Hệ thống nuôi cấy kỵ khí gồm ba bình khí nén H2, CO2 và N2 được lắp đặt đúng như thiết bị dự kiến.
Hệ thống vận hành an toàn thông qua các đồng hồ áp suất. Mỗi bộ đồng hồ gồm hai đồng hồ chính, đồng hồ thứ nhất (ĐH1) thể hiện áp suất bình, đồng hồ thứ hai (ĐH2) thể hiện áp suất dây. Tùy theo nhu cầu sử dụng mà điều chỉnh áp suất dây thông qua núm vặn phía trước đồng hồ, xoay theo chiều kim đồng hồ sẽ làm tăng áp suất dây và xoay ngược lại để giảm áp suất dây.
Các hệ thống van khí làm việc chặc chẽ và không bị rò rỉ khí.
Quy luật vận hành của hệ thống được thiết lập như sau:
(1) Vặn mở bình khí, xem xét ĐH1 đề phòng trường hợp khí hết, điều chỉnh ĐH2 phù hợp (thường sử dụng ở 1kg/cm3), khử trùng tay trước khi ngồi vào tủ cấy.
(2) Trong khi sử dụng, ta mở van khí tổng đầu tiên sau đó mở van khí cần sử dụng (ví dụ như mở van khí N2 để sử dụng cho sục khí đẩy oxy). Khí được dẫn từ bình vào dây dẫn, đi qua màng lọc và thổi vào chai môi trường. Trong trường hợp cần thay đổi khí, ta khóa van khí đang sử dụng và van tổng, bật van chân không và ấn nút khởi động máy hút chân không, sau khi hút chân không ta tắt máy, đóng van chân không và mở van khí cần thay thế cùng với van tổng. Lưu ý, khi thực hiện hút chân không, phải chắc chắn tất cả các van khí vào đã được đóng, chỉ mở các van khí ra.
(3) Sau khi sử dụng, khóa bình khí. Vặn ĐH2 theo hướng “Low”, cho đến khi đồng hồ chỉ về 0. Sau đó khóa các van khí, xem lại nút nguồn của máy chân không đã ở vị trí “off” chưa, rút điện máy chân không.
Hình 6: Hệ Thống nuôi cấy kỵ khí.
Ghi chú: hình a: bình khí, b: van khí, c: đồng hồ khí, d: nơi khí ra sử dụng, e: tổng quan hệ thống. a b d c e
Hình 7: Hàm lượng oxy ở các nghiệm thức thời gian.
*Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. %cv=3,47%.
Phần trăm oxy có kết quả cao nhất ở nghiệm thức đối chứng không dùng phương pháp sục đuổi khí, hàm lượng oxy thể hiện trong mẫu đối chứng ở khoảng 20% bằng với hàm lượng oxy trong không khí. Ở nghiệm thức 20 phút hàm lượng oxy chiếm 15% và có xu hướng giảm rõ rệt ở nghiệm thức 30 phút với 1,67%. Ở nghiệm thức 40 phút thành phần oxy gần bằng 0% trong cả ba lần lặp lại. Điều này thể hiện thời gian sục khí càng lâu thì hàm lượng oxy càng giảm do có sự thay thế các phân tử khí N2 vào vị trí của các phân tử khí oxy. Vì ở thời gian 40 phút nồng độ oxy đã về 0% nên dù có thực hiện kéo dài thời gian hơn cũng ko mang lại ý nghĩa thêm mà chỉ làm tiêu tốn khí. Ngoài ra cần lưu ý khí N2 được chuyển trực tiếp từ bình nén khí, nên luồng khí N2 có nhiệt độ thấp, nếu sục trong một thời gian quá lâu có thể gây kết tủa ở một số thành phần môi trường. Đồng thời cùng với sự khác biệt cao về mặt ý nghĩa thống kê, việc sục khí N2 40 phút trong điều kiện thí nghiệm là tối ưu cho quá trình chuẩn bị môi trường kỵ khí.
Việc thay thế phân tử O2 trong dung dịch bằng N2 là một trong những điều quyết định về sự thành công cho tất cả các thí nghiệm sau. Môi trường còn tồn tại oxy có thể dẫn đến sự phát triển của các loài hiếu khí, những loài này có tốc độ phát triển nhanh hơn so với vi khuẩn kị khí (Bryant, 1968) nên có khả năng phát triển ưu thế và ức chế các loài kị khí về thành phần dinh dưỡng môi trường. Đồng thời, vi khuẩn sinh metan là một loài vi sinh vật kị khí bắt buộc, nồng độ oxy dù rất thấp cũng có thể gây ngộ độc đối với tế bào (Smith và Hungate, 1958).
