phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lõ giết mổ heo tại huyện vũng liêm tỉnh vĩnh long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PHÂN GIẢI KERATIN TỪ CHẤT THẢI LÕ GIẾT MỔ HEO TẠI HUYỆN VŨNG LIÊM TỈNH VĨNH LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN THÙY LINH MSSV: 3102826 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SNH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Thùy Linh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: − Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi cho học tập rèn luyện bốn năm qua. − Ban Giám Đốc Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài. − Cô Bùi Thị Minh Diệu tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 36 đồng hành suốt quảng đường đại học. Cảm ơn cô tận tình bảo, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Cảm ơn tất anh chị, bạn phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật giúp đỡ nhiều thời gian thực luận văn. Nguyễn Thùy Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM TẮT Keratin protein khó phân hủy tự nhiên lại chứa acid amin quan trọng sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thức ăn gia súc, phân hữu cơ, gas sinh học. Phân hủy keratin phương pháp vật lý hay hóa học dễ làm phá hủy acid amin này, cần tốn nhiều lượng tạo chất gây ô nhiễm môi trường. Trong năm gần đây, phân giải keratin biện pháp sinh học nhà nghiên cứu quan tâm trọng. Đề tài “ Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lò giết mổ heo huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long” tiến hành với mục tiêu phân lập số dòng vi khuẩn có khả phân giải keratin tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân giải keratin mạnh. Kết phân lập 20 dòng vi khuẩn có dòng phân lập từ mẫu đất, dòng từ mẫu lông dòng từ mẫu nước. Qua khảo sát ghi nhận hai dòng K13 K5 có hoạt độ enzyme keratinase cao nhất. Tiến hành khảo sát khả phân giải keratin chất bột lông heo bột lông gia cầm 20 dòng vi khuẩn, sau ngày ủ lắc chọn hai dòng có tỉ lệ phân giải bột lông heo cao tương đương K13 K18, dòng có tỉ lệ phân giải bột lông gia cầm cao không khác biệt ý nghĩa dòng K11, K13, K18 K20. Từ kết thí nghiệm cho thấy vi khuẩn phân giải keratin từ lông gia cầm tốt nguồn keratin lông heo khả phân giải keratin vi khuẩn không hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt tính enzyme keratinase chúng. Từ khóa: keratin, phân lập, bột lông heo, hoạt độ keratinase Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT . LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH BẢNG . iv DANH SÁCH HÌNH . v TỪ VIẾT TẮT . vi CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề . 1.2. Mục tiêu đề tài . CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1. Sơ lƣợc keratin chất thải chứa keratin 2.2. Sơ lƣợc vi khuẩn phân giải keratin . 2.3. Sơ lƣợc enzyme keratinase . 2.4. Một số nghiên cứu nƣớc vi khuẩn phân giải keratin . 2.4.1 Một số nghiên cứu nước 2.4.2 Một số nghiên cứu nước . CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu: . 3.1.2. Thời gian nghiên cứu: 3.1.3. Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 3.1.4. Vật liệu thí nghiệm 3.1.5. Hóa chất . 10 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 11 3.2.1. Phương pháp thu mẫu 11 3.2.2. Thí nghiệm 1: phân lập dòng vi khuẩn phân giải keratin 11 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh . 12 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 17 4.1. Phân lập dòng vi khuẩn phân giải keratin . 17 4.1.1. Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn . 17 4.1.2. Hình thái khuẩn lạc 17 4.2. Đánh giá hoạt độ enzyme keratinase dòng vi khuẩn phân lập đƣợc . 