Điều chế và tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan 5 methylthiazol 2 ylamin và n (2z) 3 ethyl 5 methyl 1,3 thiazol 2(3h) yliden 4 hydroxy 2 methyl 2h 1,2 benzothiazin 3 carboxamid 1,1 dioxyd của meloxicam

Điều chế và tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan 5 methylthiazol 2 ylamin và n (2z) 3 ethyl 5 methyl 1,3 thiazol 2(3h) yliden 4 hydroxy 2 methyl 2h 1,2 benzothiazin 3 carboxamid 1,1 dioxyd của meloxicam

1 MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc thành phẩm, vấn đề nghiên cứu tác dụng dược lý hoạt chất chính, nhà nghiên cứu cịn phải khảo sát tác dụng dược lý tạp chất phát sinh nguyên liệu thành phẩm nguyên liệu đầu vào lẫn tạp tạp chất phân hủy phát sinh trình sản xuất lưu hành Đối với thuốc ung thư, tim mạch, kháng sinh, đái tháo đường, kháng viêm non-steroid, … thuốc có ngưỡng trị tiệu thấp với thay đổi nhỏ hàm lượng hoạt chất có tạp chất phát sinh thay đổi hiệu lâm sàng đặc tính an toàn thuốc gây tác dụng khác với hậu không lường trước Hơn nữa, việc sử dụng thuốc generic (thuốc hết hạn bảo hộ quyền sở hữu) cho bệnh nhân để giảm chi phí điều trị đòi hỏi quan kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng hiệu thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt hàm lượng hoạt chất tạp chất phân hủy Ví dụ: tạp chất thuốc trung hòa acid dạy Rolaid gây nôn mửa, tổn thương răng, lợi…được bệnh nhân phản ánh Hiện nay, vấn đề khảo sát tổng hợp tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm tương ứng chưa quan tâm nhiều Việt Nam Mặt khác, số tạp chất chuẩn chưa có có thường đắt tiền phải mua từ nước ngồi Trong đó, số chun luận Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm tương ứng meloxicam, metformin, … Do đó, việc nghiên cứu tổng hợp tiêu chuẩn hóa tạp chất góp phần tăng cường cơng tác kiểm tra chất lượng thuốc, giúp giảm bớt chi phí mua tạp chuẩn từ nước ngồi Vì vậy, đề tài “Điều chế tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan 5-methylthiazol-2-ylamin N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1dioxyd meloxicam” thực với mong muốn điều chế tiêu chuẩn hóa hai tạp chất liên quan meloxicam để ứng dụng vào việc kiểm tra nguyên liệu thành phẩm chứa hoạt chất CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tạp chất liên quan meloxicam 1.1.1 Qui định tạp chất liên quan theo số 1.1.1.1 Dược điển Việt Nam IV [3] Quy định tạp có meloxicam: - Tạp A: Ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1- dioxyd - Tạp B: 5-methylthiazol-2-ylamin - Tạp C: 4-hydroxy-2-methyl-N-ethyl-N’-(5-methyl-1,3-thiazol-2-yl)-2H-1,2- benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd 1.1.1.2 Dược điển Anh 2010 [8] Quy định tạp có meloxicam, tạp A, B, C, D, E, hai tạp A B giống với quy định Dược điển Việt Nam IV - Tạp C: N-[(2Z)-3,5-dimethyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl- 2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd - Tạp D: N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2- methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd - Tạp E: Methyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1- dioxyd 1.1.1.3 Dược điển Mỹ 2009 [23] Quy định tạp có meloxicam, tạp A, B, C, D, hai tạp A B giống với quy định Dược điển Việt Nam IV - Tạp C: Isopropyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat- 1,1-dioxyd - Tạp D: 4-methoxy-2-methyl-(5-methyl-1,3-thiazol-2yl)-2H-1,2-benzothiazin -3-carboxamid-1,1-dioxyd 1.1.2 u i 1.1.2.1 Các nguyên nhân phát sinh tạp Tạp chất xuất q trình sản xuất, tinh chế, đóng gói sản phẩm sản phẩm lưu hành thị trường Tạp chất xuất giai đoạn tổng hợp nguyên liệu ban đầu tồn dư cho vào phản ứng Đây tạp chất điển hình lưu ý nhiều kiểm tra độ tinh khiết hoạt chất, cần phải dựa vào đặc tính lý hóa chất thiết bị dụng cụ để tách sản phẩm tổng hợp Ngồi ra, tạp chất có nguồn gốc từ nguyên liệu ban đầu nguyên liệu ban đầu chưa tinh khiết Trong trình tinh chế sản phẩm sau tổng hợp không tránh khỏi tượng hóa chất dùng để tinh chế bị lẫn vào sản phẩm, việc chọn lựa phương pháp tinh chế thích hợp để làm sản phẩm q trình phức tạp địi hỏi nhiều kiến thức kỹ Sau sản phẩm lưu hành thị trường, tác động mơi trường bên ngồi va đập, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… hoạt chất sản phẩm bị phân hủy dẫn đến phát sinh số tạp chất, tạp chất gọi tạp chất phân hủy Hiện nay, với phương pháp lão hóa cấp tốc dự đoán số tạp chất phân hủy để từ có phương pháp bảo quản thích hợp 1.1.2.2 Quy trình tổng hợp meloxicam Theo Tibor Mezei cộng [21], sơ đồ tổng hợp meloxicam sau: Kiềm Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp meloxicam Tibor Mezei cộng (1) R = CH3 : Methyl-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1dioxyd (tạp E – Dược điển Anh) R = C2H5 : Ethyl-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1dioxyd (tạp A) (2) 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B) (3) 4-hydroxy-N-(5-methyl-1,3-thiazol-2-yl)-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid1,1-dioxyd (4) R = CH3: N-[(2Z)-3,5-dimethyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd (tạp C – Dược điển Anh) R = C2H5: N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2- methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd (tạp D – Dược điển Anh) Ngồi cịn có qui trình tổng hợp meloxicam theo Gunter Trummlitz cộng với sáng chế US Patent 4,233,299 [22] theo Joseph G Lombardino cộng với sáng chế US Patent 3591584 7/17 [19] 1.1.2.3 Nguyên nhân phát sinh tạp chất meloxicam Từ hình 1.1 cho thấy tạp chất A tạp chất B (theo quy định Dược điển nước) thành phần q trình tổng hợp meloxicam, trình kết tinh tinh chế cịn lẫn lượng nhỏ hai thành phần Đặc biệt, tạp chất B cịn xuất thủy phân meloxicam nối amid điều kiện mơi trường thích hợp Ttạp chất C, D (theo quy định Dược điển Anh 2010) xuất q trình tổng hợp meloxicam theo hai đường (hình 1.1) Các tạp chất giải thích tác nhân alcol sinh phản ứng tạo thành tạp chất điều kiện xúc tác thích hợp [24] 1.1.2.4 Độc tính [11][12] Các tạp chất meloxicam gây độc tính nuốt phải, gây dị ứng tiếp xúc, gây chóng mặt, ngủ gà ngủ gật, hôn mê, suy thận