Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan a và g của amlodipin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ DIỂM TRANG TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN A VÀ G CỦA AMLODIPIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ DIỂM TRANG TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN A VÀ G CỦA AMLODIPIN Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số : 60720410 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thầy hướng dẫn: PGS TS HÀ DIỆU LY TS LÊ THỊ THU CÚC Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Lê Thị Diểm Trang LỜI CẢM ƠN Đề tài “Tổng hợp tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan A G amlodipin” thực khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Để hồn thành luận văn, tơi nhận nhiều động viên, giúp đỡ cá nhân tập thể Đầu tiên, chân thành cám ơn người thầy nhiệt tình hướng dẫn tơi thời gian qua, người thầy tạo cho niềm tin động lực, PGS.TS Hà Diệu Ly TS Lê Thị Thu Cúc Qua đây, xin gửi lời cám ơn đến anh chị khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cám ơn đến ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, ban lãnh đạo trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, thầy cô giảng dạy, tạo điều kiện cho q trình học tập Sau cùng, tơi gửi lời cảm ớn đến gia đình, bạn bè, người ln bên tơi, động viên khuyến khích tơi q trình thực đề tài nghiên cứu TÁC GIẢ Lê Thị Diểm Trang i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình, sơ đồ, đồ thị MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tạp chất 1.1.1 Nguồn gốc tạp chất 1.1.2 Phân loại tạp chất 1.1.3 Các qui định tạp chất 1.1.3.1 Qui định tạp chất dƣợc chất theo ICH Q3A(R2) 1.1.3.2 Qui định tạp chất dƣợc phẩm theo ICH Q3B(R2) 1.2 Tổng quan amlodipin besilat 1.2.1 Tính chất vật lý 1.2.2 Tác dụng dƣợc lý 1.2.3 Dƣợc động học 1.2.4 Các tạp chất liên quan nguyên liệu amlodipin besilat theo Dƣợc điển Anh 1.3 Tổng quan tạp A amlodipin (phthaloyl amlodipin) 11 1.4 Tổng quan tạp G amlodipin 14 1.5 Qui trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan amlodipin nguyên liệu amlodipin theo Dƣợc điển Anh 2016 18 1.6 Chất đối chiếu 19 ii 1.6.1 Định nghĩa 19 1.6.2 Phân loại 20 1.6.3 Các phƣơng pháp sử dụng để định danh chất đối chiếu 20 1.6.4 Các phƣơng pháp xác định độ tinh khiết chất đối chiếu 20 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu – Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất dung mơi 22 2.1.3 Trang thiết bị 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Qui trình tổng hợp tạp A tạp G amlodipin 24 2.2.1.1 Qui trình tổng hợp tạp A 24 2.2.1.2 Qui trình tổng hợp tạp G 27 2.2.2 Thử tinh khiết 28 2.2.3 Xác định cấu trúc 29 2.2.4 Hiệu suất phản ứng 29 2.2.3 Xây dựng qui trình định lƣợng tạp A tạp G HPLC 29 2.2.3.1 Xây dựng qui trình định lƣợng tạp A tạp G 29 2.2.3.2 Thẩm định qui trình định lƣợng tạp A tạp G 30 2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho tạp A tạp G 33 2.2.5 Thiết lập chất đối chiếu tạp A tạp G 34 2.2.5.1 Đánh giá độ đồng trình đóng lọ 34 2.2.5.2 Đánh giá chất chuẩn thơng qua liên phịng thí nghiệm 35 2.2.5.