phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải của nhà máy giấy tái chế

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến Phó giáo sư - Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Thạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH METAN TRONG NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY GIẤY TÁI CHẾ

LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 2013

PHẦN KÝ DUYỆT

PGS TS Trần Nhân Dũng Nguyễn Thị Hoàng Ngân CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 ThS Võ Văn Song Toàn DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp ở Trường Đại học Cần Thơ, bên cạnh những thuận lợi còn có nhiều khó khăn, thất bại Không những bản thân cố gắng, tìm tòi nghiên cứu mà còn nhờ vào sự động viên, khích lệ của gia đình, sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè đó là nguồn động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến Phó giáo sư - Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn – người thầy cố vấn chuyên môn của tôi - đã truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và cũng cố tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc, giúp tôi có định hướng nghiên cứu và áp dụng vào thực tiễn cuộc sống, đồng thời đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đặc biệt là Thầy Đỗ Tấn Khang luôn tận tình giúp đỡ và truyền dạy cho tôi kiến thức, giúp tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên, cùng các anh chị học viên cao học, các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này

Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt

Xin trân trọng cảm ơn!

TÓM LƯỢC

Đề tài: “phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải nhà máy

giấy tái chế” được tiến hành dưới mục đích tìm ra và khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn

sinh metan Môi trường nuôi cấy không có thành phần carbon hữu cơ được chuẩn bị kị khí bằng cách sục khí N 2 để đuổi khí O 2 , thời gian sục 40 phút ở tốc độ dây 1kg/cm 3 cho 500ml môi trường là thời gian tối ưu Khí N 2 sau đó được thay thế bằng hỗnhợp khí H 2 và

CO 2 theo tỉ lệ 1:4, hỗn hợp khí này đóng vai trò như cơ chất Mặc dù thí nghiệm không phát hiện được vi khuẩn sinh metan, mà thay vào đó là 5 dòng vi khuẩn có khả năng cố định CO 2 bằng những enzyme tương tự như những enzyme trong loài vi khuẩn sinh methan 5 loài lần lượt là D1, D2, D3, D4 và D5 Trong đó có D1 thuộc loài Shigella với mức độ đồng hình là 97% và D3, D4 thuộc loài Enterobacteria với mức độ đồng hình đều

là 99% Tuy mức độ đồng hình của D3 và D4 với Enterobacteria cùng cao như nhau nhưng do có sự khác biệt về hình thái cũng như khả năng trao đổi chất nên 2 dòng D3 và D4 có thể là hai nhóm nhỏ khác nhau của cùng loài Enterobacteria Nhìn chung, khả năng trao đổi chất của cả 5 dòng thể hiện qua độ giảm thể tích khí đều diễn ra mạnh và nhanh, trong đó mạnh nhất là 2 dòng D1: 7,67% và D4: 8% , kế đến là D3: 6,33% Đường tăng trưởng của cả 5 dòng đều có pha chỉ số ngắn, trong vòng 12 giờ đầu, và đi vào pha chết ở ngày thứ 4 hoặc thứ 5

Từ khóa: áp suất, cố định CO 2 , đồng hình, kị khí, Methan

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT i

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đăt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan: 3

2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí 5

2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế 7

2.4 Các nghiên cứu liên quan 8

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Phương tiện nghiên cứu 9

3.1.1 Thời gian 9

3.1.2 Địa điểm 9

3.1.3 Nguyên liệu 9

3.1.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 9

3.2.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí 12

3.2.2 Khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí 13

3.2.3 Phân lập vi khuẩn 14

3.2.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí 15

3.2.5 Khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn 16

3.2.6 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA 17

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí 19

4.2 Kết quả khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí 21

4.3 Kết quả phân lập 23

4.4 Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa CO2 và H2 25

4.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn 27

4.5.1 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D1 27

4.5.2 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D2 1

4.5.3 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D3 29

4.5.4 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D4 30

4.5.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D5 31

4.6 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn 33

4.6.1 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S RNA của dòng D1 34

4.6.2 Kết quả giải trình tự dòng D3: 37

4.6.3 Kết quả giải trình tự dòng D4: 39

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1

PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU KẾT QUẢ 3

PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THỐNG KÊ VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 6

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần khí biogas 6

Bảng 2 Thành phần môi trường theo Zeikus 10

Bảng 3 Thành phần khoáng 11

Bảng 4 Thành phần vitamin 11

Bảng 5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí 15

Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn 23

Bảng 7 Đặc điểm hình thái của 3 dòng D1, D3, D4 41

Bảng 8 Nồng độ oxy ở các nghiệm thức thời gian

Bảng 9: Khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của các dòng vi khuẩn