cấp, bất thường chức gan, suy giảm chức hô hấp Các tạp có hại với lồi sống nước, nguyên nhân gây tác hại lâu dài cho mơi trường nước nguy hiểm cho trẻ bụng mẹ ấ B (5-Methylthiazol-2-ylamin ) 1.1.3 Tạ 1.1.3.1 Công thức, tên khoa học Công thức phân tử: C4H6N2S hối lượng phân tử: 114,17 g/mol Danh pháp I AC: 5-methyl-2-thiazolamin Danh pháp thông thường: 5-methylthiazol-2-ylamin hay 2-amino-5-methylthiazol 1.1.3.2 nh chất l – hóa Dạng bột màu kem đến màu nâu, bền điều kiện thường, có mùi đặc trưng nhóm amin Tan methanol, cloroform Nhiệt độ nóng chảy: 92-96 °C 1.1.3.3 Giới hạn cho phép a Trong nguyên liệu meloxicam Theo chuyên luận meloxicam Dược điển Việt Nam IV [3], giới hạn cho phép tổng phần trăm tất tạp (phân tích H LC) khơng q 0,3%, tạp chất B khơng q 0,1% Dược điển Anh 2010 [8] Dược điển Mỹ 2009 [23] quy định tổng phần trăm tất tạp khơng q 0,3%, tạp chất B khơng 0,1%, qui định giới hạn cho phép tạp chất B tương tự Dược điển Việt Nam IV b Trong chế phẩm chứa meloxicam Theo chuyên luận viên n n meloxicam Dược điển Việt Nam IV [3], giới hạn cho phép tổng phần trăm tất tạp (phân tích H LC) khơng q , tạp B khơng q 0,15% 1.1.3.4 Phương pháp tổng hợp tạp chất B Theo Arthur I.Vogel [6] -amino- -methylthia ol tổng hợp từ phản ứng đóng vịng thioure monocloroaceton ] Trong đó, cloroaceton tổng hợp phản ứng clor hóa aceton nhiệt độ thấp Cloroaceton công nghiệp cất lại trước sử dụng cho phản ứng tổng hợp, nhiệt độ sơi 118-120 °C Quy trình tổng hợp sau: phân tán khuấy từ, đun hồi lưu thêm từ từ g thioure , g( ml nước cất máy ml) monocloroaceton khoảng phút Trong trình phản ứng thioure tan sinh nhiệt Đun hồi lưu dung dịch màu vàng giờ, sau làm lạnh nước đá, khuấy đều, thêm g bột natri hydroxyd Chuyển vào bình lắng gạn, thêm nước đá, thu lớp dầu phía chiết lớp nước với ml ether x lần Làm khan lớp dầu dịch chiết ether magnesi sulphat khan Làm bay ether bếp cách thủy cất dầu tồn dư áp suất giảm 2-amino-5-methylthia ol thu 130suất °C áp mmHg, sau làm lạnh nước đá để kết tinh thành dạng rắn Theo sáng chế số PCT/JP99/05895 [25], -amino- -methylthia ol tổng hợp từ phản ứng đóng vịng thioure -cloropropionaldehyd Trong -cloropropionaldehyd điều chế từ phản ứng clor hóa propionaldehyd khí clor điều kiện thích hợp Trong nghiên cứu cải tiến phương pháp tổng hợp -amino- -methylthia ol từ n-propanol phản ứng oxy hóa clor hóa với acid hypoclorơ (mới sinh cho khí clor phản ứng với nước), sau phản ứng đóng vịng với thioure cho hiệu suất tồn phần 55% [27] 1.1.3.5 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo DĐVN IV [3] Phương pháp: Sắc ký lỏng Pha động A: Dung dịch kali dihydro phosphat , , điều chỉnh đến pH 6,0 dung dịch natri hydroxyd 8,5% Pha động B: Methanol Dung dịch thử: Pha dung dịch chế phẩm có nồng độ 0,4% hỗn hợp methanol 40% - dung dịch natri hydroxyd 0,4 M (50 : 3) Pha loãng lần dung dịch methanol 40% Dung dịch đối chiếu (1): Pha lỗng thể tích dung dịch thử thành 100 thể tích methanol 40% Pha lỗng thể tích dung dịch thành 10 thể tích methanol 40% Dung dịch đối chiếu (2): Pha dung