- Mục đích thí nghiệm: Phân lập vi khuẩn sinh metan.
- Nguyên tắc: Methanogen sống trong môi trường kị khí bắt buộc và có thể sử dụng H2 như chất cung cấp năng lượng và CO2 là nguồn carbon. Sử dụng môi trường chuyện biệt của Ziekus để phân lập vi khuẩn, ủ tại 250C.
- Tiến hành:
Dựa vào thí nghiệm khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường
yếm khí.
Chuẩn bị môi trường trong chai nắp xanh 500ml (chuẩn bị môi trường đặc bằng
cách thêm 2% agar vào môi trường lỏng). Sục khí nitơ. Sau đó dùng pipet rút 20 ml dung dịch từ chai môi trường cho vào chai 50ml đang sục khí, nhẹ nhàng lấy chai ra và nhanh tay đóng nắp lại. Thay hỗn hợp khí H2 và CO2, dùng kim tiêm cân bằng áp suất chai với áp suất khí quyển. Khử trùng ở 1210C, 20 phút.
Khi môi trường đặc còn ấm, để chai môi trường nằm nghiêng 450.
Khi cấy, dùng kéo mở từ từ nắp nhôm, hạ miệng chai vào kim khí đang thổi khí
N2. Dùng kim cấy thực hiện cấy trải trên môi trường thạch nghiêng trong khi chai môi trường vẫn đang được làm đầy bằng khí N2. Thay khí N2 bằng hỗn hợp khí H2 và CO2 tỉ lệ 4:1. Nhanh tay đóng nắp lại. Giữ chai đứng thẳng trong khi trữ để nước trên bề mặt có thể chảy xuống đáy chai. Lặp lại các bước cho đến khi các khuẩn lạc hoàn toàn giống nhau. Lúc đó ta có được mẫu vi khuẩn ròng. Trữ mẫu vào glycerol và giữ ở -200C.
Chỉ tiêu đánh giá
Quan sát khuẩn lạc: hình dáng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc.
qua độ giảm áp suất khí
Mục đích: Khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của các dòng vi khuẩn.
Nguyên tắc: Trong quá trình tổng hợp chất hữu cơ, methanogens sử dụng bốn phân tử hidro và một phân tử CO2 để tạo nên một phân tử CH4, đồng thời vi khuẩn này còn sử dụng CO2 như nguồn cơ chất carbon dẫn đến sự giảm áp suất trong môi trường nuôi (Wolfe, 2011).
4H2 + CO2 CH4 + 2H2O
Vật liệu thí ngiệm: Mẫu vi khuẩn của 4 đến 5 dòng vi khuẩn phân lập được.
Bố trí thí ngiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn.
Bảng 5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2 của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí
Dòng vi khuẩn
Thời gian
Ngày 1 Ngày 4 Ngày 7
Đối chứng (không chủng vi khuẩn) NT0.1 NT0.4 NT0.7 Dòng D1 NT1.1 NT1.4 NT1.7 Dòng D2 NT2.1 NT2.4 NT2.7 Dòng D3 NT3.1 NT3.4 NT3.7 Dòng D4 NT4.1 NT4.4 NT4.7 Dòng D5 NT5.1 NT5.4 NT5.7 Ghi chú: NT: Nghiệm thức
Chủng 1% (v/v) dịch vi khuẩn của từng dòng riêng lẽ (107 tế bào/ml) vào chai 50ml môi trường lỏng đã có sẵn hỗn hợp khí H2 và CO2 tỉ lệ 4:1. Đậy nắp chai bằng nút cao su và siết kín bằng nắp nhôm. Tiến hành ủ 25oC.
Xác định độ thể tích khí mất đi của từng dòng vi khuẩn tại các thời điểm ngày 1, ngày
4 và ngày 7 sau khi ủ bằng kim khí đã được làm đầy bằng khí N2. Độ giảm khí trong kim
thể hiện lượng khí mất đi trong chai nuôi.
3.2.5 Khảo sát đường tăng trưởng của các dòng vi khuẩn Mục đích : khảo sát thời gian tăng trưởng của từng dòng vi khuẩn Mục đích : khảo sát thời gian tăng trưởng của từng dòng vi khuẩn
Vật liệu thí ngiệm: Mẫu vi khuẩn: 4 đến 5 dòng vi khuẩn
Bố trí thí ngiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên 8 nghiệm thức (8 mốc thời gian: 12giờ, ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) 3 lần lặp lại.
Tiến hành:
+ Chủng 1% (v/v) dịch vi khuẩn của từng dòng riêng lẽ (107 tế bào/ml) vào chai 50ml môi trường lỏng. Tiến hành ủ 25oC.
