phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ phân trùn quế (perionyx excavatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM TỪ PHÂN TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS BÙI THỊ MINH DIỆU LÊ THỊ BẢO TRÂN MSSV: 3113763 LỚP: VI SINH VẬT HỌC k37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM TỪ PHÂN TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS BÙI THỊ MINH DIỆU LÊ THỊ BẢO TRÂN MSSV: 3113763 LỚP: VI SINH VẬT HỌC k37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Bùi Thị Minh Diệu Lê Thị Bảo Trân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong suốt thời gian học tập mái trường Đại Học Cần Thơ, em nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm động viên từ gia đình, quý thầy cô, anh chị bạn bè xung quanh Cho đến em bắt đầu làm đề tài luận văn tốt nghiệp nhiệt tình giúp đỡ, lòng tận tụy dạy thầy cô, anh chị trước bạn bè trở thành động lực lớn giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Viện tạo môi trường thuận lợi để anh chị bạn sinh viên Viện học tập, làm việc nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến giảng viên hướng dẫn TS Bùi Thị Minh Diệu, cô tận tình hướng dẫn trực tiếp để giúp em thực luận văn Em xin chân thành gửi lời cảm ơn anh chị bạn phòng Sinh học phân tử thực vật, phòng thí nghiệm Sinh hóa, phòng thí nghiệm Thực phẩm giúp đỡ hỗ trợ cho em thời gian thực đề tài Lời cuối em kính chúc quý thầy cô, anh chị bạn nhiều sức khỏe thành công! TÓM LƯỢC Phân trùn Quế thu từ thí nghiệm nuôi trùn ba nguồn chất: phân bò, phân heo phân vịt Mặc dù chất nuôi trùn khác phân trùn thu có chung đặc tính tốt: hàm lượng dinh dưỡng độ ẩm cao, tơi xốp, thoáng khí,…đặc biệt chứa hỗn hợp vi sinh vật có hoạt tính cao Đề tài: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ phân trùn Quế (Perionyx excavates), phân lập 39 dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonium 38 dòng vi khuẩn có khả khử nitrite từ mẫu phân trùn Các dòng vi khuẩn phân lập có hai dạng tế bào hình cầu hình que ngắn Với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn môi trường Vinogradski bổ sung NH4+ NO2- nồng độ ammonium nitrite tăng dần tuyển chọn 10 dòng vi khuẩn: NHB8, NHB9, NHB11, NHB13, NHB14, NHB15, NHB16, NHB24, NHB26, NHH4 có khả chuyển hóa ammonium tốt nồng độ NH4+ 7.2 g/l 13 dòng vi khuẩn: NOH2, NOH4, NOH6, NOH7, NOH10, NOH11, NOH12, NOH13, NOH16, NOV1, NOV12, NOB2, NOB4 có khả khử nitrite mạnh nồng độ NO2- 0.5 g/l môi trường rắn Trong số 13 dòng vi khuẩn khử nitrite mạnh chọn dòng vi khuẩn: NOH2, NOH6, NOH7, NOH12, NOH13, NOB2 có khả nitrate hóa hoàn toàn NO2- nồng độ nitrite 0.5 g/l Từ khóa: chuyển hóa đạm, chuyển hóa ammonium, khử nitrite, nitrate hóa, trùn Quế, vi khuẩn, i MỤC LỤC TÓM LƯỢC …………………………………………………………………………i MỤC LỤC ………………………………………………………………………… ii DANH SÁCH BẢNG ……………………………………………………………….iv DANH SÁCH HÌNH ………………………………………… …………………… vi CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Trùn Quế .2 2.1.1 Giới thiệu .2 2.1.2 Đặc tính sinh lý trùn Quế 2.1.3 Sinh sản phát triển .3 2.2 Phân trùn (vermicompost) 2.3 Hệ vi sinh vật phân trùn Quế .5 2.4 Một số giống vi khuẩn chuyển hóa đạm tiêu biểu .5 2.4.1 Vi khuẩn Pseudomonas sp 2.4.2 Vi khuẩn Nitrosomonas sp 2.4.3 Vi khuẩn Bacillus sp 2.4.4 Vi khuẩn Corynebacterium Spp 2.4.5 Vi khuẩn Micrococcus Spp 10 2.4.6 Vi khuẩn Staphyloccus Spp .10 2.5 Chu trình nitơ .11 2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa đạm 13 a Nghiên cứu giới .13 b Nghiên cứu nước 15 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 3.1 Phương tiện nghiên cứu 16 3.1.1 Dụng cụ thiết bị 16 3.1.2 Nguyên liệu 16 3.1.3 Hoá chất .16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Thu thập mẫu 17 3.2.2 Phân lập vi khuẩn 17 a Xử lý mẫu 17 b Phân lập 18 c Tách ròng 18 d Kiểm tra độ ròng 18 ii e Trữ mẫu 18 f Quan sát mô tả khuẩn lạc vi khuẩn 19 g Quan sát mô tả tế bào vi khuẩn 19 h Nhuộm Gram 19 3.2.