dịch tạp chất chuẩn meloxicam có nồng độ 0,4% hỗn hợp methanol 40% - dung dịch natri hydroxyd 0,4 M (50 : 3) Pha loãng lần dung dịch methanol 40% Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; µm), cột Inertsil ODS-2 phù hợp Đầu dò quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 260 nm 350 nm Thể tích tiêm: 10 µl Tiến hành sắc ký theo chương trình bảng 1.1 Bảng 1.1 Chương trình dung môi kiểm tạp chất B meloxicam theo Dược điển Việt Nam IV Thời gian động A Pha động B (phút) % (tt/tt) % (tt/tt) 60 40 2,5 60 40 12 30 70 Tiêm dung dịch đối chiếu (2), (1) dung dịch thử Tiến hành sắc ký với khoảng thời gian phút, dung dịch thử khoảng 20 phút đến tạp C rửa giải Phép thử có hiệu lực dung dịch đối chiếu (2) cho sắc ký đồ giống với sắc ký đồ đối chiếu cung cấp với tạp chất B meloxicam chuẩn Giới hạn tạp B: Trên sắc ký đồ dung dịch thử bước sóng 260 nm, diện tích pic pic tương ứng với pic tạp chất B không lớn diện tích pic thu sắc đồ dung dịch đối chiếu (1) bước sóng 350 nm (0,1%) 1.1.3.6 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo Dược điển Anh 2010 Phương pháp: Sắc ký lỏng Pha động A: Dung dịch kali dihydrophosphat g/l điều chỉnh đến pH 6,0 dung dịch natri hydroxyd M Pha động B: Methanol Dung dịch thử: hòa tan 40 mg chất cần kiểm tra vào hỗn hợp ml methanol 0,3 ml natri hydroxyd M, pha loãng thành 20 ml với methanol Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng ml dung dịch thử thành 100 ml với methanol Pha loãng ml dung dịch thành 100 ml với methanol Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan mg chất cần kiểm tra mg tạp B vào hỗn hợp ml methanol 0,3 ml natri hydroxyd M, pha loãng thành 25 ml với methanol 10 Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; µm) Nhiệt độ cột 45 °C Tốc độ dòng 1,0 ml/phút Đầu dò quang phổ đặt bước sóng 260 nm 350 nm Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Tiến hành sắc ký dung dịch theo chương trình bảng 1.2 Bảng 1.2 Chương trình dung môi kiểm tạp chất B meloxicam theo Dược điển Anh 2010 Thời gian động A động B (phút) (%) (%) 0-2 60 40 2-10 60  30 40  70 10-15 30 70 Trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (b), thời gian lưu tương đối pic tạp B so với pic meloxicam (thời gian lưu khoảng phút) khoảng 0,5 Ở bước sóng 260 nm, hệ số phân giải pic meloxicam pic tạp B không nhỏ , Giới hạn tạp B: Trên sắc ký đồ dung dịch thử bước sóng 260 nm, diện tích pic tạp chất B không lớn diện tích pic thu sắc đồ dung dịch đối chiếu (a) bước sóng 350 nm (0,1%) 1.1.3.7 Phương pháp xác định giới hạn tạp chất B theo Dược điển Mỹ [23] Phương pháp: Sắc ký lỏng Pha động : Dung dịch kali dihydrophosphat , , điều chỉnh đến pH 6,0 dung dịch natri hydroxyd N Pha động : Methanol Dung dịch phù hợp hệ thống: Cân mg meloxicam chuẩn mg tạp B chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan ml methanol 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd N, thêm methanol đến vạch, lắc Dung dịch chuẩn: Cân xác mg meloxicam, cho vào bình định mức 20 ml, hịa tan ml methanol 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd N, thêm methanol đến vạch, lắc Pha loãng ml dung dịch thành 100 ml với methanol Dung dịch thử: Cân xác mg meloxicam, cho vào bình định mức 20 ml, hịa tan ml methanol 0,3 ml dung dịch natri hydroxyd N, thêm methanol đến vạch, lắc 77 (a) (b) 78 Hình 3.27 Sắc ký đồ, biểu đồ biểu di n độ tinh khiết pic phổ UV thời gian lưu tạp chất B D mẫu chuẩn (a) Sắc ký đồ bước sóng 260 nm (b) Sắc ký đồ bước sóng 360 nm 79 (a) (b) 80 Hình 3.28 Sắc ký đồ, biểu đồ biểu di n độ tinh khiết pic phổ UV thời gian lưu tạp chất B D mẫu thử (a) Sắc ký đồ bước sóng 260 nm (b) Sắc ký đồ bước sóng 360 nm 81 (a) (b) 82 Hình 3.29 Sắc ký đồ, biểu đồ biểu di n độ tinh khiết pic phổ UV thời gian lưu tạp chất B D mẫu thử thêm chuẩn (a) Sắc ký độ bước sóng 260 nm (b) Sắc ký đồ bước sóng 360 nm 83  Tính tuyến tính Pha dung dịch có nồng độ meloxicam 1000 µg/ml, nồng độ tạp chất B 0,8 µg/ml; 0,9 µg/ml; µg/ml; 1,1 µg/ml; 1,2 µg/ml, nồng độ tạp chất D 0,4 µg/ml; 0,45 µg/ml; 0,5 µg/ml; 0,55 µg/ml; 0,6 µg/ml Thực tiêm lần cho mẫu, lấy giá trị trung bình Kết thu bảng 3.29 Đồ thị biểu di n diện tích pic theo nồng độ tạp chất B D trình bày hình 3.30 Bảng 3.29 Kết xác định diện tích pic tạp chất B D theo nồng độ Tạp chất B Tạp chất D Diện tích pic Nồng độ Diện tích pic trung bình Nồng độ (µg/ml) (μA *giây) (µg/ml) 0,8 41778 0,40 20577 0,9 47129 0,45 22477 1,0 51926 0,50 25260 1,1 58227 0,55 27918 1,2 63028 0,60 30423 trung bình (μA *giây) Diện tích pic (µAu*giây) 70000 y = 53598x - 1180.4 R² = 0.9984 60000 (a) 50000 40000 y = 50266x + 198 R² = 0.9968 30000 (b) 20000 10000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.1 1.2 1.3 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.30 Đồ thị biểu di n diện tích pic theo nồng độ tạp chất B D (a) Đường tuyến tính tạp chất B Khả (b) Đường tuyến tính tạp chất D đ ờng bi u diễn diện tích pic theo nồng độ phân tích tạp chất B, D 84 Bình phương hệ số tương quan tạp chất B D R2 = 0,9984 R2 = 0,9968 , ≤ ≤ , chấp nhận tuyến tính Xét hàm ANOVA phần mềm MS excel: Kiểm tra tính thích hợp phương trình hồi quy: FS (B) = 2,78.10-5 FS - (D) = 7,82.10-5 < α ,  phương trình hồi quy tương thích Kiểm tra ý ngh a hệ số B B0 trắc nghiệm t (phân phối Student) Giá trị hệ số B có tB = 0,42 tC = 0,83 > α  hệ số B khơng có ý , ngh a mặt thống kê Giá trị hệ số B0 có tB = 2,78.10-5 tC = 7,82.10-5 < α ,  hệ số B0 có ý ngh a mặt thống kê Như vậy, miền giá trị quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B 0,8 – 1,2 µg/ml tạp chất D 0,4 – 0,6 µg/ml hương trình hồi quy tuyến tính biểu di n tương quan diện tích pic theo nồng độ phân tích tạp chất B ŷ = 53598x tạp chất D ŷ = 50266x  Giới hạn phát giới hạn định lượng Kết thu sau tiến hành sắc ký mẫu thử nồng độ giảm dần sau: - Giới hạn phát (LOD) tạp chất B D 0,075 µg/ml - Giới hạn định lượng (LOQ) tạp B D 0,200 µg/ml Tiêm lặp lại mẫu nồng độ LOD LOQ lần để kiểm tra kết khảo sát Số liệu cụ thể trình bày bảng 3.30 3.31 Bảng 3.30 Giá trị S/N giới hạn phát lần đo lặp lại Lần đo NB SB S/N tạp chất B ND SD S/N tạp chất D