3.2.1. Tạp chất B
3.2.1.1. hảo át phương pháp
Điều kiện (1): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – nước (40:60), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl.
Điều kiện (2): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH - isopropanol (40:60), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl.
Điều kiện (3): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 1 mM (pH 10,5) (50:50), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl.
Điều kiện (4): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (50:50), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (5): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (50:50), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (6): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (45:55), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Bước sóng phát hiện: chọn bước sóng hấp thụ cực đại dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất B.
(a) (b)
(c)
(d)
(e) (f)
Hình 3.6. Sắc ký đồ của tạp chất B với các điều kiện sắc ký khảo sát
(a) Điều kiện (1); (b) Điều kiện (2); (c) Điều kiện (3)
(d) Điều kiện (4); (e) Điều kiện (5); (f) Điều kiện (6)
Nhận xét:
- Kết quả khảo sát cho thấy:
+ Điều kiện (1), (2), (3), (4): pic tạp chất B có hệ số đối xứng lớn hơn , .
+ Điều kiện (5): thời gian lưu của pic tạp chất B là 3,3 phút, pic rửa giải quá nhanh, d lẫn với meloxicam và các tạp khác nếu có.
+ Điều kiện (6): tạp chất B có thời gian lưu là , phút, hệ số đối xứng AS = 1,2, độ tinh khiết của pic ≥ . Ở điều kiện này pic tạp chất B cũng tách hoàn toàn pic meloxicam (hình 3.7).
- Dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của tạp chất B, chọn bước sóng phát hiện là 260 nm (hình 3.8).
ậ điều kiện s c ký thích h đ đị độ tinh khiết tạp chất B là điều kiện (6):
- ha động: methanol – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (45:55,tt/tt). - Cột sắc ký Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm).
- Đầu dò DA: bước sóng phát hiện 260 nm. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Nhiệt độ cột: 26 0C.
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch chứa meloxicam 1000 µg/ml và tạp chất B 1 µg/ml
(a)
(b)
Hình 3.8. Phổ UV tại thời gian lưu tạp chất B khi khảo sát với điều kiện (6)
(a) Dung dịch tạp chất B 100 µg/ml
(b)Dung dịch meloxicam 1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml
Hình 3.9. Biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic của tạp chất B
3.2.1.2. Thẩm định phương pháp
Tính phù hợp hệ thống
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đ a lý thuyết (N) đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm
trong khoảng 0,8 – , , độ phân giải (RS) lớn hơn , , khẳng định rằng quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B đạt tính phù hợp của hệ thống.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình xác định độ tinh
khiết tạp chất B Số lần tiêm mẫu tR (phút) S (µAU*giây) AS RS 1 N 1 5,072 5547591 1,2 8,6 32539 2 5,065 5556760 1,2 8,7 32741 3 5,071 5585236 1,2 8,6 33347 4 5,074 5600523 1,2 8,2 31993 5 5,081 5594475 1,2 8,7 33262 6 5,070 5587803 1,2 8,4 32637 Trung bình 5,072 5578731 1,2 8,5 32753 RSD 0,10% 0,38% 0,42% 2,13% 1,53%
1: độ phân giải của pic tạp chất B với pic tạp của mẫu trắng có tR = 2,63 (phút)
Tính đặc hiệu
Kết quả khảo sát cho thấy:
- Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động (hình 3.10 và 3.11): không xuất hiện pic nào có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của tạp chất B trong sắc ký đồ mẫu thử.
- Sắc ký đồ mẫu thử (hình 3.12 và 3.13.a): ngoài pic tạp chất B chỉ có 2 pic lạ có thời gian lưu và phổ UV giống như pic xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ 2 pic lạ này là của mẫu trắng. Pic tạp chất B tinh khiết (hình 3.13.b) và tách hoàn toàn các pic khác.
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng và phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong
Hình 3.11. Sắc ký đồ pha động (đối với tạp chất B)
(a)
(b)
(a)
(b)
Hình 3.13. (a) Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử tạp chất B
Miền giá trị
Chuẩn bị 6 dung dịch tạp chất B trong khoảng nồng độ 20 - 200 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được trong bảng 3.4.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát miền giá
trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (μA *giây) 20 1046305 40 2179813 60 3313633 100 5552624 150 8169392 200 10912757
Hình 3.14. Đường biểu di n diện tích pic theo
nồng độ phân tích của tạp chất B
Khả đ ờng bi u diễn diện tích pic theo nồ độ phân tích của tạp chất B
Độ dốc: B0 = 54638. Tung độ gốc: B = 5146.
Bình phương của hệ số tương quan: 2 = 0,9998. , ≤ 2
≤ , do đó chấp nhận sự tuyến tính. Xét hàm ANOVA bằng phần mềm excel 2010:
- Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy: FS = 1,07.10-6 < α ,
phương trình hồi quy tương thích.
