điểm nhóm số đònh danh thứ ð Tập hợp số đònh danh mã số đònh danh IDS 14GNR- Hệ thống đònh danh Số: …………………………………………………………… …… trực khuẩn Gram (-), dễ mọc Tên: ……………………………………………………………………… ISO 9001:2000 WHO GMP/GLP OXI GLU NIT ONPG URE PAD CIT ESC H2s IND VP MLO LDC 4 4 6 MOB Kết đònh danh: Enterobacter cloaceae (ID: 100➺, P: 0.67) PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG MÁY ĐỊNH DANH TỰ ĐỘNG PHOENIX BioMerieux VITEK2 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA Nguyên tắc Gen 16S rRNA gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn Trong có đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống loài vi khuẩn Giải trình tự đoạn đặc hiệu giúp đònh danh xác vi khuẩn 120bps 1542bps 2904bps 10 ➻ uy trình thực Tách chiết DNA : Vi khuẩn mặt thạch Lấy khúm khuẩn cho vào TE 1X để làm thành huyền dòch tương đương Mc F 1.0 – Đun sôi 10min – Để lạnh 5min – Ly tâm 5min Lấy dòch Primers Taq polymerase dNTP Mg2+ DNA đích PCR 16SrRNA (40X) Điện di gel agarose để xác đònh sản phẩm PCR 94oC/15s 60oC/30s 72oC/1min Cho vào PCR mix để khuếch đại gen 16S rRNA 11 SV gel & PCR cleanup system (Promega) Tinh sản phẩm PCR Xuất kết giải trình tự để phân tích Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH Đo nồng độ DNA (10pg/ml) ➼ác đònh tên vi khuẩn PCR giải trình tự cần đònh danh Điện di mao quản CEQ 8000 (30X) 96oC/20s 50oC/20s 60oC/4min Agencourt Clean SEQ (Beckman Coulter) DTCS Quickstart mix (Beckman Coulter) Tủa tinh sản phẩm PCR giải trình tự 12 13 ... hiệu cho giống loài vi khuẩn Giải trình tự đoạn đặc hiệu giúp đònh danh xác vi khuẩn 120bps 1542bps 2904bps 10 ➻ uy trình thực Tách chiết DNA : Vi khuẩn mặt thạch Lấy khúm khuẩn cho vào TE 1X... WHO S➦➧➨p➦➩➫➩➫➫u➭ ➯ En➦➨➧➩➫➩➫➫➲➭ Vi khuẩn Optochin Tiêu huyeát α Optochin Bile solution S pseudopneumoniae I Viridans streptococcus R Viridans streptococcus I Vi khuẩn CAMP SXT Tiêu huyết β S pyogenes... (thứ ba nhóm) ð Tổng điểm nhóm số đònh danh thứ ð Tập hợp số đònh danh mã số đònh danh IDS 14GNR- Hệ thống đònh danh Số: …………………………………………………………… …… trực khuẩn Gram (-), dễ mọc Tên: ………………………………………………………………………