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu – Xác định giá trị ấn định 35 2.2.6 Ứng dụng chất đối chiếu tạp A G tổng hợp để kiểm nghiệm tạp chất A G nguyên liệu amlodipin besilat 37 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 iii 3.1 Tổng hợp tạp A amlodipin 38 3.1.1 Qui trình tổng hợp tạp A 38 3.1.2 Tinh chế sản phẩm tổng hợp 43 3.1.3 Xác định sơ độ tinh khiết sản phẩm tổng hợp 44 3.1.4 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp 45 3.1.5 Xác định độ tinh khiết tạp A tổng hợp 50 3.1.6 Xác định hàm ẩm tạp A tổng hợp phƣơng pháp TGA 51 3.1.7 Hiệu suất 52 3.2 Tổng hợp tạp G amlodipin 52 3.2.1 Qui trình tổng hợp tạp G 52 3.2.2 Tinh chế sản phẩm tổng hợp 53 3.2.3 Xác định sơ độ tinh khiết sản phẩm tổng hợp 54 3.2.4 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp 55 3.2.5 Xác định độ tinh khiết tạp G tổng hợp 60 3.2.6 Xác định hàm ẩm tạp G tổng hợp phƣơng pháp TGA 61 3.2.7 Hiệu suất 62 3.3 Xây dựng qui trình định lƣợng tạp A G HPLC 62 3.3.1 Thẩm định qui trình định lƣợng tạp A HPLC 62 3.3.2 Thẩm định qui trình định lƣợng tạp G HPLC 70 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho tạp chất A G amlodipin 78 3.5 Thiết lập chất đối chiếu tạp A tạp G 78 3.5.1 Tạp A 78 3.5.1.1 Đánh giá độ đồng lọ 78 3.5.1.2 Đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm 80 3.5.1.3 Xác định giá trị ấn định – giá trị công bố 81 3.5.2 Tạp G 82 3.5.2.1 Đánh giá độ đồng lọ 82 iv 3.5.2.2 Đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm 84 3.5.2.3 Xác định giá trị ấn định – giá trị công bố 86 3.6 Ứng dụng chất đối chiếu tạp A G tổng hợp để kiểm nghiệm tạp chấtA G nguyên liệu amlodipin besilat 86 CHƢƠNG BÀN LUẬN 90 4.1 Tổng hợp tạp chất A G amlodipin 90 4.1.1 Tổng hợp tạp chất A amlodipin 90 4.1.2 Tổng hợp tạp chất G amlodipin 92 4.2 Tinh chế sản phẩm 95 4.3 Xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng xác định độ tinh khiết tạp chất A G amlodipin 95 4.4 Xây dựng tiêu chuẩn thiết lập chất đối chiếu tổng hợp 95 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ nguyên (nghĩa tiếng Việt) Từ viết tắt ANAD : Abbreviated New Drug Application BP : British Pharmacopoeia (Dƣợc điển Anh) CAS : Chemical Abstracts Service (mã tra cứu hóa học) CH2Cl2 : Diclorometan d : Doulet (mũi đôi) DHP : Dihydropyridin DSC : Differential Scanning Calorimetry (quét nhiệt vi sai) dt : Doulet triplet (mũi đôi ba) EP : European Pharmacopoeia (Dƣợc điển Châu Âu) EtOAc : Ethyl acetat FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lí Thực phẩm Dƣợc) GC : Gas chromatography (sắc ký khí) GLP : Good laboratory practice (thực hành tốt phịng thí : High Performance Liquid Chromatography (sắc ký nghiệm) HPLC lỏng hiệu cao) ICH : International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (Tổ chức quốc tế việc hòa hợp tiêu chuẩn Dƣợc phẩm) IEC : International Electrotechnical Commission (Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế) IR : Infrared (hồng ngoại) vi ISO : International Organization for Standardization (Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế) m : Multi (mũi đa) MS : Mass Spectrum (khối phổ) MS-ESI : Mass Spectrum – Electrospray Ionization (khối phổ ion hóa điện tử) NAD : New Drug Application NMR : Nuclear Magnetic Resonance (cộng hƣởng từ hạt nhân) PDA : Photo Diode Array (Dãy diod quang) RSD : Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tƣơng đối) Rf : Retention factor (hệ số lƣu giữ) s : Single (mũi đơn) SD : Standard deviation (độ lệch chuẩn) SKLM : Sắc ký lớp mỏng t : Triplet (mũi ba) Tạp A : 3-ethyl 5-methyl (4RS)-4-(2-chlorophenyl)-2-[[2-(1,3dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)ethoxy]methyl]-6methyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate, (Phthaloyl amlodipin) Tạp G : dimethyl 4-(2-chlorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4- dihydropyridine-3,5-dicarboxylate TGA : Thermo Gravimetric Analysis (phân tích nhiệt trọng UV : Ultraviolet (tử ngoại) UV-Vis : Ultraviolet – Visible (tử ngoại - khả kiến) δC (δH) : Độ dịch chuyển hóa học carbon (proton) lƣợng) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 46 Bảng 3.24 Kết xác định độ đồng hàm lượng lọ tạp G Số thứ tự Kết Kết Xử lý thống kê (%) 2(%) 99,28 99,03 99,36 99,44 99,30 99,39 99,10 99,39 99,66 98,92 n = 24; xTB = 99,27%; 98,76 99,48 SD = 0,22%; RSD = 99,06 99,20 0,22% 99,55 99,39 (với p = 0,95) 99,35 99,42 10 99,52 99,07 11 99,01 99,42 12 99,32 99,17 Loại giá trị bất thường trắc nghiệm Dixon: xếp kết theo thứ tự tăng dần, xét hai giá trị nhỏ lớn theo trắc nghiệm Dixon Gmin = 0,33 < G0,05 = 0,451 Gmax = 0,22 < G0,05 = 0,451 Vậy khơng có giá trị bất thường kết định lượng đồng lọ Đánh giá độ đồng lọ theo phương pháp thống kê phân tích ANOVA yếu tố, so sánh giá trị Ftn Ftc Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 47 Bảng 3.25 Phân tích phương sai yếu tố theo ANOVA đánh giá độ đồng lọ tạp G Bình Tổng bình Bậc phương tự 0,2695 11 0,0245 nhóm 0,8311 12 0,0693 Tổng cộng 1,1006 23 Nguồn sai số Giữa nhóm phương Ftn Ftc trung bình 0,3538 2,7173 Trong Nhận xét: Ftn = 0,3538 < Ftc = 2,7173 Vậy lọ trình đóng đồng 3.5.2.2 Đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm Kết xác định độ tinh khiết tạp G từ phịng thí nghiệm (Phụ lục 6) Bảng 3.26 Giá trị thông số hệ thống sắc ký định lượng tạp G phịng thí nghiệm u cầu PTN1 PTN2 N > 1200 2392 2388 As: 0,8 - 1,5 1,235 1,239 RSD ≤ 2% 0,21% 0,33% PTN1: Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh PTN2: Khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Nhận xét: phương pháp định lượng đạt tính phù hợp hệ thống hai phịng thí nghiệm nên tiếp tục tiến hành định lượng tạp G Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 48 Bảng 3.27 Kết định lượng tạp G hai phịng thí nghiệm Mẫu PTN1 PTN2 99,26% 99,21% 99,65% 99,32% 99,04% 99,31% 99,47% 99,33% 99,48% 99,64% 99,06% 99,34% Trung bình 99,33% 99,36% Việc đánh giá độ đồng lọ phòng thí nghiệm thực qua việc đánh giá kết định lượng trung bình phịng thí nghiệm, sử dụng phương pháp thống kê phân tích ANOVA, so sánh giá trị Ftn Ftc Bảng 3.28 Kết phân tích ANOVA đánh giá độ đồng lọ liên phịng tạp G Nguồn sai số Tổng bình Bậc tự Bình phƣơng phƣơng 0,2617 0,0523 0,0030 0,0030 Độ lệch 0,1509 0,0302 Tổng cộng 0,4156 11 Giữa nhóm Trong nhóm Ftn Ftc trung bình 0,099 6,607 Ftn = 0,0996 < Ftc = 6,6079 Vậy kết định lượng phòng thí nghiệm khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Qui trình phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng chất phân tích khơng phụ thuộc vào phịng thí nghiệm tham gia đánh giá Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 49 3.5.2.3 Xác định giá trị ấn định – giá trị cơng bố Bảng 3.29 Kết tính giá trị ấn định hàm lượng tạp G (n = 12) Số lần thay đổi x* x* x* x* x* - 1,5s* 99,04 99,02 99,02 x* + 1,5s* 99,61 99,65 99,65 Trung bình 99,343 Độ lệch s 0,194 x* 99,325 99,337 99,337 99,337 s* 0,193 0,211 0,211 0,211 Nhận xét, sau ba lần thay đổi, s* = 0,211 khơng thay đổi, giá trị x* chọn 99,337% - Giá trị ấn định: 99,337% - Độ lệch chuẩn thực: 0,211 - Độ không đảm bảo đo U x  1,25s * / p = 0,076 Từ kết tính z-score, kết tất 12 giá trị có |z| < 2,0 Như tạp G đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng xác định 99,34% tính theo chế phẩm ngun trạng, độ khơng đảm bảo đo 0,076, độ lệch chuẩn 0,211 (n = 12) Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn kèm theo phiếu kiểm nghiệm Bảo quản lọ chuẩn nhiệt độ - 0C, tránh ánh sáng 3.6 Ứng dụng chất đối chiếu tạp A G tổng hợp để kiểm nghiệm tạp chất A G nguyên liệu amlodipin besilat Ứng dụng tạp A tạp C tổng hợp kiểm tra tạp chất số nguyên liệu amlodipin besilat thị trường theo Dược điển Anh 2016 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tính phù hợp hệ thống Tiến hành sắc ký lần mẫu thử giả lập có nồng độ lần lượt: amlodipin Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 50 besilat