Kĩ Thuật Khảo Sát Trực Tiếp Vi Khuẩn

KỸ THUẬT KHẢO SÁT TRỰC TIẾP Phạm Thái Bình KỸ THUẬT SOI TƯƠI Soi tươi không Mục đích ð Quan sát di động vi khuẩn ð Phát phẩy khuẩn tả Phương pháp Huyền dòch (vi khuẩn, bệnh phẩm) Hạ tụ quang, quan sát ×40 Soi tươi có Mục đích ð Phát vi khuẩn, vi nấm, ký sinh trùng, hồng cầu bạch cầu dòch não tủy, phân Phương pháp C neoformans (nigrosin) C meningitidis (nigrosin) Huyền dòch (vi khuẩn, bệnh phẩm) Nigrosin (2%) Hạ tụ quang, quan sát ×40 Methylen blue (0.001%) KỸ THUẬT CHUẨN BỊ PHẾT NHUỘM Chuẩn bò phết nhuộm thực hiện: ð Nhuộm Gram (Gram stain) ð Nhuộm kháng acid (Acid fast stain) ð Nhuộm đơn (simple stain) Khi làm phết nhuộm cần lưu ý: ð Phải dàn phết nhuộm lame ð Phải để phết nhuộm khô tự nhiên ð Phải cố đònh phết nhuộm cách hơ nhẹ qua lửa đèn cồn ð Không nướng phết nhuộm KỸ THUẬT NHUỘM GRAM Hans Christian Gram Nguyên tắc Vách tế bào vi khuẩn Gram (+) giữ màu phức hợp Crystal violet-Iodine bò tẩy alcohol Thuốc nhuộm Dung dòch Crystal violet ð Hòa tan amonium oxalate (0.8g) nước cất (80ml) ð Nghiền crystal violet (2g) cối cho từ từ ethanol 95% (20ml) vào để làm tan hoàn toàn crystal violet ð Trộn hai dung dòch với ð Bảo quản tránh ánh sáng Dung dòch Lugol ð Nghiền iodine (1g) potassium iodine (3g) cối với nước cất (100ml) cho tan hoàn toàn ð Bảo quản tránh ánh sáng Dung dòch Alcohol ð Dùng alcohol 96% Dung dòch Safranine ð Nghiền safranine O (0.25g) với ethanol 95% (10ml) cối cho tan hoàn toàn ð Thêm vào 90ml nước cất, trộn ð Bảo quản tránh ánh sáng Phương pháp thực Phết nhuộm cố đònh lame Phủ Crystal violet lên phết nhuộm phút Quan sát vật kính dầu Rửa nước cho thuốc nhuộm Thấm khô phết nhuộm Phủ Lugol lên phết nhuộm phút Rửa nước cho thuốc nhuộm Rửa nước cho thuốc nhuộm Phủ Safranine lên phết nhuộm phút Tẩy màu alcohol Rửa nước Hệ thống nhuộm Gram tự động Wescor Model 7320 Aerospray® Quick Slide AGS-1000 Biện luận kết Tính chất Gram ð Vi khuẩn Gram (-): bắt màu hồng ð Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím Hình dạng ð Cầu khuẩn: vi khuẩn hình cầu ð Trực khuẩn: vi khuẩn hình que Cách xếp Các tính chất khác ð Số lượng ð Xếp chùm ð Tạo bào tử ð Xếp chuỗi ð Hình dạng cách xếp đặc biệt (phẩy khuẩn, xoắn khuẩn, xếp hình chữ nho, dạng cầu trực khuẩn ) ð Xếp đôi ð Xếp rời rạc Biện luận kết Song cầu Gram (-) Trực khuẩn Gram (-) Trực khuẩn Gram (-), nhỏ Phẩy khuẩn Gram (-) Biện luận kết Tụ cầu Gram (+) Liên cầu Gram (+) Trực khuẩn Gram (+) Song cầu Gram (+) Trực khuẩn Gram (+), xếp chuỗi có tạo bào tử Trực khuẩn Gram (+), xếp chuỗi Các sai lầm thường gặp Mầm cấy vi khuẩn ≥24h Dung dòch lugol không đạt chất lượng Tẩy màu lâu Alcohol acid Tẩy màu alcohol acid Vi khuẩn Gram (+) bắt màu hồng Các sai lầm thường gặp Phết nhuộm dày Tẩy màu