+ Thu mẫu dịch vi khuẩn đó đem kiểm tra mật số vi khuẩn của từng nghiệm thức theo phương pháp đếm sống tại các thời điểm: 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày sau khi ủ.
+ Công thức tính mật số vi khuẩn:
N= a.n.102
Trong dó:
N: số tế bào trong 1ml.
a: số khuẩn lạc trung bình.
Mục đích: định danh ba dòng vi khuẩn để hiểu thêm về các đặc tính sinh hóa đặc biêt ở tùng dòng, khảo sát mối quan hệ di truyền giữa các dòng với nhau.
Nguyên tắc: chọn ra ba dòng có khả năng chuyển hóa mạnh nhất ở thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO2 và H2, tiến hành nhận diện bằng kỹ thuật PCR và giải trình
tự đoạn gen 16S rRNA.
Tiến hành:
a) Ly trích DNA của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp Chelex (Yang et al., 2008)
Nuôi vi khuẩn trong chai môi trường 50ml chứa 20ml môi trường lỏng có thêm 5% yeast extract và ủ qua đêm ở 25oC.
Chuyển dung dịch huyền phù vi khuẩn sang tuýp 2ml và ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.
Bỏ dịch lỏng, thêm 400 μl Bi-nước để hòa tan sinh khối.
Làm lạnh ở -20oC trong 2 phút, sau đó đun nóng trên waterbath ở 80oC trong 10 phút. Cho thêm 100μl Chelex resin 10% và vortex để hòa tan sinh khối.
Tiếp tục làm lạnh và đun nóng lần nữa.
Ly tâm 10.000 rpm trong 2 phút, rút dịch bên trên cho vào tuýp mới. Trữ ở -20oC để thực hiện bước tiếp theo.
b) Phản ứng PCR
Đoạn mồi: (Lane et al, 1991)
Mồi xuôi 27F: 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
- Thành phần phản ứng PCR: Bi nước, PCR buffer, MgCl2, dNTPs, mồi xuôi, mồi ngược, DNA vi khuẩn và Taq DNA polymerase.
Chù kỳ gia nhiệt
Hình 5: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR c) Giải trình tự gene
Mẫu DNA sau khi kiểm tra kết quả được gửi đến công ty MACROGEN (Hàn Quốc) để định danh bằng đoạn mổi 27F: 5’- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’ (Lane et al, 1991).
4.1 Kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí
Hệ thống nuôi cấy kỵ khí gồm ba bình khí nén H2, CO2 và N2 được lắp đặt đúng như thiết bị dự kiến.
Hệ thống vận hành an toàn thông qua các đồng hồ áp suất. Mỗi bộ đồng hồ gồm hai đồng hồ chính, đồng hồ thứ nhất (ĐH1) thể hiện áp suất bình, đồng hồ thứ hai (ĐH2) thể hiện áp suất dây. Tùy theo nhu cầu sử dụng mà điều chỉnh áp suất dây thông qua núm vặn phía trước đồng hồ, xoay theo chiều kim đồng hồ sẽ làm tăng áp suất dây và xoay ngược lại để giảm áp suất dây.
Các hệ thống van khí làm việc chặc chẽ và không bị rò rỉ khí.
Quy luật vận hành của hệ thống được thiết lập như sau:
(1) Vặn mở bình khí, xem xét ĐH1 đề phòng trường hợp khí hết, điều chỉnh ĐH2 phù hợp (thường sử dụng ở 1kg/cm3), khử trùng tay trước khi ngồi vào tủ cấy.
(2) Trong khi sử dụng, ta mở van khí tổng đầu tiên sau đó mở van khí cần sử dụng (ví dụ như mở van khí N2 để sử dụng cho sục khí đẩy oxy). Khí được dẫn từ bình vào dây dẫn, đi qua màng lọc và thổi vào chai môi trường. Trong trường hợp cần thay đổi khí, ta khóa van khí đang sử dụng và van tổng, bật van chân không và ấn nút khởi động máy hút chân không, sau khi hút chân không ta tắt máy, đóng van chân không và mở van khí cần thay thế cùng với van tổng. Lưu ý, khi thực hiện hút chân không, phải chắc chắn tất cả các van khí vào đã được đóng, chỉ mở các van khí ra.
(3) Sau khi sử dụng, khóa bình khí. Vặn ĐH2 theo hướng “Low”, cho đến khi đồng hồ chỉ về 0. Sau đó khóa các van khí, xem lại nút nguồn của máy chân không đã ở vị trí “off” chưa, rút điện máy chân không.
Hình 6: Hệ Thống nuôi cấy kỵ khí.
Ghi chú: hình a: bình khí, b: van khí, c: đồng hồ khí, d: nơi khí ra sử dụng, e: tổng quan hệ thống. a b d c e
Hình 7: Hàm lượng oxy ở các nghiệm thức thời gian.
*Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. %cv=3,47%.
Phần trăm oxy có kết quả cao nhất ở nghiệm thức đối chứng không dùng phương pháp sục đuổi khí, hàm lượng oxy thể hiện trong mẫu đối chứng ở khoảng 20% bằng với hàm lượng oxy trong không khí. Ở nghiệm thức 20 phút hàm lượng oxy chiếm 15% và có xu hướng giảm rõ rệt ở nghiệm thức 30 phút với 1,67%. Ở nghiệm thức 40 phút thành phần oxy gần bằng 0% trong cả ba lần lặp lại. Điều này thể hiện thời gian sục khí càng lâu thì hàm lượng oxy càng giảm do có sự thay thế các phân tử khí N2 vào vị trí của các phân tử khí oxy. Vì ở thời gian 40 phút nồng độ oxy đã về 0% nên dù có thực hiện kéo dài thời gian hơn cũng ko mang lại ý nghĩa thêm mà chỉ làm tiêu tốn khí. Ngoài ra cần lưu ý khí N2 được chuyển trực tiếp từ bình nén khí, nên luồng khí N2 có nhiệt độ thấp, nếu sục trong một thời gian quá lâu có thể gây kết tủa ở một số thành phần môi trường. Đồng thời cùng với sự khác biệt cao về mặt ý nghĩa thống kê, việc sục khí N2 40 phút trong điều kiện thí nghiệm là tối ưu cho quá trình chuẩn bị môi trường kỵ khí.
Việc thay thế phân tử O2 trong dung dịch bằng N2 là một trong những điều quyết định về sự thành công cho tất cả các thí nghiệm sau. Môi trường còn tồn tại oxy có thể dẫn đến sự phát triển của các loài hiếu khí, những loài này có tốc độ phát triển nhanh hơn so với vi khuẩn kị khí (Bryant, 1968) nên có khả năng phát triển ưu thế và ức chế các loài kị khí về thành phần dinh dưỡng môi trường. Đồng thời, vi khuẩn sinh metan là một loài vi sinh vật kị khí bắt buộc, nồng độ oxy dù rất thấp cũng có thể gây ngộ độc đối với tế bào (Smith và Hungate, 1958).
Hình 8: Hàm lượng oxy ở nghiệm thức 40 phút
Sử dụng nghiệm thức sục khí ở 40 phút để chuẩn bị môi trường cho các thí nghiệm sau.
Phân lập được năm dòng vi khuẩn: D1, D2, D3, D4 và D5
Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn
Dòng D1 D2 D3 D4 D5
Bìa nguyên Nguyên nguyên chia thùy nguyên
Hình dáng Tròn Tròn bất định Tròn bất định
Độ nổi lồi phẳng lồi Lồi mấu lồi
Đường kính 1,5mm 1mm 2 mm 1,5 mm 2 mm Màu sắc trắng vàng đục trắng vàng đục trắng vàng đục Trắng đục trắng đục
Gram Âm Âm Âm âm âm
Hình dáng vi khuẩn
que ngắn que ngắn que ngắn que ngắn que ngắn
Thời gian xuất hiện
khuẩn lạc 2 ngày 2 ngày 2 ngày 4 ngày 2 ngày
Độ nhớt Có Có Có không Không
So sánh hình dạng giữa các dòng phân lập được, ta thấy D1, D2 và D3 có những tính chất tương tự nhau về dạng bìa (đều là bìa nguyên), có cùng màu trắng vàng hơi đục, thời gian xuất hiện khuẩn lạc ngắn trong khoảng hai ngày, bề mặt khuẩn lạc có độ bóng nhờn. Mặc dù vậy, độ nổi của D1 và D3 thuộc loại lồi, nhưng D2 thì khuẩn lạc có độ phẳng. Đồng thời hình dáng của D3 thuộc dạng bất định, không giống hai dòng còn lại. Đối với D4, điểm đặc biệt là hình dáng bìa chia thùy, khác hoàn toàn so với các loài còn lại và có thời gian xuất hiện khuẩn lạc lâu. D5 tương tự D4 có đặc điểm khuẩn lạc đều có màu trắng đục và không có độ nhớt. Hình dáng vi khuẩn của cả năm dòng đều giống nhau là hình que và có gram âm. Tuy nhiên nếu dựa vào mức độ giống nhau về hình dạng khuẩn lạc và vi khuẩn ta chưa thể kết luận được gì về mối quan hệ di truyền. Mặc dù vậy, đây là cơ sở cho qua trình nhận biết sau khi giải trình tự các dòng vi khuẩn phân lập được này.
Hình 8: Hình dáng vi khuẩn và kết quả nhuộm gram xem dưới vật kính dầu x100.
Hình 9: Phần trăm thể tích khí mất đi của các dòng
Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. Cv(%)= 4,27%.
Biểu đồ thể hiện sự khác biệt thống kê của D1 và D4 so với các dòng còn lại ở mức khác biệt 5%. Giữa D1 và D4 không có sự khác biệt thống kê. D3 khác biệt thống kê với hàm lượng khí giảm cao hơn D2 và D5. Xét về nhân tố thời gian, không có sự khác biệt thống kê 5% giữa các ngày trong cùng một dòng .
Do vi khuẩn sinh metan sử dung bốn phân tử hydro và một phân tử carbon dioxide để tạo thành một phân tử metan và hai phân tử nước nên sau quá trình chuyển hóa áp suất khí sẽ giảm (Edward et al, 1975). Đồng thời do môi trường sử dụng không có nguồn carbon khác ngoài carbon dioxide, nên sự giảm áp suất cũng thể hiện khả hoạt động sinh trưởng của vi khuẩn.
Trong ngày đầu tiên, dòng 1 và 4 với lần lượt hấp thu ở 8,22% và 8,11% thể tích khí điều này chứng tỏ hai dòng trên có khả năng chuyển hóa mạnh hơn các dòng còn lại. Dòng 3 làm giảm 1,9 ml trên tổng 30 ml khí có khác biệt thống kê ở mức 5% về khả năng chuyển hóa cao hơn so với dòng 2 và 5 (đều giảm ở khoảng 5%) nhưng thấp hơn so với D1 và D4.
Các dòng đều biểu hiện sự giảm áp ở ngay ngày đầu tiên, điều này có nghĩa quá trình trao đổi chất đã diễn ra trong 24 giờ đầu, biểu hiện khả năng thích nghi nhanh ở các loài vi khuẩn này. Mặc dù loài vi khuẩn sinh metan được biết đến như một loài sinh trưởng chậm, bắt đầu có thể sinh khí metan từ ngày thứ 2 (Edward, 1975), nhưng do thời gian bắt đầu pha tăng trưởng có thể từ 5 đến 20 giờ sau khi ủ (Buswell and Hatfield, 1938) nên quá trình trao đổi chất vẫn có thể diễn ra trong thời gian này.
Nhìn chung không có sự chênh lệch thống kê giữa các nghiệm thức thời gian với nhau ở cả năm dòng. Áp suất ở ngày 4 và ngày 7 hầu như không chênh lệch so với ngày 1, điều này đồng nghĩa với sự không tiêu thụ thêm hoặc tiêu thụ rất ít hỗn hợp khí sau ngày đầu tiên. Trong khi đó, ở điều kiện môi trường đang sử dụng vi khuẩn sinh metan bắt buộc sử dụng CO2 như nguồn carbon và H2 là nguồn cho electron (Ziekus, 1977). Mặt khác, trong 24 giờ vi khuẩn rất khó có thể tiêu thụ hết chất dinh dưỡng và hoàn thành tất cả các pha tăng trưởng, bao gồm cả pha chết. Hiện tương này có thể được giải thích bằng các chuyển biến về áp suất trong môi trường nuôi ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào.
Giảm thể tích dẫn đến áp suất khí trong bình thấp hơn so với điều kiện môi trường sống tự nhiên của các dòng vi khuẩn, gây khó khăn trong quá trình sinh trưởng. Đồng thời sự thay đổi về áp suất môi trường dẫn đến sự dịch chuyển cần bằng hệ thống sinh lý và sinh hóa (định luật Le Chatelier). Ngoài ra còn thay đổi cấu trúc bậc ba và bậc bốn của protein, vì áp suất làm ảnh hưởng đến tương tác kỵ nước và lực tĩnh điện giữa các subunit trong cấu trúc protein (Silva et al, 1996). Sự thay đổi áp suất tác động đến trao đổi chất của tế bào và sự tiết các enzyme ngoại bào (Urban, 1994) cũng như ảnh hưởng không nhỏ đến tính chất màng sinh học – một trong những cấu trúc rất nhạy cảm với áp suất (MacDonald, 1997). Các phản ứng sinh học có thể bị ức chế do sự giảm áp suất
dòng vi khuẩn diễn ra tích cực ở ngày đầu, nhưng lại gần như không xảy ra ở các ngày sau. Do sau khi sử dụng nguồn cơ chất là CO2 và H2 để thực hiện các hoạt động trao đổi chất ở ngày 1, lượng khí mất đi gây nên hiện tượng giảm áp suất và ức chế sự phát triển của vi sinh vật ở các ngày tiếp theo.
Vì số liệu hầu như giống nhau ở các nghiệm thức thời gian và dựa vào phân tích One-