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả chuyển hoá ammonium cao 20 3.2.4 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả nitrate hoá cao 20 3.2.5 Nhận diện sơ vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonium nitrate hóa mạnh tuyển chọn 22 a Phản ứng oxydase 22 b Phản ứng catalase 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Đặc điểm dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium phân lập 23 4.2 Tuyển chọn dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium mạnh .31 4.3 Đặc điểm dòng vi khuẩn nitrate hóa phân lập 39 4.4 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả nitrate hóa mạnh 46 4.4.1 Khảo sát khả nitrate hóa dòng vi khuẩn môi trường 46 4.4.2 Phương pháp định tính NO3 .55 4.5 Nhận diện sơ vi khuẩn chuyển hóa ammonium vi khuẩn nitrate hóa phương pháp truyền thống 57 4.5.1 Nhận diện dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium mạnh 57 a Kết khảo sát đặc điểm hình thái, nhuộm Gram vi khuẩn 57 b Định danh sơ 59 4.5.2 Nhận diện dòng vi khuẩn nitrate hóa mạnh tuyển chọn 60 a Kết khảo sát đặc điểm hình thái, nhuộm Gram vi khuẩn 60 b Định danh sơ 62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Thành phần hóa học loại phân chuồng Bảng 2.2: Thành phần hóa học phân trùn nguyên chất Bảng 3.1 Thành phần môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ, bổ sung ammonium nitrite 16 Bảng 4.1: Kí hiệu nguồn gốc dòng vi khuẩn chuyển hóa NH4+ phân lập 23 Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa NH4+ 25 Bảng 4.3: Đặc điểm dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium phân lập 28 Bảng 4.4: Đánh giá khả chuyển hóa NH4+ dòng vi khuẩn phân lập nồng tăng dần 1.2 g/l; 2.4 g/l; 3.6 g/l; 4.8 g/l 31 Bảng 4.5: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường Vinogradski bổ sung NH4+ nồng độ 1.2 g/l; 2.4 g/l; 3.6 g/l; 4.8 g/l 33 Bảng 4.6: Đánh giá khả chuyển hóa NH4+ dòng vi khuẩn phân lập nồng tăng dần g/l; 7.2 g/l; 8.4 g/l 34 Bảng 4.7: Khả phát triển dòng vi khuẩn phát triển môi trường Vinogradski bổ sung NH4+ nồng độ g/l; 7.2 g/l; 8.4 g/l 36 Bảng 4.8: Kí hiệu nguồn gốc dòng vi khuẩn chuyển hóa NO2- phân lập 39 Bảng 4.9: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa NO2- 41 Bảng 4.10: Đặc điểm dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium phân lập 44 Bảng 4.11: Đánh giá khả chuyển hóa NO2- dòng vi khuẩn phân lập nồng tăng dần 0.1 g/l, 0.2 g/l, 0.3 g/l 46 Bảng 4.12: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường Vinogradski bổ sung NO2- nồng độ 0.1 g/l; 0.2 g/l; 0.3 g/l 48 Bảng 4.13: Đánh giá khả chuyển hóa NO2- dòng vi khuẩn phân lập nồng tăng dần 0.4 g/l, 0.5 g/l, 0.6 g/l ………49 Bảng 4.14: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường Vinogradski bổ sung NO2- nồng độ 0.4 g/l; 0.5 g/l; 0.6 g/l 51 Bảng 4.15: Mô tả đặc điểm vi khuẩn chuyển hóa ammonium tuyển chọn 56 Bảng 4.16: Mô tả đặc điểm dòng vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn ……….59 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Peryonyx excavates (bottom) Eisenia fetida (top)……………………….2 Hình 2.1: Vi khuẩn Pseudomonas sp… ………………………………………… Hình 2.2: Vi khuẩn Nitrosomonas sp ………………………………………………….7 Hình 2.3: Vi khuẩn Bacillus sp………… ……………………………………… …… Hình 2.4: Vi khuẩn Corynebacterium Spp……… ……………………… … ……… Hình 2.5: Vi khuẩn Micrococcus Spp… … …………………………… … …… 10 Hình 2.6: Vi khuẩn Staphylococcus Spp…… …………………………… …… 10 Hình 2.7: Chu trình nitơ… 11 Hình 4.1: Một số hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa ammonium 28 Hình 4.2: Vi khuẩn nhuộm Gram 31 Hình 4.3: Một số hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa ammonium……… 43 Hình 4.4: Vi khuẩn Gram âm 46 Hình 4.5: Vi khuẩn Gram dương…………………………………………… …… 46 Hình 4.6: Khả nitrate dòng vi khuẩn ngày nuôi thứ 7…………… 54 Hình 4.7: Khả nitrate dòng vi khuẩn ngày nuôi thứ 11…………… 55 Hình 4.8: Vi khuẩn chuyển hóa NH4+ có phản ứng oxidase âm tính……….