Sau khi khảo sát khả năng sử dụng chuyển hóa cơ chất trong hổn hợp khí của 5 dòng vi khuẩn D1, D2, D3, D4 và D5. Các dòng D1 và D4 cho kết quả chuyển hóa cao nhất ở độ tin tưởng 95%. Dòng D3 mặc dù không có khả năng chuyển hóa cao như D1 và D4,
nhưng lại cao hơn hai dòng D2 và D5 ở mức khác biệt thống kê 5%. Do hỗn hợp khí CO2
và H2 trong điều kiện nuôi cấy giữ vai trò cơ chất, nên khả năng chuyển hóa cơ chất càng mạnh dẫn đên sự mất đi các phân tử khí càng nhiều và độ giảm áp suất càng cao. Vì vậy 3 dòng D1, D3 và D4 được chọn ly trích DNA, khuếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi 27F và 1492R, định danh bằng kỹ thuật giải trình tự DNA của đoạn gene 16S tại công ty MARCROGEN, Hàn Quốc với mồi 27F.
Hình 15: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại vùng gene 16S rRNA trên gel agarose 1,5% của 3 dòng vi khuẩn. Sản phẩm điện di xuất hiện ở kích thước khoảng
1500bp.
*Giải thích: giếng 1: D1, giếng 3: D3 và giếng 4: D4.
4.6.1 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S RNA của dòng D1
Kết quả giải trình tự đối với dòng D1, sử dụng đoạn mồi 27F, cho biết trình tự của 1300 nucleotide.
đồng hình cao với loài Shigella sonnei Ss046 và một số loài Escherichia coli. Kết quả cho thấy mức độ đồng hình ở 97%.
Mặt khác vì môi trường nuôi cấy sử dụng nguồn carbon chính từ CO2, điều này bắt buộc vi khuẩn phát triển được trong môi trường phải có khả năng đồng hóa CO2. Trong khi đó Escherichia coli thuộc vi sinh vật dị dưỡng (không có khả năng sử dụng CO2). Ở điều kiện kỵ khí Escherichia coli thực hiện phản ứng lên men tạo ra các sản phẩm alcohol, các acid hữu cơ và CO2 (Lacoursiere et al, 1986). Bên cạnh đó nồng độ CO2 cao trong môi trường kị khí có thể làm giảm tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn này (Mori et al, 1983). Từ những điều kiện trên cho thấy dòng D1 chỉ đồng hình nhưng không phải loài
Escherichia coli.
Shigella là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, có gram âm. Có một số Shigella sp có khả năng cố định CO2 trong các chu trình anapletic (chu trình tạo chất trung gian cho các chu trình Krebs, TCA, citric acid cycle). Dòng Shigella sonnei Ss046 có chứa enzyme
Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC), đây là enzyme chính tham gia trong quá trình quang hợp ở thực vật, nhưng đối vơi các vi sinh vật này PEPC đóng vai trò là enzyme cho
các phản ứng cung cấp chất trung gian. Enzyme này thực hiện chức năng đồng hóa CO2,
gắn CO2 vào oxaloacetate (Caspi, 2007). Shigella boydii Sb227cũng sử dụng PEPC trong
tổng hợp CO2 (Caspi, 2008). PEPC cùng với enzyme pyruvate carboxylasecòn đóng vai
trò quan trọng trong quá trình cố định CO2 ở vi khuẩn sinh metan (Mukophadhyay, 1998).
Hình 17: Sơ đồ miêu tả đơn giản cơ chế cố định CO2 của enzyme PEPC
(*Nguồn:http://www.biocyc.org/SBOY300268/NEWIMAGE?type=PATHWAY&object=PWYQT-4429, ngày 20/10/2013)
Hình 18: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dong D1 và Shigella sonnei Ss046
Dòng D1 có trình tự tương đồng với Shigella sonnei Ss04 đã được đăng ký trong Ngân hàng gene với độ đồng hình là 97%. Kết quả so sánh cho thấy sự phù hợp cao với tỉ lệ 1130/1169 nucleotid và có tỉ lệ khoảng trống (gaps) 0% (3/1169).