Trung bình 95 95 95 95 95 95 95 327 365 269 353 293 327 322 3,44 3,84 2,83 3,72 3,08 3,44 3,39 190 190 190 190 190 190 190 645 604 681 688 761 574 659 3,39 3,18 3,58 3,62 4,01 3,02 3,47 85 Bảng 3.31 Giá trị S/N giới hạn định lượng lần đo lặp lại Lần đo NB SB S/N tạp chất B ND SD S/N tạp chất D 95 922 9,71 105 958 9,12 95 924 9,73 105 882 8,40 95 952 10,02 105 1049 9,99 95 905 9,53 105 910 8,67 95 941 9,91 105 1106 10,53 95 968 10,19 105 867 8,26 Trung bình 95 935 9,85 105 962 9,16 Nhận xét: LOD LOQ thấp giới hạn cho phép tạp chất B D ngun liệu meloxicam (đều khơng q µg/ml) chế phẩm (khơng q 1,5 µg/ml tạp chất B µg/ml tạp chất D)  Độ xác Kết bảng 3.32 cho thấy RSD hàm lượng tạp chất B D mẫu thử 1,61% 5,43%, nhỏ mức cho phép 7,3% nồng độ chất phân tích ≤ µg/ml Vậy quy trình đạt u cầu độ xác [14] Bảng 3.32 Kết khảo sát độ xác quy trình định lượng tạp chất B D (phụ lục 7) Số lần đo Trung bình RSD Trung bình RSD Hàm lượng tạp chất B mẫu thử (µg/ml) Ngày Ngày Ngày 1,05 1,04 1,07 1,02 1,01 1,05 1,02 1,04 1,04 1,04 1,06 1,03 1,02 1,04 1,07 1,04 1,05 1,03 Hàm lượng tạp chất D mẫu thử (µg/ml) Ngày Ngày Ngày 0,45 0,50 0,45 0,46 0,42 0,45 0,50 0,44 0,48 0,50 0,46 0,45 0,49 0,49 0,48 0,46 0,44 0,51 1,03 1,04 1,05 0,48 0,46 0,47 1,11% 1,48% 1,61% 4,51% 5,92% 4,81% 1,04 0,47 1,61% 5,43% 86  Độ Kết bảng 3.33 cho thấy tỉ lệ phục hồi hai tạp chất B D nằm khoảng cho phép 80-110% ứng với nồng độ chất phân tích tạp chất B µg/ml tạp chất C 0,5 µg/ml Như quy trình đạt yêu cầu độ ] Bảng 3.33 Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời tạp chất B D Mẫu Tạp chất B Tỷ lệ thêm chuẩn (%) Lượng sẵn có (µg/ml) Lượng thêm vào (µg/ml) Tổng lượng sau thêm chuẩn (µg/ml) Diện tích pic sau thêm chuẩn 1,04 0,80 0,79 0,81 1,00 0,99 1,01 1,20 1,19 1,21 0,92 0,92 0,93 1,02 1,02 1,03 1,12 1,12 1,13 49528 50537 52232 56206 54586 54878 61434 60590 59614 0,47 0,40 0,39 0,41 0,50 0,49 0,51 0,60 0,59 0,61 0,44 0,43 0,44 0,49 0,48 0,49 0,54 0,53 0,54 80 100 120 TB SD RSD Tạp chất D 80 100 120 TB SD RSD Nhận xét: Quy trình định lượng tạp chất B D Nồng độ tìm sau thêm chuẩn (µg/ml) 0,92 0,94 0,97 1,02 1,02 1,05 1,11 1,15 1,15 Tỷ lệ phục hồi (%) 100,39 102,99 105,30 100,33 100,29 102,26 99,26 101,34 101,84 101,56 0,02 1,79% 20717 0,41 94,75 22492 0,43 99,61 21530 0,45 101,70 26611 0,45 91,88 22400 0,46 96,13 23193 0,53 108,04 25450 0,51 94,64 27955 0,53 100,41 26750 0,56 102,99 98,90 0,05 5,10% meloxicam phương pháp H LC có tính đặc hiệu, tuyến tính khoảng nồng độ đo, có giới hạn phát 87 giới hạn định lượng thấp, độ xác độ đáp ứng yêu cầu đề ra, áp dụng quy trình để tiến hành định lượng đồng thời tạp chất B D nguyên liệu thành phẩm meloxicam 88 CHƯƠNG - ÀN LU N 4.1 Điều chế tạp chất liên quan B D meloxicam 4.1.1 Tinh chế 5-methylthiazol-2ylamin (tạp chất B meloxicam) 5-methylthiazol-2ylamin hóa chất cơng nghiệp, d tổng hợp tinh chế hương pháp tinh chế đơn giản phổ biến hiệu lựa chọn kết tinh lại 5methylthiazol-2-ylamin d tan methanol, nên chọn methanol làm dung môi kết tinh lại Ether dược dùng để kết tinh lại