19 4.3. Khảo sát tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin mạnh 20 4.3.1. Khả phân giải chất chứa keratin dòng vi khuẩn phân lập . 20 4.3.2 Hình dạng tế bào đặc tính Gram dòng vi khuẩn tuyển chọn 25 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 5.1. Kết luận 27 5.2. Kiến nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn phân lập 18 Bảng 2. Hoạt tính keratinase dòng vi khuẩn 19 Bảng 3. Tỷ lệ phân giải bột lông heo dòng vi khuẩn . 21 Bảng 4. Tỷ lệ phân giải bột lông gia cầm dòng vi khuẩn 23 Bảng 5. Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào đặc tính Gram dòng vi khuẩn tuyển chọn . 26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. α – keratin β – keratin . Hình 2. Lông heo sau cắt nhuyễn . Hình 3. Quy trình xác định mật số vi khuẩn phương pháp đếm sống 13 Hình 4. Ảnh khuẩn lạc số dòng vi khuẩn phân lập 17 Hình 5. Tỷ lệ phân giải keratin từ hai nguồn chất khác hoạt độ keratinase dòng vi khuẩn 24 Hình 6. Ảnh khuẩn lạc tuyển chọn . 26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit g gram l lít OD Optical Density rpm revolutions per minute STT Số thứ tự TCA Trichloroacetic acid Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi giới đà phát triển, đáp ứng nhu cầu tăng cao thực phẩm đồng thời mang lại lợi nhuận cho nhiều quốc gia đặc biệt nước có nông nghiệp lâu đời Việt Nam. Theo Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, tổng sản lượng thịt cung cấp thị trường nước ta tháng đầu năm 2013 đạt 2,62 triệu tấn(*). Cùng với gia tăng đàn vật nuôi tình trạng ô nhiễm môi trường chất thải chăn nuôi chiều hướng báo động, đáng ý lông gia súc, gia cầm với thành phần keratin khó phân hủy góp phần gây nên ô nhiễm đất, ô nhiễm nguồn nước,… chúng thải trực tiếp môi trường mà không qua xử lý. Vĩnh Long tỉnh thành Đồng sông Cửu Long có nhiều sở giết mổ gia súc gia cầm nhất, huyện Vũng Liêm huyện có đàn gia súc lớn nhất. Những sở giết mổ gia súc gia cầm hầu hết biện pháp xử lý chất thải giết mổ nên thải trực tiếp xuống sông, gây ô nhiểm nghiêm trọng. Sự phân giải chất thải có chứa keratin có ý nghĩa thiết thực ngành công - nông nghiệp chế biến thức ăn thủy sản, gia súc gia cầm sản xuất phân bón (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010). Việc xử lý chất thải keratin phương pháp chôn đốt gây ô nhiễm nước, đất không khí. Trong keratin lại chứa acid amin quan trọng sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Bên cạnh đó, keratin dùng nguyên liệu cho sản xuất phân hữu cơ, gas sinh học. Do đó, tìm phương pháp hiệu để xử lý chất thải keratin vấn đề có ý nghĩa quan trọng ngành chăn nuôi, vừa xử lý hiệu chất thải lông gia súc, gia cầm vừa tạo sản phẩm có giá trị kinh tế. Phân hủy keratin phương pháp vật lý hay hóa học dễ làm phá hủy acid amin, cần sử dụng nhiều lượng tạo chất gây ô nhiễm cho môi trường (Matikevičienė et al., 2009). Trong năm gần đây, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm phương pháp sinh học quan tâm trọng. Việc ứng dụng biện pháp sinh học sử dụng vi khuẩn có khả phân giải keratin đạt được hai ưu quan trọng không gây hại với môi trường nâng cao giá trị dinh dưỡng sản phẩm protein. Chính vậy, việc phân lập tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân giải keratin từ chất thải sở giết mổ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Đề tài phân lập 20 dòng vi khuẩn từ chất thải số sở giết mổ heo huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long. Các dòng vi khuẩn phát triển tốt chất bột lông heo sau 48 giờ. - Dòng vi khuẩn có hoạt tính keratinase cao K13 với 24,2U/ml, hoạt tính thấp dòng K3 với 