mg/ml, tạp A µg/ml, amlodipin tạp B (EP) 10 µg/ml tạp G 10 µg/ml Bảng 3.30 Kết tính tương thích hệ thống qui trình xác định tạp chất A G nguyên liệu amlodipin besilat Thông số tR (phút) 4,264 Amlodipin TB besilat RSD % 0,149 Tạp G TB 6,585 RSD % 0,083 Amlodipin tạp TB B Tạp A 8,542 RSD % 0,072 TB 29,647 RSD % 0,121 S (µV x giây) AS RS N 26145181 1,984 0,000 1473 0,136 0,256 0,000 0,544 478486 1,323 5,455 4191 0,119 0,489 0,382 0,347 336535 1,259 4,011 3610 0,449 0,665 0,172 0,488 54270 1,228 20,843 6618 1,655 1,313 1,168 1,768 Nhận xét: RSD thông số sắc ký Vậy qui trình kiểm tạp A G nguyên liệu amlodipin besilat đạt yêu cầu tương thích hệ thống Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng (pha động, dung môi pha mẫu), mẫu chuẩn amlodipin besilat, mẫu chuẩn tạp A, tạp G, tạp B, mẫu thử giả lập Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 51 Hình 3.40 Kết sắc ký đồ tính đặc hiệu qui trình kiểm tạp A G nguyên liệu amlodipin besilat phương pháp HPLC Nhận xét: - Mẫu trắng (pha động, dung môi pha mẫu): không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu amlodipin besilat, tạp A, tạp G B mẫu chuẩn - Thời gian lưu tương ứng amlodipin besilat, tạp G, tạp B tạp A là: khoảng 4,2 phút, 6,5 phút, 8,5 phút 29,6 phút  Kết kiểm tạp A G nguyên liệu amlodipin besilat lô nguyên liệu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 52 Bảng 3.31 Kết xác định tạp chất liên quan tạp A G amlodipin besilat lô nguyên liệu Hàm lƣợng (%) S (µV x giây) Dung dịch thử (a) Tạp A NL 19236 NL 61823 Dung dịch Dung dịch thử (a) đối chiếu (d) 48975 0,39 (< 1,5) 1,26 (100 lọ (10 mg/lọ) đủ đáp ứng yêu cầu sử dụng đồng thời cịn làm giảm chi phí kiểm nghiệm không cần mua chuẩn từ USP hay EP hay phải chờ nhập hàng nhiều ngày Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Luận văn thực nội dung đáp ứng mục tiêu đề cương sau - Tổng hợp tạp A từ amlodipin besilat với điều kiện khảo sát, chọn điều kiện có sản phẩm thô dễ tinh chế hiệu suất cao - Tổng hợp tạp G phản ứng Hantzsch với tác chất orthoclorobenzaldehyd methyl-3-acetoacetic cho hiệu suất cao có sản phẩm trung gian imino-Knoevenagel - Khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp phương pháp phổ nghiệm sau so sánh phổ IR với chất đối chiếu EP - Xây dựng thẩm định tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng sản phẩm tổng hợp - Thiết lập chất đối chiếu tạp A tạp G amlodipin theo WHO xử lí thống kê theo ISO 13528 - Ứng dụng chất đối chiếu vừa thiết lập để kiểm tra tạp chất nguyên liệu amlodipin besilat thị trường KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đưa số đề nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu theo dõi độ ổn định chất đối chiếu tạp A tạp G để tính tốn chu kỳ đánh giá lại chất chuẩn - Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thiết lập chất đối chiếu tạp chất liên quan khác (tạp B tạp chất E, F, H amlodipin) - Tiếp tục ứng dụng qui trình định lượng tạp chất liên quan tạp A tạp G nhiều mẫu nguyên liệu amlodipin besilat Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn ... nghiệm tạp chấtA G nguyên liệu amlodipin besilat 86 CHƢƠNG BÀN LUẬN 90 4.1 Tổng hợp tạp chất A G amlodipin 90 4.1.1 Tổng hợp tạp chất A amlodipin 90 4.1.2 Tổng hợp tạp. .. cộng tổng hợp chất trung gian phthaloyl amlodipin (tạp A) từ amlodipin besilat anhydrid phtalic toluen AlCl3 [3] K F Hamak tổng hợp dẫn xuất phtalimid thông qua phản ứng anhydrid phtalic amin... g? ?y khơng khó khăn cho cơng tác kiểm nghiệm Xuất phát từ lý trên, đề tài “TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN H? ?A TẠP CHẤT LIÊN QUAN A VÀ G C? ?A AMLODIPIN? ?? thực với mong muốn cung cấp thêm qui trình tổng hợp