hóa chất cần ý đến tính chất d cháy 4.1.2 Tổng h p tinh chế N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd (tạp chất D n Anh 2010) Mặc dù tạp chất D chưa có quy trình tổng hợp việc tổng hợp thực dựa chế N-alkyl hóa nitơ Tuy nhiên khơng tránh khỏi phát sinh lượng nhỏ sản phẩm phụ tạp chất C (Dược điển Việt Nam IV [3]) alkyl hóa nitơ nhóm carboxamid Dựa vào phổ MS, 1H NMR 13 C NMR chưa thể xác định sản phẩm tổng hợp tạp chất D (Dược điển Anh 2010) tạp chất C (Dược điển Việt Nam IV) Phổ NOESY (7,48 ppm - H- ’): 4,2; 2,32 ppm cho thấy proton H- ’ có tương tác với proton H (CH3-C- ’) H (-CH2-N-thiazol) chứng tỏ nhóm -CH2- ethyl gắn N-thiazol, khẳng định sản phẩm tổng hợp tạp chất D Meloxicam tan tốt DMF tạp chất D khó tan dung mơi này, sử dụng để loại meloxicam khỏi sản phẩm tổng hợp, nhiên loại 90% meloxicam sản phẩm Sắc ký cột cổ điển sử dụng để loại hoàn tồn meloxicam khỏi sản phẩm Dung mơi chọn dicloromethan : MeOH (20 : 1) rẻ tiền so với tricloromethan: MeOH n-hexan: aceton Một tạp chất khác tạp chất D với lượng nhỏ không thấy sắc ký lớp mỏng không loại qua sắc ký cột Tiến hành sắc ký cột lần thứ hai với cột dài m loại hàm lượng thu nhỏ mg 89 Trong giai đoạn tổng hợp tạp D, NaH thêm vào phân ly thành H- tác nhân ba mạnh môi trường khan với vai trò phân ly proton H+ nitơ giúp cho alkyl hóa nitơ d dàng 4.2 Quy t nh xác định độ tinh khiết tạp chất B D - Khi tiến hành sắc ký pha động MeOH – nước, pic tạp chất B D bị k o đuôi Hiện tượng chất phân tích bị lưu giữ lâu pha t nh, phần tử chất phân tích khơng rửa giải lúc dẫn đến pic bị k o đuôi Để khắc phục tượng này, độ phân cực hệ dung môi sắc ký giảm cách thay nước isopropanol, nhiên pic k o Sau tác nhân điều chỉnh pH pha động pH kiềm thêm vào triethylamin khắc phục tượng k o đuôi pic Điều giải thích sau: chất tạp B D amin có tính kiềm nên tạo liên kết hydro với pha t nh, triethylamin thêm vào có tác dụng cạnh tranh tương tác với tạp chất B, D pha t nh, hạn chế liên kết hydro chất phân tích với pha t nh, giúp phân tử chất phân tích rửa giải lúc - Nồng độ triethylamin sử dụng phải phù hợp với chất tạp chất B, D chất cột Qua khảo sát cho thấy chất phân tích 5methylthiazol-2-ylamin, nồng độ triethylamin 0,8 mM làm giảm hệ số k o đuôi tốt nồng độ triethylamin mM Triethylamin chất d bay tạo mơi trường kiềm cho vi khuẩn, pha động thêm triethylamin sử dụng vòng - ngày để đảm bảo hệ thống HPLC không bị nhi m khuẩn Tạp chất B tan tốt methanol, nhiên tạp chất D tan hỗn hợp methanol + natrihydroxyd M Lượng natri hydroxyd 1M thêm vào không cố định mà phụ thuộc vào nồng độ tạp chất D (khoảng ml NaOH 1M cho mg tạp chất D), cần khảo sát nồng độ natri hydroxyd thích hợp để lượng mẫu tan hồn tồn, tránh sai số đo - Khi sử dụng pha động có pH cao, cột sắc ký cần phải có khả chịu pH rộng để không làm giảm hiệu cột Cột Gemini-N thể chịu pH từ - 14 lựa chọn có 90 Tốc độ dòng khảo sát với cột dài 250 mm ml/phút nên khảo sát với cột ngắn ( cm), tốc độ dòng phải giảm để thu pic có thời gian lưu phù hợp Khi tiến hành khảo sát tốc độ dòng 0,8 