2,7U/ml. Hai dòng vi khuẩn K13 K5 vi khuẩn tiềm ứng dụng sản xuất enzyme keratinase thương mại. - Vi khuẩn phân giải keratin từ lông gia cầm tốt keratin từ lông heo. - Khả phân giải keratin vi khuẩn không hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt độ enzyme keratinase. - Hai dòng vi khuẩn K13 K18 có khả phân giải 30% lông heo sau ngày ủ lắc vi khuẩn tiềm ứng dụng phân giải keratin sản xuất phân hữu thức ăn chăn nuôi. - Bốn dòng vi khuẩn K13, K18, K20 K11 có khả phân giải lông gia cầm khoảng 60% sau ngày ủ lắc chọn dòng vi khuẩn hứa hẹn ứng dụng phân giải lông gia cầm sản xuất thức ăn chăn nuôi. - Hai dòng vi khuẩn K13 K18 với khả phân giải mạnh lông heo lông gia cầm vi khuẩn ứng viên cho mục tiêu phân giải lông gia súc gia cầm từ nguồn rác thải chứa keratin. 5.2. Kiến nghị - Từ dòng vi khuẩn có khả phân giải keratin cao phân lập được, tiếp tục có nghiên cứu để tạo chế phẩm sinh học phân hủy keratin ứng dụng vào thực tiễn. - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả phân giải keratin dòng vi khuẩn tuyển chọn. - Xác định đặc tính sinh hóa kết hợp phương pháp sinh học phân tử định danh dòng vi khuẩn tuyển chọn. - Nghiên cứu vai trò tế bào trình phân giải keratin vi khuẩn. 27 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Thị Thu Huyền. 2012. Phân lập số vi khuẩn có hoạt tính keratinase số đặc tính enzyme. Luận văn thạc sĩ ngành Vi sinh vật học. Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Nguyễn Đình Quyến & Trần Thị Lan Phương. 2001. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phân giải keratin dùng để chuyển hóa sinh học lông gia cầm. Tạp chí sinh học, trang 27 – 30. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai. 2010. Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân hủy lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản. Nguyễn Thị Hồng Thẩm. 2012. Phân Lập Tuyển Chọn Vi khuẩn Phân Giải Lông Gia Cầm. Luận văn tốt nghiệp, ĐH Cần Thơ, 2012. Trương Văn Thọ. 2013.Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả phân hủy keratin vi khuẩn Bacillussubtillis K15. Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến.Đại học Cần Thơ. TIẾNG ANH Agrahari, S. & N. WAdhwa. 2010. Degradation of chicken feather a poultry waste product by keratinolytic bacteria isolated from dumping site at Ghazipur Poultry Processing Plant. International Journal of Poultry Science, page 482-489. Akhtar W, Edwards HG (1997) Fourier-transform Raman spectroscopy of mammalian and avian keratotic biopolymers. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 53A: 81-90. Areeb Inamdar, Sahera Nasreen and Rashiqua Siddiqui. 2012. Screening and Production of Extra Cellular Feather Degrading Enzyme from Bacterial Isolates. Indian J.L.Sci, 1(2) : 19-24. Balaji, S., M.S. Kumar, R. Karthikeyan, R. Kumar, S. Kirubanandan, R. Sridhar and P.K. Sehgal. 2008. Purification and characterization of an extracellular 28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102). World J Microbiol and Biotechnol, 24: 2741-2745. Bernal, C., J. Cairo and N. Coello. 2006. Purification and characterization of a novel exocellular keratinase from Kocuria rosea. Enzyme and Microbial Technology, 38: 49-54. Blockle, B., B. Galunski and R. Muller. 1997. Characterization of a keratinolytic serine protease from Streptomyces pactum DSM40530. Applied and Environmental Microbiology,61: 3705-3710. Cai, Z.J., Q. Zhang, D.K. Wey, L. Chen, J. Wang, X.Q. Zhang and M.H. Zhou. 2008. Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme. J. Industrial Microbio & Biotech. Daniel J. Daroit, Ana Paula F. Correˆa, Adriano Brandelli. 2009. Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp. P45 isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicusq. International Biodeterioration & Biodegradation, 63: 358–363 Daroit, D.J., A.P.F Corrêa & A. Brandelli. 2008. Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp.P45isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus. International Biodeterioration & Biodegradation, page 358-363. De Toni, C.H., Richter, M.F., Chagas, J.R., Henriques, J.A. & Termignoni. 2002. Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from a feather-degrading Xanthomonas maltophilia strain. Can. J. Microbiol, page 342348. Gupta, R. & P. Ramnani. 2006. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl Microbiol Biotechnol, page 21-33. Gupta, R., Q.K. Beg and P. Lorenz. 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches industrial applications. ApplMicrobiol Biotechnol, 59: 15–32. Gessesse, A., R. Hatti- Kaul, B.A. Gashe and B. Mattiasson. 2003. Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather. Enzyme and Microbial Technology, 32: 519-524. 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Gradisar, H., S. Kern and J. Friedrich. 2000. Keratinase of Doratomyces microsporus. Appl Microbiol Biotechnol, 53: 196-200. Hoben, H. and P. Somasegaran. 1982. comparison of the Pour, Dpread, and Drop plate methods for enumeration of Rhizobium spp. in inculant made from presterilized peat. Applied and Environmental Microbiology, pp.1246-1247. Lin, X. Inglis, G. Yanke, K.J. & L. Cheng. 1999. Selection and characterization of feather -degrading bacteria from canola meal compost. J. Ind. Microbiol. Biotechnol, page 149-153. Manczinger L., Rozs M., Va´gvo¨ lgyi Cs. And Kevei F 2003. Isolation and characterization of a new keratinolytic Bacillus licheniformis strain. W. Journal of Microbiology & Biotechnology, 19: 35–39, 2003. Matikevičienė V., Masiliūnienė D., Grigiškis S. 2009. Degradation of keratin containing wastes by bacteria with keratinolytic activity. Environment. Technology, 1691-5402. Onifade, A.A, N.A. Al-Sane, A.A. Al-Musallam and S. Al-Zarban S. 1998. A review: potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganismsvà their enzymes for nutritional improvement of feathers other keratins as livestock feed resources. Bioresour Technol 66: 1–11. Park, G.T. & H.J. Son. 2006. Keratinolytic activity of Bacillus megaterium F7-1, a feather - degrading mesophilic bacterium. Microbiological Research, page 478485. Prassad, H.V., G. Kumar, L. Karthik & B. Rao. 2010. Screening of Extracellular Keratinase Producing Bacteria from Feather Processing Areas in Vellore, Tamil Nadu, India. J. Sci. Res, page 559-565. Riffel, A. and A. Brandelli. 2006. Keratinolytic bacteria isolated from feather waste. Brazilian Journal of Microbiology, ISSN 1517-8382. Riffel, A., F. Lucas, P. Heeb and A. Brandelli. 2002. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Archives of Microbiology, 10.1007/s00203-003-0525-8. 30 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Riffel, A., Lucas, F. Heeb, P. Brandelli. 2003. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather. Arch. Microbiol, page 258265. Sangali, S. and A. Brandelli, 1999. Isolation and characterization of a novel featherdegrading bacterial strain. Humana Press Inc, 0273-2289/00/87/0017. Sangali, S., Brandelli. 2000. Feather keratin hydrolysis by a Vibrio sp. kr2 strain. J. Appl. Microbiol, page 735-743. Thys,RCS.,F. Lucas, A. Riffel, P. Heeb and A. Bradelli. 