Bảng 10 Mật số vi khuẩn D1

Bảng 11 Mật số vi khuẩn D2

Bảng 12 Mật số vi khuẩn D3

Bảng 13 Mật số vi khuẩn D4

Bảng 14 Mật số vi khuẩn D5

Bảng 15: Số liệu thống kê hàm lượng oxy

Bảng 16: Số liệu thống kê hàm lượng khí giảm

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO2 4

Hình 2 Vai trò của F420 4

Hình 3 Quá trình tổng hợp metan 5

Hình 4 Quá trình phân hủy yếm khí được chia thành 3 giai đoạn chính 6

Hình 5: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR 1

Hình 6: Hệ Thống nuôi cấy kỵ khí 20

Hình 7: Hàm lượng oxy ở các nghiệm thức thời gian 21

Hình 8: Hình dáng vi khuẩn và kết quả nhuộm gram xem dưới vật kính dầu x100 24

Hình 9: Phần trăm thể tích khí mất đi của các dòng 25

Hình 10: Đường tăng trưởng của D1 27

Hình 11: Đường tăng trưởng của D2 28

Hình 12: Đường tăng trưởng của D3 29

Hình 13: Đường tăng trưởng của dòng D4 30

Hình 14: Đường tăng trưởng của dòng D5 31

Hình 15: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại vùng gene 16S rRNA trên gel agarose 1,5% của 3 dòng vi khuẩn Sản phẩm điện di xuất hiện ở kích thước khoảng 1500bp 33

Hình 16: Kết quả tra cứu trên Blast của D1 34

Hình 17: Sơ đồ miêu tả đơn giản cơ chế cố định CO2 của enzyme PEPC 35

Hình 18: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dong D1 và Shigella sonnei Ss046 36

Hình 19: Kết quả tra cứu trên Blast của D3 37

Hình 20: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dòng D3 và Enterobacter sp REICA 38

Hình 21: Kết quả tra cứu trên Blast của D4 39

Hình 22: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dòng D4 và Enterobacter sp

REICA 40

Hình 23: Cây phả hệ (phylogenic tree) giữa các dòng D1, D3 và D4 với các loài

đồng hình trên ngân hàng gene so sánh với một số chủng methanogen Error!

Bookmark not defined

Hình 24: Phổ đồ giải trình tự gene 16S của D1

Hình 25: Phổ đồ giải trình tự 16s của D3

Hình 26: Phổ đồ giả trình tự của D4

TỪ VIẾT TẮT

PEPC: Phosphoenolpyruvate carboxylase

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

TNHH: Trách nhiệm hữu hạn

NT: Nghiệm thức

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đăt vấn đề

Công nghiệp giấy là một trong những nền công nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong kinh tế quốc gia Mỗi năm Việt Nam sản xuất 1,13 triệu tấn giấy, trong tổng số đó giấy tái chế chiếm 70% (Vũ Ngọc Bảo, 2010) Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn về kinh tế – xã hội, nghành công nghiệp này cũng phát sinh nhiều vấn đề môi trường bức xúc cần phải giải quyết, đặc biệt là nước thải

Nước thải của các nhà máy giấy có hàm lượng COD khá cao 22000-46500 mg/l, BOD chiếm từ 40-60% COD (Công ty môi trường Ngọc Lân, 2012) Do đó việc xử lý trước khi

xả vào nguồn tiếp nhận là một điều tất yếu Các phương pháp hóa lý đã được ứng dụng để giải quyết vấn đề một cách nhanh chóng Tuy nhiên những phương pháp này để lại các chất tồn đọng gây ô nhiễm môi trường về lâu dài và có chi phí vận hành cao Vì vậy, phương pháp xử lý sinh học được xem như là phương pháp triệt để nhất Mặc dù vậy, phương pháp này còn bị hạn chế do thời gian xử lý chậm Nên việc tăng hiệu suất và rút ngắn thời gian xử lý là một ưu tiên hàng đầu Dựa trên lý do đó đề tài được xây dựng với mục đích tìm kiếm những loài vi khuẩn sinh metan - một trong những loài sinh trưởng chậm, nhưng có hiệu quả kinh tế cao do khả năng sản xuất metan thu hồi- tối ưu về thời gian sinh trưởng và khả năng sinh khí để ứng dụng vào chu trình xử lý nước thải

Methanogen là vi khuẩn cổ sinh metan hoạt động như mắc xích cuối trong chuỗi chuyển hóa cơ chất ở hồ kị khí Loài vi khuẩn này không những phân giải được các acid béo, methanol cùng nhiều chất gây ô nhiễm khác mà còn có khả năng sản sinh ra khí metan, một khí đóng vai trò quan trọng trong thành phần biogas do cung cấp nhiệt lượng cao Ngoài hình thức sinh trưởng dị dưỡng, methanogen còn có hình thức hóa tự dưỡng

CO2 hòa tan trong nước thải - nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý môi trường, ức chế hoặc gây ngộ độc CO2 cho các sinh vật hiếu khí, gây mất cân bằng sinh thái Đồng thời, do có

sự hiện diện của loài vi sinh vật này mà hồ kị khí có khả năng tái tạo khí đốt khá cao góp phần đem lại giá trị kinh tế (metan thu hồi gần bằng 4% tổng lượng khí đốt) (Barker, 1956)

Tuy nhiên ở Việt Nam các nghiên cứu chuyên sâu về loài vi sinh vật này còn nhiều hạn chế dẫn đến những lợi ích mà loài này đem lại vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi Vì vậy đề tài với mục đích tìm ra một số dòng methanogens trong nước thải nhà máy giấy tái chế để quan sát đánh giá về khả năng sinh methan và tốc độ tăng trưởng của từng dòng với hi vọng có thể chọn được những dòng có khả năng sinh methan cao trong thời gian ngắn nhằm hỗ trợ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn sinh metan