ml/phút, tạp chất B D rửa giải nhanh (tB = 3,287 phút tD = 8,373 phút), ảnh hưởng đến độ phân giải độ tinh khiết pic Do tốc độ dịng giảm xuống 0,6 ml/phút Với điều kiện pic tạp chất B, D tách hoàn toàn pic tạp mẫu trắng mặt khác, pic tạp chất B, D tách hoàn toàn với pic meloxicam 4.3 Quy t nh định lượng tạp chất B D t ong nguyên liệu chế phẩm meloxicam - Qua khảo sát nồng độ phân tích, dung dịch chuẩn có nồng độ meloxicam : tạp chất B : tạp chất D 1000 µg/ml : µg/ml : 0,5 µg/ml cho chiều cao pic diện tích pic tạp chất B, D chấp nhận (chiều cao pic diện tích pic tạp chất B, D 0,005 AU 53316 µAU*giây; 0,0025 AU 25014 µAU*giây) Qua đánh giá quy trình phân tích chứng minh nồng độ phân tích này, phương pháp đáp ứng yêu cầu độ xác độ Meloxicam chất k m bền với ánh sáng, thủy phân nối amid, tạo sản phẩm phân hủy có tạp chất B Do q trình chuẩn bị mẫu khơng tiến hành sắc ký cần bảo quản mẫu nhiệt độ C, tránh ánh sáng 91 CHƯƠNG - KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LU N Sau thời gian thực đề tài, chúng tơi hồn thành mục tiêu đề luận văn, với kết sau: - Đã tinh chế hóa chất cơng nghiệp 2-amino-5-methyl-1,3-thia ol đạt độ tinh khiết 99%, dùng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm tạp chất B meloxicam - Đã tổng hợp N-[(2Z)-3-ethyl-5-methyl-1,3-thiazol-2(3H)-yliden]-4- hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxyd đạt độ tinh khiết 98%, dùng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm tạp chất D meloxicam (Dược điển Anh 2010 [9]) - Đã xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B D phương pháp HPLC - Đã dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp chất B D để ứng dụng kiểm nghiệm tạp chất liên quan meloxicam - Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời tạp chất B D nguyên liệu meloxicam thành phẩm phương pháp H LC KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đưa số đề nghị sau: - Tiếp tục ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan B D nhiều mẫu nguyên liệu thành phẩm meloxicam - Tiếp tục nghiên cứu theo d i độ ổn định chất điều chế để tính tốn chu kỳ đánh giá lại chất chuẩn - Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp, tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan khác xây dựng quy trình định lượng đồng thời tạp chất liên quan meloxicam ... *giây) Ngày Ngày Ngày 55 43 4 04 53 80 931 53 98 859 56 057 36 53 90179 53 857 16 53 896 05 550 7166 53 756 94 54 191 43 55 0 54 05 537 9 34 9 55 559 03 55 0 838 7 54 5 058 6 55 4 93 45 5 54 928 8 54 66099 53 629 85 540 441 0 53 4 827 9 54 727 00... 54 727 00 54 27 628 53 51 958 53 49 761 55 659 80 54 7 32 2 6 10 53 555 45 555 9060 54 7 4 53 4 11 53 9 6 53 2 56 186 84 52 9 74 72 12 53 26 3 12 56 26 649 53 11 0 54 Trung bình 54 43 9 14 55 036 47 53 927 36 54 46766 RSD 1,78% 1 ,56 % 1, 14% 1,70%... 56 0 0 52 3 1 ,2 8 ,2 31 9 93 5, 081 55 944 75 1 ,2 8,7 3 326 2 5, 070 55 878 03 1 ,2 8 ,4 32 6 37 Trung 5, 0 72 55 78 731 1 ,2 8 ,5 32 7 53 bình RSD 0,10% 0 ,38 % 0, 42 % 2, 13% 1 , 53 % : độ ph? ?n giải pic tạp chất B với pic tạp