2004. Characterization of a protease of a feather-degrading Microbacterium species. Lett Appl Microbiol, 39: 181-186. Voet, D., JG. Voet. 1995. Three-dimensional structure of proteins.In: Stiefel J (ed) Biochemistry, 2nd edn. Wiley, New York, pp.154–156. Zerdani, I., M. Faid and A. Malki, “Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp.,”. In Morocco.Afr. J. Biotechnol, 2004: 3: 67-70. Zhang, Y.Q. and K.D. Sarge.2009. Sumoylation regulates lamin A function and is lost in lamin A mutants associated with familial cardiomyopathies. J. Cell Biol, 182: 35-39. TRANG WEB http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/sinh-hoc-te-bao/1653-phan-loai protein, (ngày 15/07/2013) http://www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/Attachments/69/Baocao_6_2013.p df, (ngày 15/07/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Keratin (ngày 15/07/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Keratinase (ngày 15/07/2013) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2528886/ (ngày 15/07/2013) http://digital.lrc.ctu.edu.vn/digdig/dock/?pages/viewdg/17163/TTHL-DHCT (ngày 10/11/2013) 31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT http://www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/Attachments/69/Baocao_6_2013.p df (ngày 15/07/2013) http://dl.vnu.edu.vn/bitstream/11126/4073/1/01050000994.pdf (ngày 18/11/2013) 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các bảng kết thí nghiệm Bảng 6: Kết đo hoạt tính enzyme keratinase 20 dòng vi khuẩn STT Ký hiệu vi khuẩn Đối chứng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 0.035 0.036 0.029 0.035 0.033 0.026 0.032 0.030 0.031 0.035 0.039 0.032 0.035 0.024 0.037 0.038 0.028 0.024 0.036 0.039 Kết đo OD 450nm Lặp lại 0.041 0.047 0.050 0.054 0.033 0.035 0.054 0.050 0.070 0.079 0.032 0.032 0.052 0.056 0.060 0.066 0.044 0.045 0.045 0.054 0.062 0.064 0.067 0.064 0.080 0.084 0.063 0.058 0.054 0.053 0.068 0.076 0.050 0.055 0.064 0.066 0.076 0.076 0.081 0.082 0.041 0.054 0.035 0.049 0.080 0.031 0.057 0.060 0.050 0.050 0.064 0.065 0.086 0.058 0.059 0.073 0.050 0.060 0.081 0.077 Hoạt tính trung bình (U/ml) 4.0 8.3 2.7 8.0 21.7 2.8 11.5 16.0 7.7 7.3 12.2 16.7 24.2 17.8 9.2 17.2 11.8 19.7 20.8 20.5 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 8: Tỷ lệ phân giải bột lông heo dòng vi khuẩn STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ký hiệu vi khuẩn K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 Khối lƣợng giấy lọc (g) Trƣớc Sau 1.348 1.793 1.390 1.845 1.379 1.831 1.456 1.886 1.481 1.914 1.485 1.925 1.363 1.819 1.369 1.832 1.519 1.970 1.448 1.900 1.515 1.973 1.404 1.864 1.399 1.847 1.409 1.854 1.498 1.943 1.334 1.784 1.392 1.840 1.353 1.807 1.233 1.676 1.389 1.836 1.392 1.844 1.392 1.842 1.364 1.808 1.475 1.921 1.422 1.893 1.421 1.889 1.497 1.964 1.506 1.948 1.531 1.981 1.436 1.883 1.354 1.795 1.303 1.747 1.430 1.877 1.381 1.818 1.374 1.808 1.462 1.895 1.421 1.768 1.437 1.779 1.517 1.858 1.385 1.801 1.509 1.912 1.389 1.795 1.401 1.892 1.445 1.931 1.416 1.900 1.389 1.822 1.381 1.808 1.469 1.899 1.360 1.817 1.478 1.936 1.407 1.857 1.390 1.733 1.507 1.840 1.404 1.738 1.515 1.948 1.469 1.908 1.380 1.812 Lông phân giải (g) Tỷ lệ (%) 0.055 0.045 0.048 0.070 0.067 0.060 0.044 0.037 0.049 0.048 0.042 0.040 0.052 0.055 0.055 0.050 0.052 0.046 0.057 0.053 0.048 0.050 0.056 0.054 0.029 0.032 0.033 0.058 0.050 0.053 0.059 0.056 0.053 0.063 0.066 0.067 0.153 0.158 0.159 0.084 0.097 0.094 0.009 0.014 0.016 0.067 0.073 0.070 0.043 0.042 0.050 0.157 0.167 0.166 0.067 0.061 0.068 11.0 9.0 9.6 14.0 13.4 12.0 8.8 7.4 9.8 9.6 8.4 8.0 10.4 11.0 11.0 10.0 10.4 9.2 11.4 10.9 9.6 10.0 11.2 10.8 5.8 6.4 6.6 11.6 10.0 10.6 11.8 11.2 10.6 12.6 13.2 13.4 30.6 31.8 31.8 16.8 19.4 18.8 1.8 