- Kiểm tra ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy:
Giá trị đối với hệ số B0 là 1,07.10-8 < α , hệ số B0 có ý ngh a về mặt thống kê.
Giá trị đối với hệ số B là , > α , hệ số B không có ý ngh a về mặt thống kê.
Như vậy, miền giá trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B là 20 – 200 g/ml. hương trình hồi quy tuyến tính biểu di n sự tương quan diện tích pic theo nồng độ phân tích của tạp chất B là ŷ x.
Độ chính xác
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình kiểm tra độ tinh khiết tạp chất B
Số lần đo Diện tích pic (μA *giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 1 5543404 5380931 5398859 2 5605736 5390179 5385716 3 5389605 5507166 5375694 4 5419143 5505405 5379349 5 5555903 5508387 5450586 6 5549345 5549288 5466099 7 5362985 5404410 5348279 8 5472700 5427628 5351958 9 5349761 5565980 5473226 10 5355545 5559060 5474534 11 5396532 5618684 5297472 12 5326312 5626649 5311054 Trung bình 5443914 5503647 5392736 5446766 RSD 1,78% 1,56% 1,14% 1,70%
Kết quả thu được theo bảng 3.7 cho thấy quy trình phân tích có độ chính xác cao (RSD của diện tích pic ≤ ).
Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất B bằng phương pháp H LC có
tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do đó có thể áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết của tạp chất B.
3.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết tạp chất B
a. Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – iểm nghiệm ( hoa Dược – Đại học Y Dược T . Hồ Chí Minh)
Tiến hành sắc ký mẫu tạp chất B theo quy trình đã chọn, chuẩn bị 3 mẫu thử, mỗi mẫu sắc ký 2 lần. Kết quả cho thấy mẫu tạp chất B nghiên cứu có độ tinh khiết > 99,9%. Số liệu được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ tinh khiết tạp chất B bằng HPLC với đầu dò PDA
Mẫu Số lần đo Diện tích pic
(µAU*giây) % diện tích pic Xử lý thống kê
1 1 5380931 100% n = 6; xTB = 100%; SD = 0 ; RSD = 0% e = 0 (với t = 2,57; p = 0,05) 2 5390179 100% 2 1 5507166 100% 2 5505405 100% 3 1 5508387 100% 2 5549288 100%
b. Tại Viện iểm nghiệm thuốc T .HCM
Kết quả phân tích tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh cho kết quả độ tinh khiết tạp B là 99,94% (phụ lục 1, 2) tính trên chế phẩm nguyên trạng bằng phương pháp H LC.
3.2.2. Tạp chất D
3.2.2.1. Khảo át phương pháp
Điều kiện (1): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – nước (60:40), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (2): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH - nước (65:35), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (3): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (60:40), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (4): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (65:35), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (5): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (70:30), tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Điều kiện (6): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (60:40), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
Bước sóng phát hiện: chọn bước sóng hấp thu cực đại dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất D.
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Hình 3.15. Sắc ký đồ của tạp chất D với các điều kiện sắc ký khảo sát
(a) Điều kiện (1); (b) Điều kiện (2); (c) Điều kiện (3)
(d) Điều kiện (4); (e) Điều kiện (5); (f) Điều kiện (6)
Nhận xét :
- Kết quả khảo sát cho thấy :
+ Điều kiện (3) : pic tạp chất D có thời gian lưu là , phút, hệ số đối xứng As = 1,2, pic rửa giải chậm, đạt độ tinh khiết pic ≥ .
+ Điều kiện (4), (5) : thời gian rửa giải được rút ngắn, hệ số đối xứng As , và độ tinh khiết pic không đạt.
+ Điều kiện (6) : thời gian lưu của tạp D là 8,517 phút, hệ số đối xứng As = 1,4 ; pic đạt độ tinh khiết.
- Dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của tạp chất D (hình 3.17), chọn bước sóng phát hiện là 360 nm.
Hình 3.16. Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp chất D khi khảo sát với điều kiện
(3)
ậ điều kiện s c ký thích h đ đị độ tinh khiết tạp chất D điều kiện (3) :
- ha động: methanol – dung dịch TEA 0,8 mM (pH 9,7) (60:40,tt/tt). - Cột sắc ký Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm).
- Đầu dò DA: bước sóng phát hiện 360 nm. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Nhiệt độ cột: 30 0C.
Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch tạp chất D 100 µg/ml với điều kiện (3)
3.2.2.2. Thẩm định phương pháp
Tính phù hợp hệ thống
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đ a lý thuyết (N) đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8 – , , độ phân giải (RS) lớn hơn , , khẳng định rằng quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất D đạt tính phù hợp của hệ thống.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình xác định độ tinh
khiết tạp chất D Số lần tiêm mẫu tR (phút) S (µAU*giây) AS RS 1 N 1 10,387 5706680 1,1 4,53 27927 2 10,367 5716676 1,1 4,53 27927 3 10,373 5691849 1,1 4,54 28073 4 10,367 5709113 1,1 4,56 28147 5 10,365 5706116 1,1 4,55 28113 6 10,363 5707089 1,1 4,55 28173 Trung bình 10,370 5706254 1,1 4,55 28060 RSD 0,09% 0,14% 0,11% 0,24% 0,39%
Tính đặc hiệu
Kết quả khảo sát cho thấy:
- Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động (hình 3.18 và 3.19): không xuất hiện pic nào có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của tạp chất D trong sắc ký đồ mẫu thử.
- Sắc ký đồ mẫu thử (hình 3.20) và phổ UV (hình 3.21 a): ngoài pic tạp chất D chỉ có 1 pic lạ, pic này có độ cao và diện tích đỉnh nằm trong giới hạn cho phép. Pic tạp chất D tinh khiết (hình 3.21 b) và tách hoàn toàn các pic khác.
Từ kết quả trên, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu.
Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu trắng và phổ UV tại thời gian lưu của pic trong mẫu
Hình 3.19. Sắc ký đồ pha động (đối với tạp chất D)
(a)
(b)
(a)
(b)
Hình 3.21. (a) Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử tạp chất D
(b) Biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic của tạp chất D
Miền giá trị
Chuẩn bị 6 dung dịch tạp chất D trong khoảng nồng độ 20 - 200 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát miền
giá trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất D Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (μA *giây) 20 1165928 40 2175257 60 3462724 100 5825388 150 8243590 200 11003487 y = 54681x + 118028 R2 = 0.9988 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 0 50 100 150 200 250 Nồng độ (µg/ml) diện tích pic µAu*giây
Hình 3.22. Đường biểu di n diện tích pic theo
nồng độ phân tích của tạp chất D
Khả đ ờng bi u diễn diện tích pic theo nồ độ phân tích của tạp chất D
Bình phương của hệ số tương quan: 2 = 0,9988. , ≤ 2
≤ , do đó chấp nhận sự tuyến tính. Xét hàm ANOVA bằng phần mềm MS excel:
- Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy: FS = 5,75.10-7 < α ,
phương trình hồi quy tương thích.
- Kiểm tra ý ngh a của các hệ số trong phương trình hồi quy:
Giá trị đối với hệ số B là 0,34 > α , hệ số B không có ý ngh a về mặt thống kê.
Giá trị đối với hệ số B0 là 5,75.10-7 < α , hệ số B0 có ý ngh a về mặt thống kê.
Như vậy, miền giá trị của quy trình xác định độ tinh khiết tạp D là 20 – 200 µg/ml. hương trình hồi quy tuyến tính biểu di n sự tương quan diện tích pic theo nồng độ phân tích của tạp D là ŷ = 54681x.
Độ chính xác
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình kiểm tra độ tinh khiết tạp
chất D
Số lần đo Diện tích pic (μA *giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 1 5934558 5939959 5921555 2 5992808 6082203 6054944 3 6145965 6045708 6157156 4 6167216 6216752 6303063 5 5979166 6086989 6102670 6 5968814 6293946 6123179 7 5969784 5956671 5949224 8 5986130 5999125 6049282 9 6174438 6047198 6142357 10 6162590 6198923 6324810 11 6001199 6086847 6128461 12 5983797 6302862 6105671 Trung bình 6038872 6104765 6113531 6085723 RSD 1,53% 2,00% 1,94% 1,87%
Kết quả thu được theo bảng 3.11 cho thấy quy trình phân tích có độ chính xác cao (RSD của diện tích pic ≤ ).
Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết tạp chất D bằng phương pháp H LC có
tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do đó có thể áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết của tạp chất D.
3.2.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết tạp chất D
a. Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – iểm nghiệm ( hoa Dược – Đại học Y Dược T . Hồ Chí Minh)
Tiến hành sắc ký mẫu tạp chất D theo quy trình đã chọn, chuẩn bị 3 mẫu thử, mỗi mẫu sắc ký 2 lần. Kết quả cho thấy mẫu tạp chất D nghiên cứu có độ tinh khiết > 98%. Số liệu được trình bày trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả xác định độ tinh khiết tạp chất D bằng HPLC với đầu dò PDA
Mẫu Số lần đo Diện tích pic (µAU*giây) % diện tích pic Xử lý thống kê 1 1 5610543 98,21 n = 6; xTB = 98,22%; SD = 0,11 ; RSD = 0,01% e = 0,01 (với t = 2,57; p = 0,05) 2 5625523 98,23 2 1 5504829 98,21 2 5498298 98,20 3 1 5632650 98,22 2 5632821 98,23
b. Tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh
Kết quả phân tích tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh cho kết quả độ tinh khiết tạp chất D là 98,22% tính trên chế phẩm nguyên trạng bằng phương pháp HPLC (phụ lục 3, 4).