……… 57 Hình 4.9: Vi khuẩn chuyển hóa NH4+ có phản ứng catalase dương tính………… …58 Hình 4.10: Vi khuẩn hình cầu NHB13 58 Hình 4.11: Vi khuẩn nitrate hóa có phản ứng oxydase âm tính 60 Hình 4.12: Vi khuẩn nitrate hóa có phản ứng catalase dương tính .61 Hình4.13 : Vi khuẩn hình cầu NOH7……………………………… ……………… 61 v Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đạm xem nguồn dinh dưỡng chủ yếu cần thiết cho sinh trưởng phát triển thực vật Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sử dụng đạm trồng, thị trường có nhiều loại phân bón hóa học giàu đạm sản xuất với số lượng lớn Tuy nhiên, theo Võ Minh Kha, 2013 Khi bón phân đạm hóa học, có khoảng 50% – 60% lượng đạm bón vào đất trồng hấp thụ được, phần đạm lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi bị chuyển hóa bốc dạng NH3, NOx, N2 Thực tế có nhiều phương pháp nghiên cứu ứng dụng việc cải thiện khả sử dụng đạm có phân bón thực vật giải pháp làm giảm thiểu mức độ ô nhiễm môi trường sử dụng phân bón hóa học sản suất nông nghiệp Tuy nhiên, phương pháp sủ dụng phân trùng Quế làm phân bón cho trồng xem có nhiều triển vọng việc khắc phục nhược điểm không mong muốn so với loại phân bón hóa học thông thường Phân trùn chứa hàm lượng vi sinh vật tương đối cao phong phú Theo Martin (1976), trùn Quế có khả tiêu hóa tốt vật liệu hữu nguồn chất thải từ gia súc gia cầm thành sản phẩm hữu giàu dinh dưỡng, đặc biệt nguồn hữu giàu đạm (NH4+ NO3-) Trùn Quế thực khả nhờ vào hệ vi sinh vật phong phú diện đường tiêu hóa trùn Các chất hữu có môi trường trùn Quế sử dụng biến đổi nơi hệ tiêu hóa, sau đó, sản phẩm trình trao đổi chất, đặc biệt phân trùn đào thải trở lại môi trường bên Theo nghiên cứu Vũ Đình Tôn (2009), cho trùn Quế ăn nguồn chất phân heo, phân bò, phân tích thấy thành phần hóa học phân trùn có hàm lượng NH4+ NO3- tăng cao so với nguồn chất ban đầu Vì vậy, đề tài: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ phân trùn Quế” thực nhằm tìm kiếm dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa đạm cao để ứng dụng sản xuất phân vi sinh 1.2 Mục tiêu đề tài Tuyển chọn số dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa đạm mạnh từ phân trùn Quế Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Bảng 4.14: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường Vinogradski bổ sung NO2- nồng độ 0.4 g/l; 0.5 g/l; 0.6 g/l Nồng độ Tiêu chí đánh giá 0.4 g/l 0.5 g/l 0.6 g/l Tốt (%) 23.68 10.53 Khá(%) 18.42 23.68 18.42 Trung bình (%) 13.16 7.89 15.79 Yếu (%) 10.53 10.53 2.63 Không phát triển (%) 36.84 47.37 63.16 Kết quả, không tìm thấy dòng vi khuẩn có khả khử nitrite tốt (++++) nồng độ 0.6 g/l Những dòng vi khuẩn khử nitrite (+++) nồng độ 0.6 g/l trùng với dòng vi khuẩn khử nitrite tốt nồng độ 0.5g/l Do đó, môi trường Vinogradski bổ sung NO2- có nồng độ 0.5 g/l chọn làm môi trường bổ sung nồng độ NO2- cao để tìm dòng vi khuẩn có khả khử nitrite mạnh (++++) Vì vậy, môi trường bổ sung NO2- 0.5g/l, dòng vi khuẩn có khả khử nitrite tốt xem dòng vi khuẩn khử nitrite mạnh môi trường Vinogradski rắn nồng độ nitrite cao (vì mức tốt đánh giá có khác biệt ý nghĩa) Như vậy, có 13/38 dòng vi khuẩn chọn, dòng khử nitrite mạnh môi trường Vinogradski rắn có nồng độ NO2- 0.5g/l Mười ba dòng vi khuẩn nuôi môi trường lỏng để kiểm tra khả nitrate hóa phương pháp định tính với thuốc thử Griss I Griss II Thí nghiệm nhằm kiểm tra khả phát triển vi khuẩn môi trường Vinogradski đặc có liên quan đến khả nitrate hóa hay không 47 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Hình chụp đường cấy vi khuẩn phát triển tốt môi trường Vinogradski rắn nồng độ NO2- tăng dần Nồng độ NO2- = 0.1 g/l Nồng độ NO2- = 0.2 g/l Nồng độ NO2- = 0.3 g/l 48 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Nồng độ NO2- = 0.4 g/l Nồng độ NO2- = 0.5 g/l Nồng độ NO2- = 0.6 g/l 49 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT 4.4.2 Phương pháp định tính NO3 Mười ba dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrite mạnh môi trường Vinogradski rắn (có nồng độ nitrite 0.5g/l) chuyển sang môi trường lỏng có nồng độ nitrite 0.5 g/l, ủ lắc 30oC thời gian - 11 ngày để kiểm tra khả nitrate hóa thuốc thử Griss Nếu môi trường có tồn nitrite, hỗn hợp dung dịch chuyển sang màu hồng đậm Thí nghiệm 1: kiểm tra khả nitrate hóa dòng vi khuẩn ngày nuôi thứ Hình 4.6: Khả nitrate hóa dòng vi khuẩn ngày nuôi thứ Kết phản ứng thuốc thử Griss nồng độ 0.5 g/l sau ngày nuôi (Hình 4.6), có năm dòng vi khuẩn nitrate hóa hoàn toàn là: NOH6, NOH7, NOH12, NOH13, NOV12 so sánh với đối chứng nitrate dung dịch phản ứng có màu nhạt thuốc thử Tám dòng vi khuẩn bao gồm: NOH10, NOH11, NOH16, NOB2, NOB4, NOV1, NOH2, NOH4 phản ứng với thuốc thử cho màu nâu đỏ, giống với màu đối chứng có nitrite Chứng tỏ tám dòng vi khuẩn khả nitrate hóa phản ứng nitrate hóa chưa xảy hoàn toàn Do đó, thí 50 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT nghiệm tiếp tục thực ngày nuôi thứ 11 tám dòng vi khuẩn Vì khả nitrate hóa dòng vi khuẩn thể ngày nuôi Thí nghiệm 2: kiểm tra khả nitrate hóa dòng vi khuẩn ngày nuôi thứ 11 Hình 4.7: Khả nitrate hóa dòng vi khuẩn ngày nuôi thứ 11 Tám dòng vi khuẩn chọn: NOV1, NOH10, NOH11, NOH16, NOH4, NOB4, NOB2, NOH2 thí nghiệm để kiểm tra khả nitrate hóa ngày nuôi thứ 11 cho kết quả: hai dòng vi khuẩn (NOB2 NOH2) có khả nitrate hóa cho phản ứng màu với thuốc thử gần giống với màu đối chứng nitrite, sáu dòng vi khuẩn (NOV1, NOH10, NOH11, NOH16, NOH4, NOB4) khả nitrate hóa cho phản ứng màu nâu đỏ với thuốc thử gần giống với màu đối chứng có nitrite Từ thí nghiệm chọn dòng vi khuẩn có có khả khử nitrate hóa tốt: NOH6, NOH7, NOH12, NOH13, NOV12, NOB2, NOH2 Kết cho thấy, điều kiện môi trường nuôi cấy, khả nitrate hóa vi khuẩn phụ thuộc vào dòng vi khuẩn thời gian nuôi khác Mặc khác, so sánh nuôi cấy vi khuẩn môi trường Vinogradski đặc có nồng độ nitrite cao để chọn dòng vi khuẩn có khả khử nitrite mạnh cho kết khác biệt so với thí nghiệm định tính thuốc thử Griss Bởi vì, có số dòng vi khuẩn phát triển tốt 51 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT môi trường Vinogradski đặc có nồng độ nitrite cao đem định tính thuốc thử Griss, kết vi khuẩn khả nitrate hóa Điều chứng tỏ rằng, vi khuẩn sống môi trường đặc chuyên biệt chưa hẳn vi khuẩn có khả nitrate hóa Vì vậy, phương pháp định tính với thuốc thử để kiểm tra khả nitrate hóa dòng vi khuẩn cần thiết để kết thí nghiệm có độ xác cao 4.5 Nhận diện sơ vi khuẩn chuyển hóa ammonium vi khuẩn nitrate hóa phương pháp truyền thống 4.5.1 Nhận diện dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium mạnh Ba mẫu phân trùn Quế thu từ thí nghiệm nuôi trùn môi trường chất phân heo, phân bò vịt chọn để phân lập vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonium cao Kết quả, phân lập 10 dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonium tốt môi trường Vinogradski có nồng độ NH4+ 7.8 g/l Tiến hành khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa 10 dòng vi khuẩn định danh sơ dòng vi khuẩn tuyển chọn a Kết khảo sát đặc điểm hình thái, nhuộm Gram vi khuẩn Mười dòng vi khuẩn nhuộm Gram quan sát kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần Kết thu được, có năm dòng vi khuẩn: NHB8, NHB13, NHB16, NHB24, NHB26 bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram dương có năm dòng vi khuẩn: NHB9, NHB11, NHB14, NHB15, NHH4, bắt màu hồng đỏ, vi khuẩn Gram âm Kết khảo sát đặc điểm hình thái nhuộm Gram vi khuẩn chuyển hóa ammonium trình bày Bảng 4.15 52 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Bảng 4.15: Mô tả đặc điểm vi khuẩn chuyển hóa ammonium tuyển chọn STT Vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Kích thước khuẩn lạc (mm) Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào vi khuẩn Gra m Chuyển động NHB8 Vàng nhạt Không Hình cầu + - NHB9 Cam nâu Tròn 0.3 Que ngắn - + NHB11 Trắng đục Tròn 3.5 Que ngắn - + NHB13 Trắng Tròn 2.5 Hình cầu + + NHB14 Trắng đục Tròn Que ngắn - + NHB15 Trắng đục Tròn Que ngắn - + NHB16 Trắng đục Tròn 0.5 Hình cầu + - NHB24 Vàng nâu Tròn Hình cầu + - NHB26 Trắng đục Không 0.8 Hình cầu + - Trắng đục Tròn 0.2 Que ngắn - + 10 NHH4 (+) chuyển động, Gram dương (-) không chuyển động, Gram âm b Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa Phản ứng oxydase: Sử dụng giấy tẩm N-dimethyl-paraphenylenediamine để xác định vi khuẩn hiếu khí hay kị khí Vi khuẩn hiếu khí sinh enzyme oxydase, có diện cytochrome C tế bào, thuốc thử p-phenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương Kết thử nghiệm oxydase, dòng vi khuẩn phân lập âm tính với thuốc thử p-phenylenediamine Hình 4.8: Vi khuẩn chuyển hóa NH4+ phản ứng oxydase âm tính 53 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Phản ứng catalase Khảo sát hoạt tính catalase nhằm xác định có mặt enzyme catalase tế bào vi khuẩn Enzyme catalase phân giải H2O2 tạo tượng sủi bọt nhằm xác định vi khuẩn có hệ enzyme catalase Kết kiểm tra, phản ứng catalase dương tính tất dòng vi khuẩn Hình 4.9: Vi khuẩn chuyển hóa NH4+ phản ứng catalase dương tính c Định danh sơ Từ đặc điểm hình thái kết hợp với đặc điểm sinh hóa, tiến hành nhận diện sơ vi khuẩn phân lập dựa vào biểu đồ phân loại vi khuẩn học Bergey (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology) Các dòng vi khuẩn phân lập có đặc tính sinh hóa phù hợp với đặc tính sinh hóa số chi họ vài nhóm vi khuẩn biểu đồ phân loại Bergey Những dòng vi khuẩn phân lập xếp vào hai nhóm  Nhóm 1: vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, phản ứng oxydase âm tính nên xếp vào họ Enterobacteriaceae  Nhóm 2: vi khuẩn hình cầu, Gram dương, phản ứng catalase dương tính nên xếp vào hai nhóm Microccocus spp Staphylococcus spp Hình 4.10: Vi khuẩn hình cầu NHB13 54 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT 4.5.2 Nhận diện dòng vi khuẩn nitrate hóa mạnh tuyển chọn Ba mẫu phân trùn Quế thu từ thí nghiệm nuôi trùn môi trường chất phân heo, phân bò vịt chọn để phân lập vi khuẩn có khả khử nitrite Kết quả, phân lập dòng vi khuẩn có khả nitrate hóa tốt môi trường Vinogradski có nồng độ NO2- cao (0.5 g/l) Tiến hành khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa dòng vi khuẩn định danh sơ dòng vi khuẩn a Kết khảo sát đặc điểm hình thái, nhuộm Gram vi khuẩn Bảy dòng vi khuẩn nhuộm Gram quan sát kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần Kết thu được, có năm dòng vi khuẩn: NOH7, NOB12, NOB13, NOV12, NOB2 bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram dương có năm dòng vi khuẩn: NOH2, NOH6 bắt màu hồng đỏ, vi khuẩn Gram âm Kết khảo sát đặc điểm hình thái nhuộm Gram dòng vi khuẩn nitrate hóa trình bày Bảng 4.16 Bảng 4.16: Mô tả đặc điểm dòng vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn STT Vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Kích thước khuẩn lạc (mm) Hình dạng tế bào vi khuẩn Gram Chuyển động NOH2 Trắng Tròn 0.2 Hình cầu - + NOH6 Trắng đục Tròn 0.8 Que ngắn - + NOH7 Trắng Tròn 0.8 Hình cầu + + NOH12 Trắng đục Không 0.6 Que ngắn + + NOH13 Trắng đục Không 1.2 Que ngắn + + NOV12 Vàng nâu Tròn Hình cầu + + NOB2 Hồng phấn Tròn 0.6 Que ngắn + + (+) chuyển động, Gram dương (-) không chuyển động, Gram âm 55 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT b Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa Phản ứng oxydase Sử dụng giấy tẩm N-dimethyl-paraphenylenediamine để xác định vi khuẩn hiếu khí kị khí 13 dòng vi khuẩn phân lập Vi khuẩn hiếu khí sinh enzyme oxydase, có diện cytochrome C tế bào, thuốc thử pphenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương Kết thử nghiệm oxydase, dòng vi khuẩn phân lập âm tính với thuốc thử pphenylenediamine Hình 4.11: Vi khuẩn khử nitrate phản ứng oxydase âm tính Phản ứng catalase Khảo sát hoạt tính catalase nhằm xác định có mặt enzyme catalase tế bào vi khuẩn Enzyme catalase phân giải H2O2 tạo tượng sủi bọt nhằm xác định vi khuẩn có hệ enzyme catalase Kết kiểm tra, phản ứng catalase dương tính tất dòng vi khuẩn Hình 4.12: Vi khuẩn khử nitrite phản ứng catalase dương tính 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT c Định danh sơ Từ đặc điểm hình thái kết hợp với đặc điểm sinh hóa, tiến hành nhận diện sơ vi khuẩn phân lập dựa vào biểu đồ phân loại vi khuẩn học Bergey (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology) Các dòng vi khuẩn phân lập đặc điểm hình thái sinh hóa phù hợp với đặc tính số chi họ vài nhóm vi khuẩn biểu đồ phân loại Bergey Những dòng vi khuẩn phân lập xếp vào bốn nhóm  Nhóm 1: vi khuẩn hình que ngắn, Gram dương, phản ứng catalase dương tính, xếp vào chi Corynebacterium Spp chi Bacillus Spp  Nhóm 2: vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, phản ứng oxydase âm tính, xếp vào họ Enterobacteriaceae  Nhóm 3: vi khuẩn hình cầu, Gram dương, phản ứng catalase dương tính, xếp vào chi Micrococcus Spp chi Staphylococcus Spp  Nhóm 4: vi khuẩn hình cầu, Gram âm thuộc chi Neisseria Veillonella Hình 4.13 : vi khuẩn hình cầu NOH7 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phân lập 39 dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonium 38 dòng vi khuẩn có khả khử nitrite phân trùn Quế, thu từ thí nghiệm nuôi trùn ba nguồn chất khác nhau: phân bò, phân heo, phân vịt Trong số 39 dòng vi khuẩn phân lập môi trường Vinodradski bổ sung NH4+, tuyển chọn 10 dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonium nồng độ 7.2 g/l Kết định danh sơ xác định 10 dòng vi khuẩn xếp vào họ Enterobacteriaceae hai chi Micrococcus spp Staphylococcus spp Đồng thời, 13 dòng vi khuẩn có khả khử nitrite mạnh đem định tính với thuốc thử Griss I Griss II xác định dòng vi khuẩn có khả nitrate hóa hoàn toàn nitrite môi trường Vinogradski có nồng độ NO2- 0.5 g/l Kết định danh sơ xác định dòng vi khuẩn nitrate hóa mạnh xếp vào họ Enterobacteriaceae số chi khác như: Corynebacterium spp, Bacillus spp, Micrococcus spp, Staphylococcus spp, Neisseria Veillonella 5.2 Đề nghị Định danh vi khuẩn phương pháp đại dựa đặc điểm di truyền cách giải trình tự đoạn gen 16S rDNA Khảo sát khả cố định đạm dòng vi khuẩn nitrate hóa để đưa vào ứng dụng sản xuất phân sinh học 58 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Quang Khôi 2009 Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stuzeri để xử lý nước thải từ trị chăn nuôi heo huyện Chợ Gạo – Tiền Giang Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Lê Thị Lệ Trinh 2014 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm,sinh tổng hợp IAA, có khả nitrate hóa từ hệ tiêu hóa trùn Quế (Peryonyx excavatus) Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng 1983 Thực tập vi sinh vật, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thuỳ Dương 2003 Công nghệ Sinh học môi trường: xử lý chất thải hữu (tập 1) Nxb Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Ngô Mỹ Ngân 2010 Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa trại chăn nuôi bò sữa Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Tuyên 1996 Giáo trình sinh thái môi trường Đại học SP TP.HCM Phùng Ngọc Bích 2009 Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stuzeri từ ao nuôi cá tra Cần Thơ Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Trần Linh Thước 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật Nxb Giáo dục Trương Quốc An 2012 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chuyển hoá nitơ chất thải ao cá tra trại heo (sau biogas) tỉnh Tiền Giang Trường Đại học Cần Thơ Tiếng anh Cladera, A.M., L.D.C Supulveda – Tores, M Valens – Vadell, J-M Meyer, J Lalucat and E Garcia – Valdes 2006 Adetailed phenotypic and genotypic descriptions of Pseudomonas stutzeri OX1, Systematic and Applied Microbiology, pp 422 – 430 Doddamani H, Ninnekar H 2001 Biodegradation of carbaryl by a Microccus species Curr Microbiol 43 (1), pp 69-73 59 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Edwards G and J Dominguez, 1998 Growth and reproduction of Perionyx excavatus Biology and Fertility of Soils, 8: 303-306 Gruntzig, V., C Nold, Jizhong Zhou, and James M Tiedje 2001 Pseudomonas stuzeri nitrite reductase gên abundance in invironment samples measured by Real – time PCR, Appl Environ Microbiol, pp 760 – 768 Lee H W., S Y Lee, J W Lee, J B Park, E S Choi, and Y K Park 2002 “Molecular characterization of microbiol community in nitrate – removing activated sludge”, FEMS Microb Ecol., 41, pp 85 – 94 Mulder, A., 1989 “ Anoxic ammonia oxidation” International application published under the patent cooperation treaty (PCT) PCT/NL89/00004 Madigan, M., Martinko J et al, 2005 Brock Biology of Microorganisms Prentice Hall ISBN 0-13-144329-1 Purkhold U., Wagner M., Timmermann G., Pommerening – Roser A., Koops HP 2003 “16s rRNA and amoA – based phylogeny of 12 novel beta – proteobacterial ammonia-oxiziding isolates: extention of the dataset and proposal of a new lineage within the nitrosomonads”, Int T Syst Evol Microbiol., 53, pp 1485 – 1494 Rius, N., M.C Fuste, C Guasp, J Lalucat, and J.G Loren 2001 Clonal population structure of Pseudomonas stuzeri, a species with exceptional genetic diversity, J Bacteriol 183 (2), pp 763 – 744 Rossello-Mora, R., J Lacucat, W Dott and P Kampfer 1994 Biochemical and chemotaxonomic characterization of Pseudomonas stuzeri genomovars Journal of applied Bacteriology 76, pp 226 – 233 Ryan, KJ, Ray CG et al., 2004 Sherris Medical Microbiology McGraw Hill ISBN, 08385-8529-9 Spiers, A.J., A Buckling, and P.B Rainey 2000 The cause of Pseudomonas diversity, Microbiol 146, pp 2345 – 2350 Toel, S., Logtestijin, R V., Schreijer, M., Kampf, R., Verhoeven, J.T 2005 “ The functioning of a wetland system used for polishing efluent from a sewage treatment plant”, Ecol Eng., 25 (1), 101-124 60 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Ventura, M., Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzqerald GF, Chater KF, Van Sinderen D 2007 Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum Microbial Mol Biol Rev 71(3), pp 495 - 548 Winogradsky, S 1892 “ Contribution a la morphologie des organismes de la nitrification”, Achives Science and Biology (St, Peterburg) 1, pp 88 – 137 Zumft, W.G 1997 “Cell biology and molecular basis of denitrification”, Microbiol Mol Biol Rev., 61 (4), pp 533-616 Zhuang, W., Tay J, Maszenan A, Krumholz L, Tay S 2003 Importance of Gram positive naphthalene – degrading bacteria in oil – contaminated tropical marine sediments Lett Appl Microbiol 36(4), pp 251-7 Trang web http://giuntrunque.wordpress.com/2013/07/09/phan-trun-que-vermicompost/, 28/05/2014 http://www.happydranch.com/articles/Perionyx_excavatus.htm, 8/06/2014 http://vi.wikipedia.org/wiki/Chu_tr%C3%ACnh_nit%C6%A1,10/05/2014 http://www.denniskunkel.com/DK/Bacteria/21198A.html, 06/06/2014 http://microbiologyglossary.wikispaces.com/pseudomonas+fluorescens, 20/11/2014 http://dept.kent.edu/microbiology/htm/organism.htm, 20/11/2014 61 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Viện NC & PT Công nghệ Sinh [...]