2.8 3.2 13.4 14.6 14.0 8.6 8.4 10.0 31.4 33.4 33.2 13.4 12.2 13.6 34 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 20 K20 21 Đối chứng 3 1.374 1.542 1.429 1.404 1.354 1.249 Trường ĐHCT 1.775 1.939 1.822 1.902 1.851 1.747 0.099 0.103 0.107 0.002 0.003 0.002 19.8 20.6 21.4 0.4 0.6 0.4 Bảng 9: Tỷ lệ phân giải bột lông gia cầm dòng vi khuẩn STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Ký hiệu vi khuẩn K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 Khối lƣợng giấy lọc (g) Trƣớc Sau 1.367 1.770 1.472 1.876 1.465 1.862 1.431 1.781 1.499 1.857 1.321 1.677 1.452 1.794 1.500 1.846 1.368 1.713 1.482 1.900 1.425 1.841 1.325 1.739 1.491 1.771 1.550 1.832 1.393 1.680 1.267 1.600 1.290 1.627 1.339 1.678 1.320 1.596 1.371 1.641 1.431 1.700 1.274 1.639 1.350 1.730 1.254 1.625 1.377 1.779 1.451 1.844 1.414 1.818 1.414 1.732 1.398 1.710 1.439 1.757 1.297 1.498 1.325 1.535 1.498 1.700 1.417 1.777 1.447 1.812 1.412 1.765 1.464 1.664 1.396 1.856 1.484 1.674 1.425 1.652 1.407 1.629 1.414 1.635 1.418 1.830 1.424 1.833 1.402 1.809 1.495 1.788 1.432 1.732 1.413 1.716 1.016 1.406 1.367 1.757 1.389 1.782 Lông phân giải (g) 0.097 0.096 0.103 0.150 0.142 0.144 0.158 0.154 0.155 0.082 0.084 0.086 0.220 0.218 0.213 0.167 0.163 0.161 0.224 0.230 0.231 0.135 0.120 0.129 0.098 0.107 0.096 0.182 0.188 0.182 0.299 0.290 0.298 0.140 0.135 0.147 0.300 0.310 0.310 0.273 0.278 0.279 0.088 0.091 0.093 0.207 0.200 0.197 0.110 0.110 0.107 Tỷ lệ (%) 19.4 19.2 20.6 30.0 28.4 28.8 31.6 30.8 31.0 16.4 16.8 17.2 44.0 43.6 42.6 33.4 32.6 32.2 44.8 46.0 46.2 27.0 24.0 25.8 19.6 21.4 19.2 36.4 37.6 36.4 59.8 58.0 59.6 28.0 27.0 29.4 60.0 62.0 62.0 54.6 55.6 55.8 17.6 18.2 18.6 41.4 40.0 39.4 22.0 22.0 21.4 35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 18 K18 19 K19 20 K20 21 Đối chứng 3 3 1.374 1.487 1.488 1.399 1.288 1.511 1.388 1.426 1.408 1.479 1.365 1.489 Trường ĐHCT 1.575 1.689 1.695 1.796 1.678 1.904 1.588 1.634 1.612 1.972 1.856 1.983 0.299 0.298 0.293 0.103 0.110 0.107 0.300 0.292 0.296 0.007 0.009 0.006 59.8 59.6 58.6 20.6 22.0 21.4 60.0 58.4 59.2 1.4 1.8 1.2 Bảng 10: Mật số dòng vi khuẩn STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ký hiệu vi khuẩn K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 Mật số vi khuẩn (108CFU/ml) 0.7 0.7 3.3 0.7 2.7 1.3 5.3 0.7 0.7 3.3 6.7 0.7 7.3 6.7 6.0 1.3 1.3 6.7 0.7 4.7 36 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Kết thống kê thí nghiệm a) Hoạt tính keratinase dòng vi khuẩn One-way ANOVA: Hoạt tính U/ml versus Kí hiệu vi khuẩn Source Kí hiệu vi khuẩn Error Total S = 1.529 Level K1 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K2 K20 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 DF 19 40 59 SS 2527.50 93.50 2621.00 R-Sq = 96.43% Mean 4.000 7.333 12.167 16.667 24.167 17.833 9.167 17.167 11.833 19.667 20.833 8.333 20.500 2.667 8.000 21.667 2.833 11.500 16.000 7.667 StDev 1.732 2.255 0.577 0.764 1.528 1.443 1.607 2.021 1.443 1.528 1.443 1.155 1.323 0.577 1.323 2.754 0.289 1.323 1.732 1.607 MS 133.03 2.34 F 56.91 P 0.000 R-Sq(adj) = 94.74% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---------+---------+---------+---------+ (--*-) (-*--) (-*--) (--*-) (--*-) (-*--) (-*--) (--*-) (--*-) (-*--) (--*-) (--*-) (-*--) (--*-) (-*--) (--*--) (--*--) (-*--) (--*-) (--*--) ---------+---------+---------+---------+ 7.0 14.0 21.0 28.0 Pooled StDev = 1.529 37 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Grouping Information Using Tukey Method Kí hiệu vi khuẩn K13 K5 K19 K20 K18 K14 K16 K12 K8 K11 K17 K7 K15 K2 K4 K9 K10 K1 K6 K3 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 24.167 21.667 20.833 20.500 19.667 17.833 17.167 16.667 16.000 12.167 11.833 11.500 9.167 8.333 8.000 7.667 7.333 4.000 2.833 2.667 Grouping A A B A B C A B C D A B C D B C D B C D C D E D E F E F G F G F G G G G G H H H H H H H I I I I J I J J J Means that not share a letter are significantly different. 