4.6.2 Kết quả giải trình tự dòng D3:
Kết quả giải trình tự đối với dòng D3, sử dụng đoạn mồi 27F, cho biết trình tự của 1287 nucleotide.
Sau khi tra cứu bằng NCBI BLAST N ta thấy dòng D3 có kết quả đồng hình 99% với Enterobacter sp. REICA, Endophylic bacterium C06, Enterobacteria sp. Strain 3BJN7, Enterobacteria sp. Xw.
So sánh dòng D3 với Enterobacteria sp, do mẫu vi khuẩn được thu ở môi trường nước
thải nên khó có thể có các dòng vi khuẩn Edophytic bacterium,ta thấy tỉ lệ đồng hình giữa hai dòng cao 1138/1142 nucleotide chiếm 99%, trong khi đó khoảng trống (gap) chỉ chiếm 0% (1/1142) nucleotide .
Hình 20: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dòng D3 và Enterobacter sp. REICA
số loài Enterobacteria có khả năng tự dưỡng, cố định CO2 và sử dụng như nguồn carbon, nhưng khi nồng độ carbon hữu có cao có khả năng chuyển qua hình thức dị dưỡng (Liu, 2011). Enterobacter cloacae SCF1, Enterobacter cloacae ATCC 13047 , Enterobacter
sp. 638 là những dòng có khả năng cố định CO2 dựa vào chu trình reductive pentose- phosphate cycle xảy ra dưới sự hoạt động của enzyme ribulose-bisphosphate carboxylase (Caspi, 2008).
4.6.3 Kết quả giải trình tự dòng D4:
Kết quả giải trình tự đối với dòng D4, sử dụng đoạn mồi 27F, cho biết trình tự của 1219 nucleotide.
Sau khi tra cứu bằng NCBI BLAST N ta thấy dòng D4 có kết quả đồng hình 99% với
Enterobacter sp. REICA, Endophylic bacterium C06, Enterobacteria sp. Strain 3BJN7,
Enterobacteria sp. Xw.
So sánh dòng D4 với Enterobacteria sp ta thấy tỉ lệ đồng hình giữa hai dòng cao 1096/1097 nucleotide chiếm 99%, trong khi đó khoảng trống (gap) chỉ chiếm 0% (0/1097) nucleotide .
Hình 22: Thông số kết quả so sánh trên BLAST N của dòng D4 và Enterobacter sp. REICA
Dòng D3 và D4 có sự gần gũi di truyền. Đồng thời qua kết quả tra cứu trên Ngân hàng gene và nhận xét từ cây phả hệ có thể kết luận rằng dòng D3 và D4 thuộc loài
di truyền gần nhau nhưng sẽ là hai chủng khác nhau trong họ Enterobacteria.
Bảng 7. Đặc điểm hình thái của 3 dòng D1, D3, D4
Dòng D1 D3 D4
Bìa nguyên nguyên chia thùy
Hình dáng tròn bất định tròn
Độ nổi lồi lồi lồi
Đường kính 1,5mm 2 mm 1,5 mm
Màu sắc trắng vàng đục trắng vàng đục trắng đục
Gram âm âm âm
Hình dáng vi khuẩn
que ngắn que ngắn que ngắn
Thời gian xuất hiện khuẩn lạc
2 ngày 2 ngày 4 ngày
Độ nhớt có có không
Thí nghiệm không phân lập được vi khuẩn sinh metan có thể do nguồn gốc hóa chất đang sử dụng khác với hóa chất sử dụng trong môi trường của Ziekus, điều này có nghĩa là mặc dù sử dụng cùng khối lượng, cùng tỉ lệ hóa chất với môi trường phân lập trong lược khảo không có nghĩa là dung dịch chúng ta có cùng thế năng khử (redox potential). Vì thế năng khử rất quan trọng trong việc phân lập vi khuẩn sinh metan (Ziekus, 1977), trong khi đó Wolfe nhận định hóa chất đóng vai trò chủ yếu trong việc tạo thế năng khử, và ông nuôi cấy vi khuẩn metan dưới -330mV (2011). Thế năng khử ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Các vi sinh vật có thế năng khử tối ưu khác nhau, trong đó vi khuẩn hiếu khí thích hợp trong khoảng +500 đến +300 mV, kị khí không bắt buộc là +300 đến -100 mV, -100 đến nhỏ hơn -250 mV cho vi khuẩn kị khí bắt buộc (Ray, 1996). Cả 3 dòng vi khuẩn được giải trình tự đều thuộc nhóm kị khí không bắt buộc, có nghĩa là môi trường nuôi cấy có thế năng khử từ +300 đến -100 mV. Điều này giải thích tại sao thí nghiệm không phân lập được vi khuẩn sinh metan, thuộc nhóm kị khí bắt buộc. Vậy việc
sử dụng hóa chất trong thí nghiệm phân lập là một yếu tố hết sức quan trọng, để có thể thành công cần hiểu rõ về nguồn gốc hóa chất và đồng thời cũng cần có thời gian sử dụng và kinh nghiệm gia giảm các hóa chất một cách thích hợp.