Hình 8: Hàm lượng oxy ở nghiệm thức 40 phút
Sử dụng nghiệm thức sục khí ở 40 phút để chuẩn bị môi trường cho các thí nghiệm sau.
Phân lập được năm dòng vi khuẩn: D1, D2, D3, D4 và D5
Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn
Dòng D1 D2 D3 D4 D5
Bìa nguyên Nguyên nguyên chia thùy nguyên
Hình dáng Tròn Tròn bất định Tròn bất định
Độ nổi lồi phẳng lồi Lồi mấu lồi
Đường kính 1,5mm 1mm 2 mm 1,5 mm 2 mm Màu sắc trắng vàng đục trắng vàng đục trắng vàng đục Trắng đục trắng đục
Gram Âm Âm Âm âm âm
Hình dáng vi khuẩn
que ngắn que ngắn que ngắn que ngắn que ngắn
Thời gian xuất hiện
khuẩn lạc 2 ngày 2 ngày 2 ngày 4 ngày 2 ngày
Độ nhớt Có Có Có không Không
So sánh hình dạng giữa các dòng phân lập được, ta thấy D1, D2 và D3 có những tính chất tương tự nhau về dạng bìa (đều là bìa nguyên), có cùng màu trắng vàng hơi đục, thời gian xuất hiện khuẩn lạc ngắn trong khoảng hai ngày, bề mặt khuẩn lạc có độ bóng nhờn. Mặc dù vậy, độ nổi của D1 và D3 thuộc loại lồi, nhưng D2 thì khuẩn lạc có độ phẳng. Đồng thời hình dáng của D3 thuộc dạng bất định, không giống hai dòng còn lại. Đối với D4, điểm đặc biệt là hình dáng bìa chia thùy, khác hoàn toàn so với các loài còn lại và có thời gian xuất hiện khuẩn lạc lâu. D5 tương tự D4 có đặc điểm khuẩn lạc đều có màu trắng đục và không có độ nhớt. Hình dáng vi khuẩn của cả năm dòng đều giống nhau là hình que và có gram âm. Tuy nhiên nếu dựa vào mức độ giống nhau về hình dạng khuẩn lạc và vi khuẩn ta chưa thể kết luận được gì về mối quan hệ di truyền. Mặc dù vậy, đây là cơ sở cho qua trình nhận biết sau khi giải trình tự các dòng vi khuẩn phân lập được này.
Hình 8: Hình dáng vi khuẩn và kết quả nhuộm gram xem dưới vật kính dầu x100.
Hình 9: Phần trăm thể tích khí mất đi của các dòng
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. Cv(%)= 4,27%.
Biểu đồ thể hiện sự khác biệt thống kê của D1 và D4 so với các dòng còn lại ở mức khác biệt 5%. Giữa D1 và D4 không có sự khác biệt thống kê. D3 khác biệt thống kê với hàm lượng khí giảm cao hơn D2 và D5. Xét về nhân tố thời gian, không có sự khác biệt thống kê 5% giữa các ngày trong cùng một dòng .
Do vi khuẩn sinh metan sử dung bốn phân tử hydro và một phân tử carbon dioxide để tạo thành một phân tử metan và hai phân tử nước nên sau quá trình chuyển hóa áp suất khí sẽ giảm (Edward et al, 1975). Đồng thời do môi trường sử dụng không có nguồn carbon khác ngoài carbon dioxide, nên sự giảm áp suất cũng thể hiện khả hoạt động sinh trưởng của vi khuẩn.
Trong ngày đầu tiên, dòng 1 và 4 với lần lượt hấp thu ở 8,22% và 8,11% thể tích khí điều này chứng tỏ hai dòng trên có khả năng chuyển hóa mạnh hơn các dòng còn lại. Dòng 3 làm giảm 1,9 ml trên tổng 30 ml khí có khác biệt thống kê ở mức 5% về khả năng chuyển hóa cao hơn so với dòng 2 và 5 (đều giảm ở khoảng 5%) nhưng thấp hơn so với D1 và D4.