38 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT b) Khả phân giải bột lông heo dòng vi khuẩn One-way ANOVA: Tỷ lệ phân giải (%) versus Kí hiệu vi khuẩn Source Kí hiệu vi khuẩn Error Total S = 0.8368 Level ĐC K1 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K2 K20 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 DF 20 42 62 SS 3647.537 29.413 3676.950 R-Sq = 99.20% Mean 0.467 9.867 10.733 11.200 12.400 31.333 18.333 2.600 14.000 9.000 32.667 13.067 13.133 20.600 8.667 8.667 10.800 9.867 10.533 10.667 6.267 StDev 0.115 1.026 0.808 0.600 1.114 0.643 1.361 0.721 0.600 0.872 1.102 0.757 1.026 0.800 1.206 0.833 0.346 0.611 0.902 0.611 0.416 MS 182.377 0.700 F 260.42 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.82% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) -+---------+---------+---------+-------0 10 20 30 Pooled StDev = 0.837 39 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Grouping Information Using Tukey Method Kí hiệu vi khuẩn K18 K13 K20 K14 K16 K2 K19 K12 K11 K5 K10 K8 K7 K1 K6 K17 K3 K4 K9 K15 ĐC N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 32.667 31.333 20.600 18.333 14.000 13.133 13.067 12.400 11.200 10.800 10.733 10.667 10.533 9.867 9.867 9.000 8.667 8.667 6.267 2.600 0.467 Grouping A A B B C C D C D E C D E D E D E D E D E E F F F F F F F F G G G G G G G G G H G H H I I Means that not share a letter are significantly different. 40 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT c) Khả phân giải bột lông gia cầm dòng vi khuẩn One-way ANOVA: Tỷ lệ phân giải (%) versus Kí hiệu vi khuẩn Source Kí hiệu vi khuẩn Error Total S = 0.8250 Level ĐC K1 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K2 K20 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 DF 20 42 62 SS 17480.17 28.59 17508.75 R-Sq = 99.84% Mean 1.467 19.733 36.733 59.133 28.133 61.333 55.333 18.133 40.267 21.800 59.333 21.333 29.067 59.200 31.133 16.800 43.400 32.733 45.667 25.600 20.067 StDev 0.306 0.757 0.577 0.987 1.206 1.155 0.643 0.503 1.026 0.346 0.643 0.702 0.833 0.800 0.416 0.400 0.721 0.611 0.757 1.510 1.172 MS 874.01 0.68 F 1284.11 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.76% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------(*) *) (*) (*) (* *) (* *) *) (* (*) *) *) (*) *) (* *) *) (* (*) (* +---------+---------+---------+--------0 16 32 48 Pooled StDev = 0.825 41 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Grouping Information Using Tukey Method Kí hiệu vi khuẩn K13 K18 K20 K11 K14 K7 K5 K16 K10 K6 K3 K2 K12 K8 K17 K19 K9 K1 K15 K4 ĐC N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 61.333 59.333 59.200 59.133 55.333 45.667 43.400 40.267 36.733 32.733 31.133 29.067 28.133 25.600 21.800 21.333 20.067 19.733 18.133 16.800 1.467 Grouping A A A A B C C D E F F G G H H I I J J J K J K K L L M Means that not share a letter are significantly different 42 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... lệ phân giải keratin từ hai nguồn cơ chất khác nhau và hoạt độ keratinase của các dòng vi khuẩn Tất cả 20 dòng vi khuẩn đều phân lập từ nguồn chất thải tại lò giết mổ heo, nhưng từ hình 5 cho thấy những dòng vi khuẩn này không phân giải keratin từ lông heo hiệu quả bằng phân giải keratin từ lông gia cầm Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trương