ngắn Alcohol tẩy màu bò pha loãng Alcohol 70o Vi khuẩn Gram (-) bắt màu tím Các sai lầm thường gặp Sau phủ crystal violet, không rửa sạc h màu thừa lame Khi phủ lugol phết nhuộm màu crystal violet thừa bò tủa lại bám bề mặt phết nhuộm Kết lầm tưởng hình ảnh vi nấm Phủ safranine ngắn nên không thấy rõ màu Gram (-) KỸ THUẬT NHUỘM KHÁNG ACID Nguyên tắc Vi khuẩn kháng acid (Mycobacteria, Nocardia…) có lớp vỏ sáp bao bọc nên nhuộm với carbofuchsin phức hợp màu không bò tẩy màu dung dòch có tính tẩy mạnh (alcohol acid, acid…) Các phương pháp nhuộm kháng acid: ð Phương pháp Ziehl Neelsen (Franz Ziehl Friedrich Neelsen, 1882) ð Phương pháp Kinyoun (Joseph Kinyoun, 1887) Dung dòch Carbon fuchsin Thuốc nhuộm ð Hòa tan phenol (5ml) nước cất (85ml) ð Nghiền carbon fuchsin (0.3g phương pháp nhuộm nóng 1g phương pháp nhuộm lạnh) cối cho từ từ ethanol 95% (10ml) vào để làm tan hoàn toàn ð Trộn hai dung dòch với ð Bảo quản tránh ánh sáng Dung dòch Alcohol acid ð Hoøa tan 97ml alcohol 96% 3ml HCl đậm đặc Dung dòch Methylen blue ð Nghiền methylen blue (0.3g) với ethanol 95% (30ml) cối cho tan hoàn toàn ð Thêm vào nước cất (70ml) trộn ð Bảo quản tránh ánh sáng 10 Phương pháp nhuộm nóng (Ziehl Neelsen) Phết nhuôm cố đònh lame Hơ nóng phút cách đốt nhẹ lame (không để sôi) đun cách thủy không để khô thuốc nhuộm Phủ Carbon fuchsin lên phết nhuộm Quan sát vật kính dầu Thấm khô phết nhuộm Rửa nước cho thuốc nhuộm Rửa nước cho thuốc nhuộm Phủ Methylen blue lên phết nhuộm phút Tẩy màu alcohol acid Rửa nước Phương pháp nhuộm lạnh (Kinyoun) Phết nhuộm cố đònh lame Phủ Carbon fuchsin lên phết nhuộm 30 phút Rửa nước cho thuốc nhuộm Quan sát vật kính dầu Thấm khô phết nhuộm Tẩy màu alcohol acid Rửa nước cho thuốc nhuộm Rửa nước Phủ Methylen blue lên phết nhuộm phút 11 Hệ thống nhuộm kháng acid tự động AFB-0010 (GG&B Company) Biện luận kết Đọc kết ð Vi khuẩn kháng acid bắt màu hồng ð Vi khuẩn khác bắt màu xanh Lưu ý ð Nếu kết nhuộm kháng acid (+) không kết luận dương tính với M tuberculosis mà phải đọc kết AFB (+) BK (+) AFB: acid fast bacilli BK: Bacilli de Koch 12 Biện luận kết Đối với bệnh phẩm đàm cần phải đánh giá kết theo số lượng AFB ð (+/-): có 1→ vi khuẩn 300 quang trường ð (1+): có 1→ vi khuẩn 100 quang trường ð (2+): có 1→ vi khuẩn 10 quang trường ð (3+): có 1→ vi khuẩn quang trường ð (4+): có > vi khuẩn quang trường Đối với bệnh phẩm khác trả kết AFB (+) AFB (-) Các sai lầm thường gặp Thời gian phủ Carbofuchsin ngắn Phết nhuộm dày Sai lầm nhuộm kháng acid Carbofuchsin bò cặn Dùng Carbofuchsin phương pháp nhuộm nóng để nhuộm lạnh 13 CÁC KỸ THUẬT NHUỘM KHÁC Kỹ thuật nhuộm hạt biến sắc Phương pháp Phết nhuôm cố đònh lame Phủ thuốc nhuộm lên phết nhuộm 30’’ đến 1’ (Alkaline Methylen Blue) Mục đích ð Nhuộm