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan:

Vi khuẩn sinh metan sống trong môi trường kị khí bắt buộc Kết hợp với các vi sinh vật kị khí khác để phân giải các chất hữu cơ có trong nước thải, đầm bùn và dịch tiêu hóa cũng như các hệ sinh thái khác Vi khuẩn sinh metan được chia thành nhiều nhóm với nhiều hình dạng khác nhau Tuy vậy, tất cả có chung một vài đặc điểm nhất định Các vi khuẩn này đều có khả năng sử dụng hidro như một nguồn năng lượng Nguồn carbon chủ yếu từ forrmate, methanol Một phương thức khác là có thể tổng hợp carbon cho tế bào từ

CO2 Theo tính toán thì hydro và formate là nguồn năng lượng tương đương nhau, hai nguồn năng lượng thấp hơn là methanol và acetate Phân tích trên một mol CH4 tạo thành cho thấy năng lượng do hô hấp hydro nhiều hơn khoảng 4 lần năng lượng do lên men acetate (Zeikus, 1977)

Hình thái: Có 4 kiểu hình thái của vi khuẩn sinh metan: dạng hạt kê, hình que, hình

cầu và dạng xoắn Dạng hình que thường cong và có thể kết hợp thành hình chuỗi hoặc dạng sợi mảnh.Vi khuẩn sinh metan rất đa dạng về cấu trúc và không có những đặc điểm cấu trúc đặc trưng để nhận biết Cấu trúc vách tế bào cũng hoàn toàn khác nhau, hầu hết

là vi khuẩn Gram dương nhưng một số loài có thể là Gram âm hoặc đa dạng Gram Chỉ

mỗi loài Methanobacterium có thành tế bào là Gram dương đặc trưng (Ziekus, 1977)

Phân loại sinh học: việc phân loại chủ yếu dựa vào hình dạng tế bào, nguồn carbon

và đặc điểm sinh lý (Bryant, 1974) Sự khác nhau về hình thái, không giống nhau về tổ chức cấu tạo, nguồn dinh dưỡng đa dạng và giá trị G+C của DNA nằm ở các mức khác nhau cho thấy sự đa dạng về nguồn gốc và phương thức chuyển hóa nguồn năng lượng của các vi khuẩn sinh metan

Phương thức chuyển hóa: đặc điểm chuyển hóa nổi bật của các loài vi khuẩn này

là kết hợp sự oxi hóa hydro và sự khử CO2 Sự khác nhau giữa vi khuẩn sinh metan và các loài sinh vật tự dưỡng sử dụng CO2 làm nguồn carbon cho tế bào là vi khuẩn sinh metan sử dụng CO2 cho cả việc cố định carbon và sự khử metan

Thành phần sinh hóa đặc trưng: hai thành phần sinh hóa được coi là đặc trưng của

vi khuẩn sinh metan là Coenzyme M (CoM) (Tzeng et al, 1975) và F420 (Cheeseman et al, 1972) CoM có phân tử hóa học là HSCH2CH2SO3, cấu trúc phân tử và tổng hợp hóa học của CoM được nghiên cứu bởi Taylor và Wolfe (1974)

Hình 1 Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO2

(*Nguồn: Gunsalus et al, 1978 )

Hợp chất huỳnh quang (Fluorescent compound), F420, hiện diện trong hầu hết các nghiên cứu về loài vi khuẩn này Cấu trúc của F420 hiện tại vẫn chưa được tìm ra.Hợp chất này có đỉnh hấp thụ cao nhất tại bước sóng 420 nm ở trạng thái oxi hóa

Hình 2 Vai trò của F420

(*Nguồn: Tzeng et al, 1975)

Sự tổng hợp metan: Vi khuẩn sinh metan sử dụng hydro- carbon dioxide, formate,

methanol, acetate, cơ chế chính xác cho mỗi cơ chất trên là tùy thuộc vào mỗi loài Mô hình chuyển hóa được miêu tả như sau

Hình 3 Quá trình tổng hợp metan

(*Nguồn: Barker, 1956)

2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí

Đặc điểm nước thải có thể xử lý bằng hồ kỵ khí là hàm lượng chất hữu cơ cao như protein, chất béo, carbohydrate …

Các hệ thống yếm khí ứng dụng khả năng phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật trong điều kiện không có oxy Quá trình phân hủy yếm khí chất hữu cơ rất phức tạp liên

hệ đến hàng trăm phản ứng và sản phẩm trung gian Tuy nhiên người ta thường đơn giản hóa chúng bằng phương trình sau đây:

Chất hữu cơ lên men yếm khí CH4 + CO2 + H2 + NH3 + H2S

2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế

Theo các nghiên cứu của Bộ Công Thương – Vụ Khoa Học Công nghệ (2009) thì các nhóm vi sinh, hầu hết là vi khuẩn, đều tham gia vào việc chuyển hoá các hợp chất hữu

cơ cao phân tử phức hợp thành khí metan Thêm vào đó là sự tương tác đồng bộ giữa các nhóm vi khuẩn liên quan đến quá trình phân hủy yếm khí các chất thải Mặc dù có thể có

sự hiện diện của một số nấm và nguyên sinh động vật, nhưng rõ ràng vi khuẩn luôn vượt trội về số lượng Có bốn nhóm vi khuẩn liên quan đến việc chuyển hóa các chất phức hợp thành những phân tử đơn giản như metan và dioxit carbon Những nhóm vi khuẩn này hoạt động trong một mối quan hệ đồng bộ, nhóm này phải thực hiện việc trao đổi chất của

nó trước khi chuyển phần việc còn lại cho nhóm khác

- Nhóm 1: Vi khuẩn thủy phân:

Các nhóm vi khuẩn yếm khí cắt vỡ các hợp chất hữu cơ phức hợp (cellulose) thành các đơn phân tử dễ hoà tan Các đơn phân tử này sẵn sàng làm thức ăn cho nhóm vi khuẩn kế tiếp Sự thủy phân các phân tử phức hợp được sự xúc tác của enzym cellulases

- Nhóm 2: Vi khuẩn tạo axít gây lên men:

Nhóm vi khuẩn tạo acid (Acidogenic) chuyển đường thành những axít hữu cơ, rượu

và các ketone (như ethanol, methanol, glycerol, acetone), acetate, CO2, và H2 Acetate là sản phẩm chính của quá trình lên men carbon hydrate

- Nhóm 3: Vi khuẩn tạo Aceton:

Vi khuẩn tạo aceton chuyển các acid béo (như: acid propionic và butyric) và rượu thành acetate, hydro, and CO2, những chất này sẽ được sử dụng bởi nhóm vi khuẩn tạo metan Nhóm này đòi hỏi nồng độ hydro thấp để chuyển hoá các axít béo và do đó cần phải theo dõi sát nồng độ hydro Dưới điều kiện nồng độ hydro cục bộ cao, sự tạo thành acetate giảm và chất nền sẽ chuyển thành acid propionic, butyric và ethanol thay vì metan

- Nhóm 4: Vi khuẩn tạo khí metan:

Trong tự nhiên vi khuẩn tạo mêtan khó tính này thường có ở các lớp bùn trầm tích hoặc trong dạ dày của các loài ăn cỏ Nhóm này được tạo thành bởi các vi khuẩn gram âm

và gram dương với các hình dạng khác nhau Các vi sinh tạo mêtan sinh trưởng chậm trong nước thải, chu kỳ sinh có thể từ 2 ngày ở 350C cho đến 50 ngày ở 100C Khoảng 2/3 mêtan được tạo ra từ sự chuyển hoá acetate của nhóm vi khuẩn này 1/3 còn lại là do

sự giảm CO2 tạo ra bởi hydro

2.4 Các nghiên cứu liên quan

Rất nhiều thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sinh metan đã và đang được thực hiện, với nguồn chủ yếu là từ dạ cỏ của động vật nhai lại hoặc trong hệ tiêu hóa của động vật nói chung Hungate và Bryant là những người đi đầu trong lĩnh vực nghiên cứu về loài vi khuẩn này với các nghiên cứu về môi trường và hệ thống nuôi cấy

Hungate (1969) đưa ra phương pháp sửu dụng ống “hungate” – một ống roll tube có nắp cao su và nắp nhựa chuyên biệt để nuôi cấy kỵ khí vi khuẩn sinh methan Bryant thành công trong việc xác lập môi trường nuôi cấy chuyên biệt mà sau này tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu về metahnogens đều dựa vào

Cheeseman (1972), Edward và McBride (1975) đưa ra phương pháp sử dụng kính huỳnh quang để nhận biết vi khuẩn sinh metan, trong đó sự phát hiện ra hợp chất huỳnh quang F420 đã giúp đỡ các nhà khoa học dễ dàng nhận biết loài vi sinh vật cổ này một cách nhanh chóng Sau đó bằng cách đưa ra cấu tạo phân tử và sơ bộ hóa hoạt động của phân tử này Ferry, Smith và Wolfe (1974) đã củng cố thêm các thông tin khoa học xung quanh hợp chất này Các đặc điểm về hình thái, tính chất, sinh lý của dòng vi khuẩn này

đã được Zeikus (1977) nghiên cứu và phát hành

Skillman et al (2006) nhận thấy với những cặp mồi 16S khác nhau sẽ cho kết quả đa dạng sinh học khác nhau của một cộng đồng methanogens, vì thế việc lựa chọn cặp mồi phù hợp nên luôn được quan tâm Cùng nhiều nghiên cứu có liên quan

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 – 12/2013

3.1.2 Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Công

nghệ Enzyme, phòng Sinh học Phân tử thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Làm sạch ống thu bằng alcohol và tiệt trùng bằng dung dịch iodine

Lấy mẫu ở một độ sâu 2m

Sử dụng ống tiêm và kim tiêm Làm đầy ống tiêm với hỗn hợp khí H2 và CO2 Giữ ống đứng thẳng, trút xuống để giữ khí hidro không bị thoát ra

Đẩy hết khí ra ngoài, hút mẫu, cho mẫu vào chai đã đóng nắp và được làm đầy bằng khí H2 và CO2, giữ mẫu tránh ánh sáng

Trữ mẫu ở 4oC

3.1.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Dụng cụ

Chai thủy tinh 50ml, nắp cao su butyl, nhắp nhôm, ống đong, pipet, chai môi trường, bơm kim tiêm 10cc, bơm kim tiêm 100cc, cốc thủy tinh, que cấy, đèn cồn

- Thiết bị

Hệ thống bình khí, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh Hitsuji, tủ lạnh đông Sanyo, máy đo quang phổ Thermo spectronic, máy vortex Ikams3 basic, cân phân tích, cuvette, ống glycerol, ống nghiệm và một số dụng cụ khác

- Hóa chất

Iod, Fushin, Crystal violet, Ethanol 70%, KH2PO4, K2HPO4, NH4Cl, MgCl2.H2O, Nitrilotriacetic acid, FeCl2.4H2O, MnCl2.4H2O, CoCl2.6H2O, ZnCl2, CaCl2, H3BO3,Sodium molybdate, KH2PO4, K2HPO4, NH4Cl, MgCl2.H2O, nitrilotriacetic acid, FeCl2.4H2O, MnCl2.4H2O, CoCl2.6H2O, ZnCl2, CaCl2, H3BO3, Sodium molybdate, nước cất

- Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Bảng 2 Thành phần môi trường theo Zeikus

3.2 phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí

Mục đích: Thiết lập được một hệ thống an toàn và vận hành dễ dàng, có khả năng

tạo môi trường nuôi cấy không có thành phần oxy

Tiến hành:

- Bình khí N2 và CO2 được đặt từ Công ty MITAGAS, Cần Thơ với chỉ tiêu chất lượng là 99,99% Bình khí H2 được đặt từ Công ty Vạn Tấn Phát, Thành phố Hồ Chí Minh với chỉ tiêu chất lượng là 99,99% Sử dụng hệ thống dây dẫn khí nén hai lớp xuất sứ

Mỹ, van khí đồng, đồng hồ áp suất TANAKA Đài Loan và máy hút chân không

- Hệ thống được lắp đặt theo sơ đồ bên dưới và các khớp nối được siết chặc bằng cổ

dê kim loại Các van được gia cố bằng cao su non và kiểm tra rò rỉ khí bằng dung dịch xà phòng Kiểm tra toàn bộ hệ thống khí bằng cách nhúng dây dẫn vào dung dịch xà phòng

và vận hành thử Nếu không có hiện tượng sủi bọt khí trên dây và lượng khí ra đều thì hệ thống khí coi như được thiết lập thành công

- Phần ống khí sử dụng sục môi trường (có màu xanh lá trong hình vẽ) được khử trùng bằng cồn 70 và đặt trong tủ cấy, ở mỗi ống khí ra có gắn màng lọc vi khuẩn

Hình 5: Hệ thống khí dự trù lắp đặt 3.2.2 Khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí

Mục đích: Xác định được thời gian đẩy khí thích hợp để tạo môi trường yếm khí Nguyên tắc: Dùng khí nitơ sục vào môi trường nhằm thay thế vị trí của oxy trong môi

trường đó (đẩy oxy) cho đến khi môi trường không còn oxy trở nên kỵ khí hoàn toàn

ml dung dịch cho vào chai 50ml đang được sục khí với cùng áp suất dây Rút chai

ra nhẹ nhàng, đóng nắp cao su rồi dập nắp nhôm khít lại Thay hỗn hợp khí H2 và

CO2, dùng kim tiêm cân bằng áp suất chai với áp suất khí quyển

- Dùng máy sắc ký khí để phân tích thành phần phần trăm oxy có trong hỗn hợp khí

3.2.3 Phân lập vi khuẩn

- Mục đích thí nghiệm: Phân lập vi khuẩn sinh metan

- Nguyên tắc: Methanogen sống trong môi trường kị khí bắt buộc và có thể sử dụng

H2 như chất cung cấp năng lượng và CO2 là nguồn carbon Sử dụng môi trường chuyện biệt của Ziekus để phân lập vi khuẩn, ủ tại 250C

- Tiến hành:

 Dựa vào thí nghiệm khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường yếm khí

cách thêm 2% agar vào môi trường lỏng) Sục khí nitơ Sau đó dùng pipet rút

20 ml dung dịch từ chai môi trường cho vào chai 50ml đang sục khí, nhẹ nhàng lấy chai ra và nhanh tay đóng nắp lại Thay hỗn hợp khí H2 và CO2, dùng kim tiêm cân bằng áp suất chai với áp suất khí quyển Khử trùng ở 1210C, 20 phút

N2 Dùng kim cấy thực hiện cấy trải trên môi trường thạch nghiêng trong khi chai môi trường vẫn đang được làm đầy bằng khí N2 Thay khí N2 bằng hỗn hợp khí H2 và CO2 tỉ lệ 4:1 Nhanh tay đóng nắp lại Giữ chai đứng thẳng trong khi trữ để nước trên bề mặt có thể chảy xuống đáy chai Lặp lại các bước cho đến khi các khuẩn lạc hoàn toàn giống nhau Lúc đó ta có được mẫu vi khuẩn ròng Trữ mẫu vào glycerol và giữ ở -200C

Chỉ tiêu đánh giá

Quan sát khuẩn lạc: hình dáng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc

Quan sát vi khuẩn: hình dạng vi khuẩn dưới vật kính dầu x100, gram

3.2.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí

Mục đích: Khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của các dòng vi khuẩn

Nguyên tắc: Trong quá trình tổng hợp chất hữu cơ, methanogens sử dụng bốn phân

tử hidro và một phân tử CO2 để tạo nên một phân tử CH4, đồng thời vi khuẩn này còn sử dụng CO2 như nguồn cơ chất carbon dẫn đến sự giảm áp suất trong môi trường nuôi (Wolfe, 2011)

4H2 + CO2  CH4 + 2H2O

Vật liệu thí ngiệm: Mẫu vi khuẩn của 4 đến 5 dòng vi khuẩn phân lập được

Bố trí thí ngiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại Nghiệm thức đối chứng không

chủng vi khuẩn

Bảng 5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2

và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí

Dòng vi khuẩn

Thời gian

Đối chứng (không chủng vi khuẩn)

Chủng 1% (v/v) dịch vi khuẩn của từng dòng riêng lẽ (107 tế bào/ml) vào chai 50ml môi trường lỏng đã có sẵn hỗn hợp khí H2 và CO2 tỉ lệ 4:1 Đậy nắp chai bằng nút cao su

và siết kín bằng nắp nhôm Tiến hành ủ 25oC

Xác định độ thể tích khí mất đi của từng dòng vi khuẩn tại các thời điểm ngày 1, ngày

4 và ngày 7 sau khi ủ bằng kim khí đã được làm đầy bằng khí N2 Độ giảm khí trong kim thể hiện lượng khí mất đi trong chai nuôi

3.2.5 Khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn

Mục đích : khảo sát thời gian tăng trưởng của từng dòng vi khuẩn

Vật liệu thí ngiệm: Mẫu vi khuẩn: 4 đến 5 dòng vi khuẩn

Bố trí thí ngiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên 8 nghiệm thức (8 mốc thời gian: 12giờ,

3.2.6 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA

Mục đích: định danh ba dòng vi khuẩn để hiểu thêm về các đặc tính sinh hóa đặc biêt

ở tùng dòng, khảo sát mối quan hệ di truyền giữa các dòng với nhau

Nguyên tắc: chọn ra ba dòng có khả năng chuyển hóa mạnh nhất ở thí nghiệm khảo

sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2, tiến hành nhận diện bằng kỹ thuật PCR và giải trình

tự đoạn gen 16S rRNA

Bỏ dịch lỏng, thêm 400 μl Bi-nước để hòa tan sinh khối

Làm lạnh ở -20oC trong 2 phút, sau đó đun nóng trên waterbath ở 80oC trong 10 phút Cho thêm 100μl Chelex resin 10% và vortex để hòa tan sinh khối

Tiếp tục làm lạnh và đun nóng lần nữa

Ly tâm 10.000 rpm trong 2 phút, rút dịch bên trên cho vào tuýp mới

Trữ ở -20oC để thực hiện bước tiếp theo

b) Phản ứng PCR

Đoạn mồi: (Lane et al, 1991)

Mồi ngược 1492R 5’ ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3’

- Thành phần phản ứng PCR: Bi nước, PCR buffer, MgCl2, dNTPs, mồi xuôi, mồi ngược, DNA vi khuẩn và Taq DNA polymerase

Chù kỳ gia nhiệt

Hình 5: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR c) Giải trình tự gene

Mẫu DNA sau khi kiểm tra kết quả được gửi đến công ty MACROGEN (Hàn Quốc)

để định danh bằng đoạn mổi 27F: 5’- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’ (Lane et al, 1991)

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí

Hệ thống nuôi cấy kỵ khí gồm ba bình khí nén H2, CO2 và N2 được lắp đặt đúng như thiết bị dự kiến

Hệ thống vận hành an toàn thông qua các đồng hồ áp suất Mỗi bộ đồng hồ gồm hai đồng hồ chính, đồng hồ thứ nhất (ĐH1) thể hiện áp suất bình, đồng hồ thứ hai (ĐH2) thể hiện áp suất dây Tùy theo nhu cầu sử dụng mà điều chỉnh áp suất dây thông qua núm vặn phía trước đồng hồ, xoay theo chiều kim đồng hồ sẽ làm tăng áp suất dây và xoay ngược lại để giảm áp suất dây

Các hệ thống van khí làm việc chặc chẽ và không bị rò rỉ khí

Quy luật vận hành của hệ thống được thiết lập như sau:

(1) Vặn mở bình khí, xem xét ĐH1 đề phòng trường hợp khí hết, điều chỉnh ĐH2 phù hợp (thường sử dụng ở 1kg/cm3), khử trùng tay trước khi ngồi vào tủ cấy

(2) Trong khi sử dụng, ta mở van khí tổng đầu tiên sau đó mở van khí cần sử dụng (ví dụ như mở van khí N2 để sử dụng cho sục khí đẩy oxy) Khí được dẫn từ bình vào dây dẫn, đi qua màng lọc và thổi vào chai môi trường Trong trường hợp cần thay đổi khí, ta khóa van khí đang sử dụng và van tổng, bật van chân không và ấn nút khởi động máy hút chân không, sau khi hút chân không ta tắt máy, đóng van chân không và mở van khí cần thay thế cùng với van tổng Lưu ý, khi thực hiện hút chân không, phải chắc chắn tất cả các van khí vào đã được đóng, chỉ mở các van khí ra

(3) Sau khi sử dụng, khóa bình khí Vặn ĐH2 theo hướng “Low”, cho đến khi đồng

hồ chỉ về 0 Sau đó khóa các van khí, xem lại nút nguồn của máy chân không đã ở vị trí

“off” chưa, rút điện máy chân không

4.2 Kết quả khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường kỵ khí

Hình 7: Hàm lượng oxy ở các nghiệm thức thời gian

*Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95% Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại

%cv=3,47%

Phần trăm oxy có kết quả cao nhất ở nghiệm thức đối chứng không dùng phương pháp sục đuổi khí, hàm lượng oxy thể hiện trong mẫu đối chứng ở khoảng 20% bằng với hàm lượng oxy trong không khí Ở nghiệm thức 20 phút hàm lượng oxy chiếm 15% và có xu hướng giảm rõ rệt ở nghiệm thức 30 phút với 1,67% Ở nghiệm thức 40 phút thành phần oxy gần bằng 0% trong cả ba lần lặp lại Điều này thể hiện thời gian sục khí càng lâu thì hàm lượng oxy càng giảm do có sự thay thế các phân tử khí N2 vào vị trí của các phân tử khí oxy Vì ở thời gian 40 phút nồng độ oxy đã về 0% nên dù có thực hiện kéo dài thời gian hơn cũng ko mang lại ý nghĩa thêm mà chỉ làm tiêu tốn khí Ngoài ra cần lưu ý khí

N2 được chuyển trực tiếp từ bình nén khí, nên luồng khí N2 có nhiệt độ thấp, nếu sục trong một thời gian quá lâu có thể gây kết tủa ở một số thành phần môi trường Đồng thời cùng với sự khác biệt cao về mặt ý nghĩa thống kê, việc sục khí N2 40 phút trong điều kiện thí nghiệm là tối ưu cho quá trình chuẩn bị môi trường kỵ khí

Việc thay thế phân tử O2 trong dung dịch bằng N2 là một trong những điều quyết định

về sự thành công cho tất cả các thí nghiệm sau Môi trường còn tồn tại oxy có thể dẫn đến

sự phát triển của các loài hiếu khí, những loài này có tốc độ phát triển nhanh hơn so với vi khuẩn kị khí (Bryant, 1968) nên có khả năng phát triển ưu thế và ức chế các loài kị khí về thành phần dinh dưỡng môi trường Đồng thời, vi khuẩn sinh metan là một loài vi sinh vật

kị khí bắt buộc, nồng độ oxy dù rất thấp cũng có thể gây ngộ độc đối với tế bào (Smith và Hungate, 1958)

Hình 8: Hàm lượng oxy ở nghiệm thức 40 phút

Sử dụng nghiệm thức sục khí ở 40 phút để chuẩn bị môi trường cho các thí nghiệm sau

4.3 Kết quả phân lập

Phân lập được năm dòng vi khuẩn: D1, D2, D3, D4 và D5

Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn

trắng vàng đục Trắng đục trắng đục

Hình dáng vi

khuẩn

que ngắn que ngắn que ngắn que ngắn que ngắn

Thời gian xuất hiện

So sánh hình dạng giữa các dòng phân lập được, ta thấy D1, D2 và D3 có những tính chất tương tự nhau về dạng bìa (đều là bìa nguyên), có cùng màu trắng vàng hơi đục, thời gian xuất hiện khuẩn lạc ngắn trong khoảng hai ngày, bề mặt khuẩn lạc có độ bóng nhờn Mặc dù vậy, độ nổi của D1 và D3 thuộc loại lồi, nhưng D2 thì khuẩn lạc có độ phẳng Đồng thời hình dáng của D3 thuộc dạng bất định, không giống hai dòng còn lại Đối với D4, điểm đặc biệt là hình dáng bìa chia thùy, khác hoàn toàn so với các loài còn lại và có thời gian xuất hiện khuẩn lạc lâu D5 tương tự D4 có đặc điểm khuẩn lạc đều có màu trắng đục và không có độ nhớt Hình dáng vi khuẩn của cả năm dòng đều giống nhau là hình que và có gram âm Tuy nhiên nếu dựa vào mức độ giống nhau về hình dạng khuẩn lạc và vi khuẩn ta chưa thể kết luận được gì về mối quan hệ di truyền Mặc dù vậy, đây là

cơ sở cho qua trình nhận biết sau khi giải trình tự các dòng vi khuẩn phân lập được này

Hình 8: Hình dáng vi khuẩn và kết quả nhuộm gram xem dưới vật kính dầu x100

4.4 Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa CO2 và H2

Hình 9: Phần trăm thể tích khí mất đi của các dòng

Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95% Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại Cv(%)= 4,27%

Biểu đồ thể hiện sự khác biệt thống kê của D1 và D4 so với các dòng còn lại ở mức khác biệt 5% Giữa D1 và D4 không có sự khác biệt thống kê D3 khác biệt thống kê với hàm lượng khí giảm cao hơn D2 và D5 Xét về nhân tố thời gian, không có sự khác biệt thống kê 5% giữa các ngày trong cùng một dòng

Do vi khuẩn sinh metan sử dung bốn phân tử hydro và một phân tử carbon dioxide để tạo thành một phân tử metan và hai phân tử nước nên sau quá trình chuyển hóa áp suất khí sẽ giảm (Edward et al, 1975) Đồng thời do môi trường sử dụng không có nguồn carbon khác ngoài carbon dioxide, nên sự giảm áp suất cũng thể hiện khả hoạt động sinh trưởng của vi khuẩn

Trong ngày đầu tiên, dòng 1 và 4 với lần lượt hấp thu ở 8,22% và 8,11% thể tích khí điều này chứng tỏ hai dòng trên có khả năng chuyển hóa mạnh hơn các dòng còn lại Dòng 3 làm giảm 1,9 ml trên tổng 30 ml khí có khác biệt thống kê ở mức 5% về khả năng chuyển hóa cao hơn so với dòng 2 và 5 (đều giảm ở khoảng 5%) nhưng thấp hơn so với D1 và D4

Các dòng đều biểu hiện sự giảm áp ở ngay ngày đầu tiên, điều này có nghĩa quá trình trao đổi chất đã diễn ra trong 24 giờ đầu, biểu hiện khả năng thích nghi nhanh ở các loài

vi khuẩn này Mặc dù loài vi khuẩn sinh metan được biết đến như một loài sinh trưởng chậm, bắt đầu có thể sinh khí metan từ ngày thứ 2 (Edward, 1975), nhưng do thời gian bắt đầu pha tăng trưởng có thể từ 5 đến 20 giờ sau khi ủ (Buswell and Hatfield, 1938) nên quá trình trao đổi chất vẫn có thể diễn ra trong thời gian này

Nhìn chung không có sự chênh lệch thống kê giữa các nghiệm thức thời gian với nhau

ở cả năm dòng Áp suất ở ngày 4 và ngày 7 hầu như không chênh lệch so với ngày 1, điều này đồng nghĩa với sự không tiêu thụ thêm hoặc tiêu thụ rất ít hỗn hợp khí sau ngày đầu tiên Trong khi đó, ở điều kiện môi trường đang sử dụng vi khuẩn sinh metan bắt buộc sử dụng CO2 như nguồn carbon và H2 là nguồn cho electron (Ziekus, 1977) Mặt khác, trong

24 giờ vi khuẩn rất khó có thể tiêu thụ hết chất dinh dưỡng và hoàn thành tất cả các pha tăng trưởng, bao gồm cả pha chết Hiện tương này có thể được giải thích bằng các chuyển biến về áp suất trong môi trường nuôi ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào

Giảm thể tích dẫn đến áp suất khí trong bình thấp hơn so với điều kiện môi trường sống tự nhiên của các dòng vi khuẩn, gây khó khăn trong quá trình sinh trưởng Đồng thời

sự thay đổi về áp suất môi trường dẫn đến sự dịch chuyển cần bằng hệ thống sinh lý và sinh hóa (định luật Le Chatelier) Ngoài ra còn thay đổi cấu trúc bậc ba và bậc bốn của protein, vì áp suất làm ảnh hưởng đến tương tác kỵ nước và lực tĩnh điện giữa các subunit trong cấu trúc protein (Silva et al, 1996) Sự thay đổi áp suất tác động đến trao đổi chất của tế bào và sự tiết các enzyme ngoại bào (Urban, 1994) cũng như ảnh hưởng không nhỏ đến tính chất màng sinh học – một trong những cấu trúc rất nhạy cảm với áp suất (MacDonald, 1997) Các phản ứng sinh học có thể bị ức chế do sự giảm áp suất

(Somero, 1992) Những bằng chứng trên dễ dàng giải thích tại sao sự trao đổi chất ở các dòng vi khuẩn diễn ra tích cực ở ngày đầu, nhưng lại gần như không xảy ra ở các ngày sau Do sau khi sử dụng nguồn cơ chất là CO2 và H2 để thực hiện các hoạt động trao đổi chất ở ngày 1, lượng khí mất đi gây nên hiện tượng giảm áp suất và ức chế sự phát triển của vi sinh vật ở các ngày tiếp theo

Vì số liệu hầu như giống nhau ở các nghiệm thức thời gian và dựa vào phân tích way ANOVA chọn ra dòng D1,D4 và D3 để tiến hành giải trình tự 16S rRNA

One-4.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn

4.5.1 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D1:

Hình 10: Đường tăng trưởng của D1

Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95% Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại

Khảo sát đường tăng trưởng của vi khuẩn ở D1 cho thấy mật số vi khuẩn tăng nhanh trong 12 giờ đầu và đạt mức tăng trưởng cao nhất ở giờ thứ 12 với mật số là 4,7x108

CFU/ml Trong thời gian này vi khuẩn đang trong log phase hay còn gọi là pha chỉ số, ở

c

b