Văn Thọ (2013) khi khảo sát khả năng phân giải. .. đất, nước và lông thu tại 5 cơ sở giết mổ heo huyện Vũng Liêm, Vĩnh Long phân lập được 20 dòng vi khuẩn, trong đó có 7 dòng từ mẫu đất, 9 dòng từ mẫu lông và 4 dòng từ mẫu nước Tất cả 20 dòng vi khuẩn đều phát triển tốt sau 48 giờ trên môi trường chứa bột lông heo là nguồn carbon và nitơ duy nhất chứng tỏ chúng có thể sử dụng cơ chất chứa keratin để sinh trưởng và phát triển - Vi khuẩn phân lập từ mẫu... Trường ĐHCT Hai dòng vi khuẩn K13 và K18 phân giải mạnh lông heo và lông gia cầm là những vi khuẩn tiềm năng cho mục tiêu phân giải lông gia súc gia cầm từ nguồn rác thải chứa keratin Từ hình 5 cũng cho thấy không có sự tương quan hoàn toàn giữa hoạt độ keratinase và khả năng phân giải keratin của vi khuẩn Dòng K13, K18, K20 là những vi khuẩn có hoạt độ keratinase và tỷ lệ phân giải keratin cao so với... hai dòng vi khuẩn K18 và K19 26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đề tài phân lập được 20 dòng vi khuẩn từ chất thải tại một số cơ sở giết mổ heo huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long Các dòng vi khuẩn đều phát triển tốt trên cơ chất bột lông heo sau 48 giờ - Dòng vi khuẩn có... khả năng phân giải keratin của các dòng vi khuẩn xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và Minitab để tuyển chọn ít nhất hai dòng vi khuẩn phân giải keratin mạnh 16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập các dòng vi khuẩn phân giải keratin 4.1.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn Từ các mẫu... trúc keratin dạng β, sự khác nhau về cấu trúc keratin trong hai cơ chất có thể là nguyên nhân của sự khác biệt trên Vi khuẩn được phân lập từ chất thải lò giết mổ heo nhưng phân giải lông gia cầm tốt hơn lông heo chứng tỏ khả năng phân giải loại cơ chất chứa keratin của vi khuẩn không phụ thuộc vào nguồn phân lập vi khuẩn 24 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt... hoạt tính keratinase cao nhất là K13 với 24,2U/ml, hoạt tính thấp nhất là dòng K3 với 2,7U/ml Hai dòng vi khuẩn K13 và K5 là những vi khuẩn tiềm năng ứng dụng trong sản xuất enzyme keratinase thương mại - Vi khuẩn phân giải keratin từ lông gia cầm tốt hơn keratin từ lông heo - Khả năng phân giải keratin của vi khuẩn không hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt độ enzyme keratinase - Hai dòng vi khuẩn K13 và K18... năng phân giải mạnh cả lông heo và lông gia cầm là những vi khuẩn ứng vi n cho mục tiêu phân giải lông gia súc gia cầm từ nguồn rác thải chứa keratin 5.2 Kiến nghị - Từ những dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin cao đã phân lập được, tiếp tục có những nghiên cứu để tạo ra những chế phẩm sinh học phân hủy keratin ứng dụng vào thực tiễn - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải keratin. .. Phân lập và tuyển chọn được ít nhất hai dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh từ chất thải tại một số cơ sở giết mổ heo ở huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long 2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về keratin và chất thải chứa keratin Keratin thuộc họ protein cấu trúc dạng sợi,... phân lập được các vi khuẩn có khả năng phân giải keratin thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 30oC và cũng tại nhiệt độ này, lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại Riffel và Brandelli (2006) tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lông gia cầm Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi . LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN THÙY LINH MSSV: 310 2826 LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SNH