hạt biến sắc để phát vi khuẩn bạch hầu (C diphtheriae) Thuốc nhuộm – Rửa nước cho thuốc nhuộm Thấm khô phết nhuộm Quan sát vật kính dầu – – Nghiền methylen blue (0.3g) với ethanol 95% (30ml) cối cho tan hoàn toàn Thêm nước cất (70ml) 02 giọt KOH 10%, trộn Bảo quản tránh ánh sáng Hạt biến sắc bắt màu xanh đậm, phần lại vi khuẩn bắt màu xanh nhạt 14 Kỹ thuật nhuộm lưỡng cực Phương pháp Phết nhuôm cố đònh lame Phủ thuốc nhuộm lên phết nhuộm 20’’ đến 30’’ Rửa nước cho thuốc nhuộm (Wayson) Mục đích ð Nhuộm lưỡng cực dùng để phát vi khuẩn dòch hạch (Y pestis) Thuốc nhuộm – – – Nghiền carbon fuchsin (0.2g) methylen blue (0.75g) với ethanol 95% (20ml) cối cho tan hoàn toàn Thêm dung dòch phenol 5% (200ml) trộn Bảo quản tránh ánh sáng − Y pestis bắt màu xanh đậm hai đầu xanh nhạt Thấm khô phết nhuộm − Vi khuẩn khác bắt màu xanh − Tế bào khác bắt màu xanh đậm- tím Quan sát vật kính dầu − Mô bắt màu hồng – đỏ KHẢO SÁT TRỰC TIẾP TRÊN CÁC BỆNH PHẨM XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG 15 Có thể cho kết sớm, gần chung cuộc, từ đó: ð Giúp lâm sà ng phò ng xét nghiệm nghó đến tác nhâ n nhiễm trùng với độ xác đế n 99% ð Giúp lâm sà ng lựa chọn kháng sinh điều trò ban đầu ð Giúp phò ng xét nghiệm đònh hướng tiến trình xét nghiệp Đánh giá chất lượng bệnh phẩm gợi ý tác nhân nhiễm trùng, từ đó: ð Giúp lâm sàng đònh hướng điều trò ban đầu ð Giúp phò ng xét nghiệm đònh hướng tiến trình xét nghiệp Không có ý nghóa khảo sát trực tiếp: Có thể gợi ý sớm tác nhân nhiễm trùng, từ đó: ð Giúp lâm sà ng đònh hướng điều trò ban đầu ð Giúp phò ng xét nghiệm đònh hướng tiến trình xét nghiệp ð Quệt họ ng (nếu yê u cầu tìm bạch hầu) ð Phân (nếu yêu cầ u tìm tả Campylobacter) Vai trò khảo sát trực tiếp xét nghiệm vi sinh lâm sàng Khảo sát trực tiếp: máu Nhuộm Gram từ pha lỏng môi trường cấy máu sau ủ 35oC/12-16h Trực khuẩn Gram (-) Staphlococcus H influenzae S pneumoniae 16 Khảo sát trực tiếp: dòch não tủy Tìm diện: ð Bạch cầu (trung tính nhân, lympho bào) đa ð Hồng cầu Soi tươi (× 400) với nigrosin Lympho bào ð Vi khuẩn ð Vi nấm ð Đơn bào (Naegleria fowleri) Trung tính đa nhân Hồng cầu C meningitidis Khảo sát trực tiếp: dòch não tủy (tt) S pneumoniae Nhuộm Gram để tìm vi khuẩn diện dòch não tủy L monocytogenes N meningitidis H influenzae Trực khuẩn Gram (-) S agalactidae 17 Khảo sát trực tiếp: nước tiểu Nhuộm Gram để tìm vi khuẩn , bạch cầu nước tiểu ð Nghi ngờ nhiễm trùng tiểu: quang trường có diện diện tế bào vi khuẩn và/hoặc bạch cầu E coli (Nước tiểu, Gram) ð Không có nhiễm trùng tiểu: toàn phết nhuộm tế bào vi khuẩn bạch cầu S saprophyticus (Nước tiểu, Gram) Khảo sát trực tiếp: phân ð Không có yêu cầu cụ thể lâm sàng: không thực khảo sát trực tiếp V cholerae (Phân, Gram) ð Yêu cầu tìm tả: soi tươi, nhuộm Gram ð Yêu cầu tìm Campylobacter: nhuộm Gram C jejuni (Phân, Gram) 18 Khảo sát trực tiếp: đường hô hấp C diphtheria (alkaline methylen blue nhuộm Gram) ð Quệt họng: nhuộm Gram Alkaline Methylen blue có yêu cầu tìm bạch hầu ð Các bệnh phẩm khác: nhuộm Gram tìm diện vi khuẩn bệnh phẩm Viêm tai (Gram) Khảo sát trực tiếp: đường hô hấp Nhuộm Gram (×100): đánh giá độ tin cậy mẫu Đàm không tin cậy (Gram, ×100) Đàm tin cậy (Gram, ×100) 19 Khảo sát trực tiếp: đường hô hấp (tt) Nhuộm Gram (×1000): tiên đoán tác nhân nhiễm trùng S pneumoniae (Đàm, Gram, ×1000) K pneumoniae (Đàm, Gram, ×1000) Khảo sát trực tiếp: đường hô hấp (tt) Nhuộm kháng acid có yêu cầu 20 Khảo sát trực tiếp: mủ tiết dòch S aureus (mủ, Gram, ×1000) ð Nhuộm Gram: kết có loại vi khuẩn khiết làm kháng sinh đồ trực tiếp từ bệnh phẩm ð Nhuộm kháng acid: có yêu cầu S agalactidae (mủ, Gram, ×1000) Khảo sát trực tiếp: đường sinh dục Niệu đạo bình thường (Gram) Quệt sinh dục nam: ð Viêm niệu đạo không lậu: Viêm niệu đạo không lậu (Gram) ≤ 4-10 bạch cầu song cầu Gram (-) nội tế bào quang trường ð Viêm niệu đạo lậu (98%): ≥ 10 bạch cầu / phát song cầu Gram (-) nội tế bào quang trường Viêm niệu đạo lậu (Gram) 21 Khảo sát trực tiếp: đường sinh dục (tt) Quệt âm đạo: ð Quệt âm đạo bình thường: ≤5 bạch cầu/quang trường có trực khuẩn Gram (+) ð Có khả viêm âm đạo Gardnerella vaginalis: ≤5 bạch cầu/quang trường, trự c khuẩn Gram (+) có nhiều trực khuẩn Gram (-) nhỏ Âm đạo bình thường (Gram) Viêm âm đạo G vaginalis (Gram) Viêm âm đạo C trachomatis (Gram) Viêm âm đạo N gonorrhoeae (Gram) ð Có khả viêm âm đạo Chlamydia trachomatis: ≥ 10 bạch cầu/quang trường ð Có khả viêm âm đạo N gonorrhoeae: ≥10 bạch cầu/quang trườ ng có song cầu Gram (-) nội tế bào Khảo sát trực tiếp: đường sinh dục (tt) Các bệnh phẩm khác: ð Quệt cổ tử cung: có song cầu Gram (-) nội tế bào chắn lậu (vì độ nhạy 50-70%, độ đặc hiệu 50-90%) Quệt cổ tử cung (Gram) ð Nước tiểu: đầu dòng cuối dòng, ly tâm lấy cặn lắng nhuộm Gram Nếu cặn lắng nước tiểu nam có song cầu Gram (-) nội tế bào có thề nghi ngờ bò lậu Cặn lắng nước tiểu (Gram) 22 ... AGS-1000 Biện luận kết Tính chất Gram ð Vi khuẩn Gram (-): bắt màu hồng ð Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím Hình dạng ð Cầu khuẩn: vi khuẩn hình cầu ð Trực khuẩn: vi khuẩn hình que Cách xếp Các tính chất... tìm tả Campylobacter) Vai trò khảo sát trực tiếp xét nghiệm vi sinh lâm sàng Khảo sát trực tiếp: máu Nhuộm Gram từ pha lỏng môi trường cấy máu sau ủ 35oC/12-16h Trực khuẩn Gram (-) Staphlococcus... meningitidis Khảo sát trực tiếp: dòch não tủy (tt) S pneumoniae Nhuộm Gram để tìm vi khuẩn diện dòch não tủy L monocytogenes N meningitidis H influenzae Trực khuẩn Gram (-) S agalactidae 17 Khảo sát trực