... các dòng vi khuẩn chuyển hóa NH4+ phân lập được STT Vi khuẩn Phân lập từ Nguồn gốc 1 NHB1 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 2 NHB2 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 3 NHB3 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 4 NHB4 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 5 NHB5 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò... NHH3 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân heo Cần Thơ 34 NHH4 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân heo Cần Thơ 35 NHH5 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân heo Cần Thơ 36 NHH6 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân heo Cần Thơ 37 NHV1 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân vịt Cần Thơ 38 NHV2 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân vịt Cần Thơ 39 NHV3 Phân. .. Trăng 12 NHB12 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 13 NHB13 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 14 NHB14 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 15 NHB15 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 16 NHB16 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 17 NHB17 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc... Trăng 21 NHB21 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 22 NHB22 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 23 NHB23 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 24 NHB24 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 25 NHB25 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 26 NHB26 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc... Trăng 27 NHB27 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 28 NHB28 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 29 NHB29 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 30 NHB30 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 31 NHH1 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân heo Cần Thơ 32 NHH2 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân heo Cần... Trăng 6 NHB6 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 7 NHB7 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 8 NHB8 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 9 NHB9 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 10 NHB10 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 11 NHB11 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng... Trường ĐHCT CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đặc điểm các dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium phân lập được Phân trùn Quế thu được từ các thí nghiệm nuôi trùn trên ba nguồn cơ chất là phân bò, phân heo và phân vịt, được chọn để tiến hành phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonium Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Vinogradski đặc và ủ ở 30oC trong 72 giờ, thu được 39 dòng vi khuẩn có khả năng sống trên... tiêu hóa thô sơ của ruột trùn, nơi có lượng lớn vi khuẩn trong chất nhầy Tại đây, vi khuẩn sinh sản gấp 10 lần và thực hiện quá trình phân hủy thức ăn Kết quả của quá trình này cung cấp các chất dinh dưỡng cho cả trùn Quế và vi khuẩn Sau quá trình tiêu hóa ở ruột, số lượng lớn các vi khuẩn được phóng thích trở lại vào thùng nuôi trùn Quế cùng với phân trùn Phân trùn Quế được các vi khuẩn chuyển hóa. .. Trăng 18 NHB18 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 24 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Vi n NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường ĐHCT Bảng 4.1: Kí hiệu - nguồn gốc các dòng vi khuẩn chuyển hóa NH4+ phân lập được 19 NHB19 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng 20 NHB20 Phân trùn Quế khi nuôi trùn trên cơ chất phân bò Sóc Trăng... Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức) − Lò vi sóng Panasonic NN-GX 36WF (Thái Lan) 3.1.2 Nguyên liệu Mẫu phân trùn Quế thu từ thí nghiệm nuôi trùn Quế trên môi trường cơ chất là phân heo, bò và vịt 3.1.3 Hoá chất − Môi trường Vinogradski phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonium và nitrate hóa 16 Chuyên ngành Vi sinh vật học học Vi n NC & PT Công nghệ Sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 –