Mặc dù 3 dòng phân lập được đều không nằm trong nhóm vi khuẩn sinh metan, nhưng cả 3 dòng đều có khả năng sử dụng CO2 như nguồn cung cấp carbon. Sự phát triển và
tăng trưởng nhanh cũng như khả năng tiêu thụ CO2 cao mở ra một hướng mới trong ứng
dụng về xử lý môi trường.
CO2 là một trong những khí chính gây nên hiệu ứng nhà kính. Từ khi có sự xuất hiện
của nên công nghiệp mức độ CO2 tăng lên gấp 40%. Trong khi đó nước và nước biển nói
chung hấp thụ một phần ba tổng lượng CO2 trên Trái Đất, điều này dẫn đến quá trình acid
hóa vì CO2 hòa tan vào nước tạo thành carbonic acid. Tuy nhiên sự ô nhiễm nguồn nước
do các chất hữu cơ từ phân bón, con người và động vật cũng cung cấp một nguồn lớn CO2
thông qua quá trinh phân hủy sinh học (William and Wei, 2012).
Nồng độ CO2 gây thay đổi tính chất hóa học của nước, do sự kết hợp của các ion Ca2+
trong nước với CO2 tạo thành kết tủa, điều này ảnh hưởng mạng đến các loài thân mềm
hoặc các loài sử dụng Ca2+ để hình thành lớp vỏ. Quá trình ảnh hưởng này đã thấy thực nghiệm rõ rệt trên các loài san hô ở vùng nhiệt đới . Mặt khác thực vật biển hấp thụ nguồn CO2 và chịu ảnh hưởng trực tiếp từ quá trình acid hóa do sự hòa tan CO2 vào nước. Càng nhiều CO2 hòa tan, nồng độ H+ càng cao. Tảo hấp thụ ion H+, đồng thời tảo cũng dễ hấp thụ các kim loại, những kim loại này, trong môi trường acid dễ bị oxi hóa tạo thành những hợp chất kim loại độc. Vì thực vật đứng đầu trong chuỗi thức ăn sinh học, nên khi tảo bị nhiễm độc sẽ dẫn đến hệ lụy cho các loài có liên quan (Giordano et al, 2005).
Tăng nồng độ CO2 chỉ ảnh hưởng từ 10% hoặc ít hơn đến tốc độ quang hợp trong khi
đó quá trình vôi hóa bị giảm đi đáng kể do sự tạo thành CaCO3 một hợp chất rất bền của
Canxi gây ảnh hưởng đến những loài thân mềm và động vật có vỏ (Giordano et al, 2005). Đối với các động vật lớn sống trong nước không hô hấp trực tiếp từ không khí, chúng hấp
thụ oxy hòa tan rồi thải CO2 qua mang. Nồng độ CO2 tăng làm giảm pH môi trường gây
ảnh hưởng mạnh mẽ đến những loài sử dụng phương thức hô hấp này, do quá trình acid hóa mô làm giảm năng lượng tế bào và làm cho hoạt động hô hấp diễn ra chậm (Pörtner et
chức năng của các động vật lớn đều bị ảnh hưởng, kể cả hoạt động sinh trưởng và sinh sản (Langenbuch và Pörtner, 2003).
Vì vậy việc làm giảm nồng độ CO2 là một trong những việc quan trọng và có tính ứng
dụng cao để ngăn chặn những biến động do CO2 gây ra cho môi trường nói chung và môi
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
- Thiết lập được hệ thống có khả năng tạo môi trường yếm khí, kết luận được thời gian tối ưu sục khí N2 để đuổi oxy trong môi trường là 40 phút với thành phần oxy đạt mức 0%
- Tất cả 5 dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng sử dụng CO2 như nguồn cơ
chất carbon trong điều kiện yếm khí. Trong đó có dòng D1, D3 và D4 có khả năng trao đổi chất mạnh, thời gian trao đổi chất ở pha chỉ số của các dòng nhìn chung khá ngắn và kéo dài trong ngày.
- Giải trình tự được 3 dòng vi khuẩn trong đó D1đồng hình 97% với dòng Shigella
Sonnei Ss046 với độ đồng hình là 97%; D3, D4 cùng đồng hình với Enterobacter sp REICA ở 99%.
5.2 Kiến nghị
-Khảo sát ảnh hưởng của hóa chất đến thế năng khử trong môi trường
-Khảo sát ảnh hưởng của áp suất đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Vũ Ngọc Bảo. 2010. Cơ hội phát triển ngành tái chế giấy và bao bì đã qua sử dụng. Báo
New Saigon. Số 1(50).2010.
Tiếng anh
Barker, H.A. 1956. Biological formation of methane. Bacterial fermentations, pp.1, John Wiley and Sons, Inc., New York.
Bryant, M.P., B.C. McBride, and R.S. Wolfe. 1968. Hydrogen-oxidizing methane bacteria. Cultivation and methanogenesis. J. Bacteriol, 95:1118-1123.
Bryant, M.P. 1974. Methane producing bacteria. In R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (ed.), Bergey's manual of determinativebacteriology. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, pp. 33.
Buswell, A.M., W.D. Hatfield. 1938. Anaerobic fermentations. Bulletin No. 32. State Water Survey.
Caspi, R. 2007. Shigella sonnei Ss046Pathway: CO2 fixation into oxaloacetate
(anapleurotic), SRI international, 95:18-23.
Caspi, R. 2008. Shigella boydii Sb227Pathway: CO2 fixation into oxaloacetate (anapleurotic),SRI international, 25:11-11
Cheeseman, P., A. Toms-Wood, and R.S. Wolfe. 1972. Isolation and properties of
afluorescent compound, factor420, from Methanobacterium strain M.O.H. J.
Bacteriol, 112:527-531.
Edwards, T., and B.C. McBride. 1975. New method for the isolation and identification of methanogenic bacteria. Appl. Microbiol. 29:540-545.
Ferry, J.G., P.H. Smith, and R.S. Wolfe. 1974. Methanospirillum, a new genus of methanogenic bacteria and characterization of Methanospirillum hungatii sp. nov.
Giordano, M., J. Beardal, and J.A Raven. 2005. CO2 concentrating mechanisms in algae:
mechanism environmental modulation, and evolution. Annual Review of Plant
Biology 56, 99–131.
Gunsalus, R.P., R.S. Wolfe. 1978. ATP activation and properties of the methyl coenzyme M reductase system in Methanobacterium thermoautotrophicum. Annual Review of Plant Biology, 135(3):851-7.
Hungate, R. E. 1969. A roll-tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol. 3B, 117–132.
Lacoursiere, B.G., M.M. Thompson, D. Kole, D.F. Gerson. 1986. Effects of carbon dioxide concentration on anaerobic fermentations of Escherichia coli, 135:801-7. Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial
Systematics, pp. 115–175.
Langenbuch, H., and H.O. Pörtner. 2003. Energy budget of hepatocytes from Antarctic fish (Pachycara brachycephalum and Lepidonotothen kempi) as a function of ambient CO2: pH-dependent limitations of cellular protein biosynthesis. Journal of Experimental Biology, 3895–3903.
