3.1. iều chế tạp chất liên quan của meloxicam
3.1.1. Tinh chế tạp chất B
hương pháp: kết tinh lại trong methanol.
Tiến hành: Hòa tan 4,0 gam 5-methylthiazol-2-ylamin trong một lượng tối thiểu methanol nóng. Lọc nóng qua giấy lọc. Để nguội cho kết tinh. Lọc dưới áp suất giảm thu tủa. Sấy trong tủ sấy 50 °C trong 6 giờ, thu được 3 gam sản phẩm tinh chế.
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng:
- Nhiệt độ nóng chảy:
Bảng 3.1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của tạp chất B
Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy (°C)
Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn (°C)
1 95 95
2 95 95
3 95 95
Theo kết quả ở bảng 3. , khoảng nhiệt độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn của mẫu tạp chất B chênh lệch không quá °C, sơ bộ cho thấy mẫu tạp chất B tinh khiết.
- Sắc ký lớp mỏng:
Dung dịch thử: dung dịch tạp B 0,01 g/ml methanol.
Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck, kích thước 10 x 1,5 cm. Thể tích chấm mẫu: 10 µl.
Dung môi khai triển:
(1)Dicloromethan – methanol (20:1) (2)n-hexan – aceton (2:1)
Phát hiện: soi dưới đèn V nm.
Theo kết quả trong hình 3.1, khi tiến hành sắc ký với 2 hệ dung môi khai triển khác nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy mẫu tạp chất B tinh khiết.
(1) (2)
Hình 3.1. Kết quả sắc ký lớp mỏng của tạp chất B
Hệ dung môi khai triển: (1) dicloromethan – methanol (20:1) (2) n-hexan – aceton (2:1)
3.1.2. Tổng h p tạp chất ( đi n Anh 2010)
3.1.2.1. Tổng hợp
Quy trình tổng hợp tạp chất D được tiến hành như sau:
Hòa tan 10 g meloxicam vào 50 ml DMF khan trong bình cầu 250 ml, thêm từ từ từng giọt hỗn dịch natri hydrid (1,5 g) trong DMF khan (10ml) vào dung dịch meloxicam đã được làm lạnh đến 5 0C, khuấy 30 phút. Thêm 40 ml ethyl bromid vào hỗn hợp trên và khuấy ở nhiệt độ phòng khoảng 4 giờ. Để yên cho tủa màu vàng lắng xuống, lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng DMF, sau đó tiếp tục rửa tủa với nước 3 lần, methanol 3 lần (mỗi lần khoảng 50 ml), sấy khô thu được 7 g sản phẩm.
3.1.2.2. Tinh chế
Tiến hành: cho sản phẩm tổng hợp vào 100 ml DFM, siêu âm 5 phút, đun nóng ở nhiệt độ 60 0C, lọc nóng lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng DMF, sau đó rửa lại với nước và methanol, sấy khô thu được 5 g sản phẩm. Tiếp tục tinh chế sản phẩm sau khi sấy khô bằng sắc ký cột [5].
Chuẩn bị cột sắc ký: cột thủy tinh, đường kính 3 cm, dài 1 m ha động: dicloromethan : H2O (20 : 1)
ha t nh: silica gel kích thước 230 - 400 µm
Chuẩn bị mẫu: 2 g mẫu được hòa tan vào ml pha động, thêm 20 g silica gel và trộn đều với mẫu, sau đó cô bay hơi dung môi, sấy khô.
Mẫu được nạp lên cột đã được ổn định với pha động, thấm ướt mẫu bằng một lượng dung môi tối thiểu. Rửa giải và hứng lấy từng phân đoạn sản phẩm, mỗi phân đoạn 15 ml và được kiểm tra bằng phương pháp H LC với hệ dung môi methanol : H2O (60 : 40). Cô thu hồi dung môi, rửa lại với DMF, nước và methanol, sấy khô, thu được 800 mg sản phẩm.
3.1.2.3. Thử tinh khiết
- ác định nhiệt độ nóng chảy
Bảng 3.2. Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp
Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy (0C)
Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn (0C)
1 281 282
2 281 282
3 280 282
Theo kết quả ở bảng 3.2, khoảng nhiệt độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn sản phẩm tổng hợp chênh lệch khoảng 1 0C - 2 0C, sơ bộ cho thấy sản phẩm tổng hợp tinh khiết.
- Sắc ký lớp mỏng
Dung dịch thử: dung dịch sản phẩm tổng hợp 0,001 g/ml hỗn hợp dicloromethan : H2O (6:4).
Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck, kích thước 10 x 1,5 cm. Thể tích chấm mẫu: 10 µl.
Dung môi khai triển:
(1)Tricloromethan – methanol (40:1) (2)Dicloromethan – methanol (30:1)
Phát hiện: soi dưới đèn V nm.
Theo kết quả trong hình 3.2, khi tiến hành sắc ký với 3 hệ dung môi khai triển khác nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy sản phẩm tổng hợp tinh khiết.
(1) (2) (3)
Hình 3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng của sản phẩm tổng hợp
Hệ dung môi khai triển: (1) tricloromethan – methanol (40:1) (2) dicloromethan – methanol (30:1) (3) n-hexan – aceton (4:5) 3.1.2.4. Xác định cấu trúc Phổ hồng ngoại Hình 3.3. Phổ IR của sản phẩm tổng hợp 0.0 20.0 40.0 60.0 %T 500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 1750.0 2000.0 2500.0 3000.0 3500.0 1/cm 4000.0
Bảng 3.3. Kết quả biện giải phổ IR của sản phẩm tổng hợp Số sóng (cm-1) Nhóm chức 3128,3 -OH 2922 -C-H (benzen) 1596,9 -C=O 1502,4 -C=C- 1284,5/1336,6 -SO2-
Nhận xét: phổ IR cho thấy một số đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức phân tử của tạp chất C (Dược điển VN IV) hoặc tạp chất D (Dược điển Anh 2010), đặc biệt là có sự xuất hiện hai số sóng của nhóm chức -SO2-.
Phổ MS
Phổ MS [M+Na]+ và [M+H]+ của sản phẩm tổng hợp cho các mảnh có số khối (m/z) 402,13 và 380,12 phù hợp với số khối của tạp chất C (DĐVN IV) hoặc tạp chất D (BP 2010) ứng với công thức C16H17N3O4S2 (M= 379,45).
Phổ NMR
Bảng 3.4a. So sánh độ dịch chuyển hóa học của meloxicam và sản phẩm tổng hợp
trên phổ 1H NMR
δ Meloxicam (ppm) δ đo (ppm) Nhóm proton trong phân tử 1,4 3H (Nthiazol-CH3) 2,33 2,3 H- ’ 2,9 2,9 3H-(CH3-Nbenzothiazin) 4,2 2H (Nthiazol-CH2) 7,36 7,5 H- ’ 7,8 - 8,2 7,8 - 8,1 H-5, H-6, H-7, H-8 14,9 HO-
Hình 3.5a. Phổ 1H NMR của sản phẩm tổng hợp
Bảng 3.4b. So sánh độ dịch chuyển hóa học của meloxicam và sản phẩm tổng hợp
trên phổ 13C NMR
δ meloxicam (ppm) δ đo (ppm) Nhóm proton trong phân tử
165,528 169,845 C=O 163,503 163,608 C-4 155,943 155,297 C- ’ 44,232 -CH2-(ethyl-Nthiazol) 38,320 37,722 CH3-Nbenzothiazin 13,549 -CH3 (ethyl-Nthiazol) 11,664 11,953 CH3 (C- ’)
Hình 3.5b. Phổ 13C NMR của sản phẩm tổng hợp
Nhận xét: hình 3.5a, 3.5b và bảng 3.4a, 3.4b của phổ NMR cho thấy số lượng và vị
trí của proton, carbon phù hợp với công thức tạp chất C (DĐVN IV) hoặc tạp chất D (Dược điển Anh 2010) ứng với công thức C16H17N3O4S2.
Phổ NOESY
Hình 3.5c. Phổ NOESY của sản phẩm tổng hợp
Phổ NOE (7,48 ppm): 4,2; 2,32 ppm (hình 3.5c) cho thấy proton H- ’ có tương tác với proton H (CH3-C- ’) và H (-CH2-N-thiazol) chứng tỏ nhóm -CH2- của ethyl gắn trên N-thiazol.
Như vậy, dựa trên phổ IR, MS và NMR có thể khẳng định sản phẩm tổng hợp chính là tạp chất D (Dược điển Anh 2010).
3.1.2.5. Hiệu suất phản ứng
Hiệu suất thô (chưa qua cột sắc ký): 50%, thu được 5 g sản phẩm tổng hợp Hiệu suất tinh chế tinh khiết: 40%, thu được 800 mg sản phẩm tinh khiết. Hiệu suất quy trình: 20%, thu được 2 g sản phảm tinh khiết.