Các dòng đều biểu hiện sự giảm áp ở ngay ngày đầu tiên, điều này có nghĩa quá trình trao đổi chất đã diễn ra trong 24 giờ đầu, biểu hiện khả năng thích nghi nhanh ở các loài vi khuẩn này. Mặc dù loài vi khuẩn sinh metan được biết đến như một loài sinh trưởng chậm, bắt đầu có thể sinh khí metan từ ngày thứ 2 (Edward, 1975), nhưng do thời gian bắt đầu pha tăng trưởng có thể từ 5 đến 20 giờ sau khi ủ (Buswell and Hatfield, 1938) nên quá trình trao đổi chất vẫn có thể diễn ra trong thời gian này.
Nhìn chung không có sự chênh lệch thống kê giữa các nghiệm thức thời gian với nhau ở cả năm dòng. Áp suất ở ngày 4 và ngày 7 hầu như không chênh lệch so với ngày 1, điều này đồng nghĩa với sự không tiêu thụ thêm hoặc tiêu thụ rất ít hỗn hợp khí sau ngày đầu tiên. Trong khi đó, ở điều kiện môi trường đang sử dụng vi khuẩn sinh metan bắt buộc sử dụng CO2 như nguồn carbon và H2 là nguồn cho electron (Ziekus, 1977). Mặt khác, trong 24 giờ vi khuẩn rất khó có thể tiêu thụ hết chất dinh dưỡng và hoàn thành tất cả các pha tăng trưởng, bao gồm cả pha chết. Hiện tương này có thể được giải thích bằng các chuyển biến về áp suất trong môi trường nuôi ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào.
Giảm thể tích dẫn đến áp suất khí trong bình thấp hơn so với điều kiện môi trường sống tự nhiên của các dòng vi khuẩn, gây khó khăn trong quá trình sinh trưởng. Đồng thời sự thay đổi về áp suất môi trường dẫn đến sự dịch chuyển cần bằng hệ thống sinh lý và sinh hóa (định luật Le Chatelier). Ngoài ra còn thay đổi cấu trúc bậc ba và bậc bốn của protein, vì áp suất làm ảnh hưởng đến tương tác kỵ nước và lực tĩnh điện giữa các subunit trong cấu trúc protein (Silva et al, 1996). Sự thay đổi áp suất tác động đến trao đổi chất của tế bào và sự tiết các enzyme ngoại bào (Urban, 1994) cũng như ảnh hưởng không nhỏ đến tính chất màng sinh học – một trong những cấu trúc rất nhạy cảm với áp suất (MacDonald, 1997). Các phản ứng sinh học có thể bị ức chế do sự giảm áp suất
dòng vi khuẩn diễn ra tích cực ở ngày đầu, nhưng lại gần như không xảy ra ở các ngày sau. Do sau khi sử dụng nguồn cơ chất là CO2 và H2 để thực hiện các hoạt động trao đổi chất ở ngày 1, lượng khí mất đi gây nên hiện tượng giảm áp suất và ức chế sự phát triển của vi sinh vật ở các ngày tiếp theo.
Vì số liệu hầu như giống nhau ở các nghiệm thức thời gian và dựa vào phân tích One- way ANOVA chọn ra dòng D1,D4 và D3 để tiến hành giải trình tự 16S rRNA.
4.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn 4.5.1 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D1: 4.5.1 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D1:
Hình 10: Đường tăng trưởng của D1
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại.
Khảo sát đường tăng trưởng của vi khuẩn ở D1 cho thấy mật số vi khuẩn tăng nhanh trong 12 giờ đầu và đạt mức tăng trưởng cao nhất ở giờ thứ 12 với mật số là 4,7x108
CFU/ml. Trong thời gian này vi khuẩn đang trong log phase hay còn gọi là pha chỉ số, ở
c b
mốc thời gian này vi khuẩn phát triển và tổng hợp cơ chất mạnh nhất. Sau 12 giờ mật số giữ yên đến cho đến ngày thứ 5. Đây là giai đoạn cân bằng của hệ thống nuôi kín, mật số vi khuẩn ổn định, số tế bào chết đi bằng số tế bào sinh ra. Bắt đầu từ ngày thứ 5, 6 và
ngày thứ 7 mật số giảm nhanh đều từ 4,7x108 CFU/ml xuống còn 7x106 CFU/ml.
4.5.2 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D2
Hình 11: Đường tăng trưởng của D2
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại.