Leadbetter J.R., and J.A. Breznak. 1996. Physiological ecology of Methanobrevibacter cuticularis sp. nov. and Methanobrevibacter curvatus sp. nov., isolated from the hindgut of the termite Reticulitermes flavipes, 265:401-2
Liu F., C.C. Zhao, L. Xia, F. Yang, X. Chang, Y.Q. Wang. 2011. Biofouling characteristics and identification of preponderant bacteria at different nutrient levels in batch tests of a recirculating cooling water system, Journal of Experimental Biology, 3675–3253.
MacDonald, A.G. 1997. Hydrostatic pressure as an environmental factor in life
processes. Comp Biochem Physiol 116A:291–297.
McCarthy, E. Donchin. 1981. A metric for thought: a comparison of P300 latency and reaction time. Science 2 January 1981: Vol. 211 no. 4477 pp. 77-80
microoranisms in fed-batch cultures. J. Ferment. Technol. 61:211-213.
Mukhopadhyay B., S.F. Stoddard, R.S. Wolfe. 1998. Purification, regulation, and molecular and biochemical characterization of pyruvate carboxylase from
Methanobacterium thermoautotrophicum strain deltaH. Annual Review of Microbiology, 171-354.
Pörtner H.O., M. Langenbuch and A. Reipschläger. 2004. Biological impact of elevated ocean CO2 concentrations:lessons from animal physiology and Earth history.
Journal of Oceanography 705–718.
Ray, D.S.Xu, J.C. Hines, M.L. Engel, D.G. Russell. 1996. Nucleus-encoded histone H1- like proteins are associated with kinetoplast DNA in the trypanosomatid Crithidia fasciculata. Mol. Cell. Biol, 16:564-576.
Rirvad, C.J., Smith P.H. 1982. Isolation and Characterization of a Thermophilic Marine
Methanogenic Bacterium, Methanogenium thermophilicum sp. nov.
Robert Scott. 2013. Understanding the Basic Principles of Nitrogen, connecticul water pollution abatement association. Mol. Cell. Biol, 11:164-376.
Silva, J.L., D. Foguel, A.T. Da Poian, P.E. Prevelige. 1996. The use of hydrostatic pressure as a tool to study viruses and other macromolecular assemblages. Curr Opin Struct Biol1996, 6:166–75.
Skillman, L.C., P.N. Evans, C. Strömpl, K.N. Joblin. 2006. 16S rDNA directed PCR primers and detection of methanogens in the bovine rumen. J. Bacteriol, 24:537– 547.
Smith, P.S., and R.E. Hungate. 1958. Isolation and characterization of Methanobacterium
ruminantium sp. n. J. Bacteriol. 15:137–157.
Somero G.N. 1992. Adaptations to high hydrostatic pressure. Annu Rev Physiol 54:557–
577.
Stephen T. Abedon. 1999. Bacteriophage T4 resistance to lysis-inhibition collapse.
Taylor, C.D., and R.S. Wolfe. 1974. Structure and methylation of coenzyme M(HSCH2CH2SO3). J. Biol. Chem. 249:4879-4885.
Tzeng, S.F., R.S. Wolfe, and M.P. Bryant. 1975. Factor 420-dependent pyridine
nucleotide-linked hydrogenase system of Methanobacterium ruminantium. J.
Bacteriol. 121:184-191.
Urban J.P. 1994. The chondrocyte: a cell under pressure. Br J Rheumatol 33:901–908 William, G.Sunda and Wei-Jun Cai. 2012. Eutrophication Induced CO2-Acidification of
Subsurface Coastal Waters: Interactive Effects of Temperature, Salinity, and Atmospheric PCO2.American Society for Microbiology, p. 514-541.
Wolfe R.S., 2011. Techniques for Cultivating Methanogens, pp. 520-567.
Zeikus. J.S. 1977. The Biology of Methanogenic Bacteria. American Society for Microbiology, p. 514-541.
Tài liệu mạng
http://www.biocyc.org/SBOY300268/NEWIMAGE?type=PATHWAY&object=PWYQT -4429 , (20/10/2013).
PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1. Phương pháp pha loãng
Nguyên tắc: do dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng độ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải được pha loãng. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 101 đến 105 lần cho đến khi đạt