Kết quả khảo sát đường tăng trưởng D2 cho thấy sự tăng mạnh ở 12 giờ đầu tiên, sau đó ổn định từ khoảng 12 giờ đến ngày thứ 3 và dần dần giảm ở ngày thứ 4 đến thứ 7. Cũng tương tự như D1, các vi khuẩn D2 tăng trưởng nhanh và đạt mốc tăng trưởng tối ưu sau 12 giờ. Sau đó mật số vi khuẩn giữ ở mức 5x108 CFU/ml từ lúc đạt tối ưu cho đến ngày thứ 3, thời gian này diễn ra pha cân bằng. Vậy trong 12 giờ đầu vi khuẩn phát triển nhanh, sinh tổng hợp nhiều chất dinh dưỡng, đến ngày thứ nhất vi khuẩn đi vào pha ổn định và giữ được mật số cao nhất trong vòng 3 ngày do số lượng tế bào sống và tế bào
chết ngang nhau. Mật số vi khuẩn bắt đầu giảm từ 5x108 CFU/ml ở ngày thứ 3 còn 4x107
a a a b c
d
e a
Hình 12: Đường tăng trưởng của D3
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại.
Khảo sát đường tăng trưởng của vi khuẩn ở D3 cho thấy mật số vi khuẩn tăng nhanh trong 12 giờ đầu và đạt mức tăng trưởng cao nhất ở 12 giờ sau khi ủ, với mật số là 5x107 CFU/ml. Trong thời gian này vi khuẩn đang trong log phase hay còn gọi là pha chỉ số, ở mốc thời gian này vi khuẩn phát triển và tổng hợp cơ chất mạnh nhất. Sau 12 giờ mật số giữ yên đến cho đến ngày thứ 4. Đây là giai đoạn cân bằng của hệ thống nuôi kín, mật số vi khuẩn ổn định, số tế bào chết đi bằng số tế bào sinh ra. Ngày thứ 5, 6 và ngày thứ 7 mật
số giảm nhanh đều từ 5x107 CFU/ml xuống còn 4x106 CFU/ml. Điều này xảy ra khi chất
dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, độc tố môi trường được tạo thành do hoạt động trao đổi chất trong môi trường kín hoặc do sự hạn hẹp của “không gian sinh học”, ở đó tế bào không còn đủ không gian để phát triển dẫn đến số tế bào chết đi cao hơn số tế bào sinh ra. Giai đoạn này vi khuẩn đi vào pha chết (death phase) (Monod, 1949). Bên cạnh đó, do thí nghiệm được tiến hành nuôi trong môi trường kín, nên nhân tố áp suất cũng là
một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn với những tác động đã được trình bài cụ thể ở thí nghiệm trên.
4.5.4 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D4
Hình 13: Đường tăng trưởng của dòng D4
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại.
Kết quả khảo sát đường tăng trưởng D4 cho thấy sự tăng mạnh mật số ở 12giờ đầu tiên, sau đó tiếp tục tăng nhẹ trong 12 giờ tiếp theo. Mặc dù có biến động nhẹ, nhưng nhìn chung mật số ổn định trong 3 ngày sau đó và đạt giá trị cao nhất là 10,7x108 CFU/ml tại ngày 1, 3. Dần dần giảm ở ngày thứ 4, 5, 6 và 7. Cũng tương tự như ba dòng trên, D4 tăng trưởng nhanh, nhưng đạt mốc tăng trưởng tối ưu trể hơn 12 giờ. Điều này có thể giải thích là trong 12h đầu vi khuẩn phát triển nhanh, sinh tổng hợp nhiều chất dinh dưỡng. Đến ngày thứ nhất vi khuẩn đi vào pha ổn định và giữ được mật số cao nhất do số lượng tế bào
sống và tế bào chết ngang nhau. Mật số vi khuẩn bắt đầu giảm từ 10,7x108 CFU/ml còn
4,3x106 CFU/ml bắt đầu từ ngày 4 và giảm đều ở ba ngày tiếp theo do vi khuẩn đi vào pha chết.
được lấy ra từ ngày thứ nhất. Vì ngày thứ nhất và ngày thứ 3 đều có mật số cao nhất, tuy nhiên việc nuôi cấy càng lâu càng mất nhiều thời gian, tiêu tốn nhiều công sức.
4.5.5 Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của D5
Hình 14: Đường tăng trưởng của dòng D5
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý