Nghiên cứu phương pháp bán tổng hợp artesunat

1.3.9- Các phương pháp định tính, định lượng artesunat 1.3.9.1- Các phương pháp hoá học > Phương pháp acid - base : Phân tử artesunat có một nhóm chức acid tự do nên có thể định lượng tr

BỘ Y TẾ mưỜKG ĐAI HOC Dươc HÀ • • • NỒI •

BÙI THỊ MAI SƯƠNG

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHOÁ 1999 - 2004)

Người hướng dẫn Nơi thực hiện

- Thời gian thực hiêỊỊ^

Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo Nguyễn Đình Luyện cùng các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm.

Hà Nội, tháng 5 năm 2004

Sinh viên:

Bùi Thị Mai Sương

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

PHẦN 1- TỔNG QUAN 2

1.1- Vài nét về sự phát triển của các thuốc chống sốt ré t 2

1.2- Nguồn gốc, tính chất của Artemisinin 4

1.2.1- Nguồn gốc 4

1.2.2- Tính chất của Artemisinin 4

1.3- Đại cương về Artesunat 8

1.3.1- Đặc điểm hoá học và vật lý 8

1.3.2- Tác dụng và cơ chế tác dụng 9

1.3.3- Liên quan cấu trúc và tác dụng 10

1.3.4- Dược động h ọ c 10

1.3.5- Lâm sàng 11

1.3.6- Tương tác thuốc 12

1.3.7- Độc tính 12

1.3.8- Chế phẩm và cách dùng artesunat trong điều trị 12

1.3.9- Các phương pháp định lượng artesunat 13

1.4- Bán tổng hợp artesunat 14

PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18

2.1- Nguyên vật liệu,thiết bị và phương pháp thực nghiệm 18

2.1.1- Nguyên liệu 18

2.1.2- Thiết b ị 18

2.1.3- Phương pháp thực nghiệm 19

2.2- Kết quả thực nghiệm và nhận x ét 23 2.2.1- Khảo sát ảnh hưởng của một số xúc tác đối với phản ứng

2.2.2- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác đối với thời gian

phản ứng và chất lượng Artesunat 27

2.2.3- Ảnh hưởng của dung môi đến sự tạo thành artesunat 30

2.2.4- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng ester hóa 34

2.3- Bàn luận 36

2.3.1- Cơ chế phản ứng bán tổng hợp Artsunat và ảnh hưởng của chất xúc tá c 36

2.3.2- Ảnh hưởng của dung môi, tỷ lệ xúc tác, nhiệt độ và thời gian phản ứng 36

2.3.3- Phổ hồng ngoại 38

PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 39

3.1- Kết lu ậ n 39

3.2- Đề xuất 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VÂN ĐỂ

Việc đưa Artemisinin và các dẫn xuất vào sử dụng là một tiến bộ lớn trong điều trị sốt rét Các công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam cho thấy nhóm artemisinin khỏi đầu tác dụng nhanh, diệt ký sinh trùng và cắt cơn sốt cổ hiệu quả Nhóm thuốc này đã được WHO khuyến cáo sử dụng trong

điều trị sốt rét, đặc biệt ở những vùng có chủng p falciparum đã kháng

1 Bán tổng hợp artesunat với xúc tác N aH C 03và Na2C 0 3

2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp artesunat, từ đó tìm ra các điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu suất cao

PHẦN 1 - TỔNG QUAN

1.1- VÀI NÉT VỂ Sự PHÁT TRIỂN CỦA CÁC THUỐC CHỐNG SỐT RÉT

Các vị thuốc chữa sốt rét như cây thanh cao hoa vàng, canh ki na đã được sử dụng từ lâu đời, nhưng mãi tới đầu thế kỷ XIX, những nghiên cứu về hoá học các thuốc sốt rét mới thực sự bắt đầu

Năm 1834, Quinin được người châu Âu phân lập và sử dụng Đây là thuốc dùng trị sốt rét sớm nhất dưới dạng hoạt chất tinh khiết Nó chỉ có tác dụng với thể phân liệt, ít tác dụng với thể giao bào và khá độc

Năm 1926, Primaquin được tổng hợp ở Đức Dẫn xuất nhóm

8- Aminoquinolin này có tác dụng diệt thể giao bào và thể ngủ trong gan,

dùng để điều trị tiệt căn, chống tái phát xa với p vivax.

Năm 1944, Chloroquin, một dẫn xuất thuộc nhóm 4-Aminoquinolin được tổng hợp Đây là thuốc chống sốt rét lý tưởng trong nhiều năm, vì vừa có

tác dụng đối với p.falciparum và p.vivax, vừa có thể dùng dự phòng lại ít độc

hơn các thuốc chống sốt rét khác thời đó

Năm 1948, nhóm thuốc kháng folic ra đời, trong đó Proguanil và Chloroguanin có tác dụng tốt và ít độc hơn quinin Năm 1951, Pyrimethamin được tổng hợp, nó có cùng cơ chế kháng folic nhưng ít độc hơn Hiện nay, các thuốc này ít dùng vì đã bị kháng cao Năm 1972, Mefloquin được đem vào sử dụng rộng rãi vì ưu điểm diệt thể phân liệt mạnh và thải trừ chậm

Cũng vào năm 1972, Artemisinin được phân lập từ cây thanh cao hoa vàng ở Trung Quốc Artemisinin có tác dụng rất mạnh trên KST sốt rét và tác dụng với cả các chủng kháng đa thuốc Artemisinin được dùng làm thuốc chữa sốt rét hoặc làm nguyên liệu bán tổng hợp các dẫn xuất khác, tạo ra một nhóm thuốc điều trị sốt rét có triển vọng [2]

Do artemisinin có nhược điểm ít tan trong dầu và trong nước, tỷ lệ tái phát cao, nên các nhà khoa học đã nghiên cứu bán tổng hợp các dẫn xuất của artemisinin để cải thiện các đặc điểm dược lý và dược động học.

Phần lớn các dẫn xuất đó đều là ether hoặc ester của DHA DHA là một• V *

c

dẫn suất hình thành khi khử hóa nhóm >C=Q carbonyl của artemisinin thànhnhóm >CH ÕỈĨỒ Các dẫn xuất ether, ẹster có chứa những nhóm thân nước hoặc thân dầu, nên cải thiện được khả năng hoà tan so với artemisinin Dẫn xuất tan trong nước điển hình là natri artesunat (muối natri -DHA- hemi succinat) và natri artelinat (muối natri - P" DHA- hydroxy- methylbenzoat ether) với hoạt tính chống sốt rét cao hơn artemisinin 2-5 lần Các dẫn xuất tan trong dầu là artemether (P~ DHA- methyl ether) và arteether (ị3- DHA- ethylether) với tác dụng mạnh hơn artemisinin khoảng 2 lần [21,24] Ngoài ra, còn có một số dẫn xuất íluoro alkyl ether có hiệu lực cao, đặc tính điều trị tốt đang được tiếp tục nghiên cứu về hoá học và sinh học [3]

CH,

R

=0 -OH

-O O Ỉ3

-0 Q H , -0(C=0)(CH2)2C00Na -OCH2C6H4COONa

Hoat chất Artemisinin Dihydroartemisinin Artemether

Arteether Natri artesunat Natri artelinat

2.2- NGUỔN GỐC, TÍNH CHẤT CỦA ARTEMISININ

2.2.1- Nguồn gốc

Artemisinin là hoạt chất có tác dụng chống sốt rét được chiết xuất từ

cây thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L Asteraceae) Cây được trồng nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam, ngoài ra còn có ở nhiều nơi khác như Ấn Độ,

châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ Hàm lượng Artemisinin trong lá khô từ 0,01- 1,00% phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý, thời điểm thu hái [6,13] Hàm lượng Artemisinin cao nhất trong lá ở phần ngọn vào thời điểm trước khi cây ra hoa[ll]

- Năng suất quay cực : [a]D20= +66,3° (C=l,64% trong chloroform)

- Tính c h ấ t: Artemisinin có dạng tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màutrắng, không mùi, vị đắng, rất ít tan trong nước, dầu; tan trong ethanol, aceton, rất dễ tan trong chloroform và ethylacetat

1.2.2.2- Các phản ứng hoá học của artemisinin [9,14,23,24]

Artemisinin là một serquiterpen lacton có cầu nối peroxid nội đặc trưng Do cầu peroxid là liên kết dễ bị phân huỷ nên artemisinin bị biến đổi trong các điều kiện khác nhau thành những hợp chất mà đa số không giữ được khung cơ bản ban đầu Trong môi trường trung tính, artemisinin khá bền vững Trong môi trường kiềm mạnh hay acid mạnh, artemisinin bị mất hoạt tính do cầu peroxid bị phá huỷ[14]

> Phản ứng với kiềtn

Artemisinin dễ bị phân huỷ bởi kiềm thành các sản phẩm khác nhau

NaOH loãng

Khi cho Artemisinin (1) tác dụng với kali carbonat trong methanol ở nhiệt

độ phòng sẽ tạo ra ester (2), epoxy lacton (3) và một cetoacid (4) Nếu cho tác dụng với kiềm trong nước sẽ tạo thành pyran (5) Khi tác dụng với kiềm kéo dài thu được lacton (6) Trong dung dịch kiềm loãng tạo ra hợp chất (7) còn gọi là Q292, có cực đại hấp thụ ở 292nm [24] Phản ứng này được áp dụng trong phép định lượng bằng quang phổ tử ngoại như đo mật độ quang sau khi thuỷ phân artemisinin bằng NaOH loãng hoặc làm phản ứng trước hay sau cột trong định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

> Phản ứng vói acid

Phản ứng của artemisinin với acid sẽ tạo ra một hỗn hợp phức tạp các sản phẩm thuỷ phân và sắp xếp lại phân tử Artemisinin tác dụng với acid trong ethanol tạo thành ba hợp chất (8), (9), (10)

Khử hoá bằng tác nhân L1AIH4 tạo ra hợp chất (11), (12)

Khử hoá artemisinin bằng NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp sẽ tạo

ra DHA (14) mà rất ít ảnh hưởng đến nhóm peroxid DHA là hợp chất trung gian quan trọng để tổng hợp ra nhiều dẫn xuất khác

Nếu dùng tác nhân khử là hỗn hợp NaBH4 và boron trifluorid (BF3Et20), nhóm carbonyl bị khử thành nhóm methylen, tạo ra deoxoartemisinin (15) có hoạt tính chống sốt rét gấp 8 lần so với artemisinin.

1.3- ĐẠI CƯƠNG VỀ ARTESUNAT

I - Tính chất: tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng, không mùi,

không vị, rất khó tan trong nước, tan tốt trong dichloromethan, dễ tan trong ethanol, aceton, chloroform và dung dịch kiềm Bền vững trong môi trường trung tính, trong nước dễ bị thuỷ phân đặc biệt là trong môi trường kiềm Dạng muối natri dễ tan trong nước, do vậy dùng natri artesunat để pha dung dịch tiêm

1.3.2- Tác dụng và cơ chế tác dụng

1.3.1.2- Tác dụng

Artemisinin có tác dụng trực tiếp và nhanh chóng trên invitro cũng như

invivo đối với các chủng Plasmodium, kể cả các chủng đã kháng lại các thuốc

chống sốt rét khác Thuốc có tác dụng mạnh trên thể phân liệt của KST sốt rét

ở giai đoạn trong hồng cầu Thời gian làm sạch KST trong máu khoảng 24 giờ,

nhanh hơn so với các thuốc điều trị sốt rét khác Thuốc không có tác dụng diệt thể giao bào, nghĩa là không có tác dụng dự phòng [14,16]

Các thí nghiệm trên invivo với p Berghei ở chuột nhắt trắng và

p cynomolgi ở khỉ cho thấy hoạt tính chống sốt rét của natri artesunat cao hơn

artemisinin 5 lần khi dùng đường tiêm tĩnh mạch [7]

Kháng thuốc : Hiện tượng KST kháng artemisinin và các dẫn xuất được quan sát trên invivo và trên súc vật thí nghiệm Tuy nhiên, trên thực tế lâm

sàng, đến nay chưa thấy p falciparum kháng lại artemisinin và dẫn xuất Sự

giảm tác dụng của thuốc chỉ xảy ra khi cùng một bệnh nhân bị nhiều chủng KST sốt rét tấn công trong những lần nhiễm bệnh khác nhau [2]

1.3.2.2- Cơ chế tác dụng [16,21]

Có nhiều quan điểm khác nhau khi giải thích cơ chế tác dụng của Artemisinin và các dẫn xuất của nó Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho rằng artemisinin tấn công chủ yếu vào màng tế bào KST làm thay đổi cấu trúc

vi mô của màng tế bào Theo Gu và cộng sự, tác dụng diệt KST là do các gốc

tự do Gốc tự do tạo ra do cầu peroxid nội phân tử bị gẫy sắt trong hem và có thể cả sắt tự do xúc tác quá trình phá vỡ cầu peroxid tạo ra gốc tự do Gốc tự

do alkyl hoá các phân tử protein màng tế bào KST làm thay đổi hình thái của ribosome và lưới nội chất, do đó ngăn cản tổng hợp protein của tế bào KST và tiêu diệt chúng

1.3.3- Liên quan cấu trúc và tác dụng [16]

Artemisinin tác dụng với acid hoặc kiềm đều tạo thành các sản phẩm không có hoạt tính chống sốt rét Các chất chuyển hoá không có nhóm peroxid như deoxyartemisinin và các sesquiterpen lacton khác được chiết từ

Artemisinin annua L Asteraceae đều không có tác dụng Như vậy, nhóm

peroxid vòng là không thể thiếu cho tác dụng chống sốt rét Nhưng một mình nhóm peroxid là chưa đủ bởi chất a-santonin, một peroxid vòng được tổng hợp bởi Tani và cộng sự lại không có tác dụng này

Trên cơ sở artemisinin và các dẫn xuất là những chất kiềm yếu, như những chất amin có khả năng tập trung chọn lọc vào không bào tiêu hoá của KST sốt rét Vennerstrom đã điều chế ra một loạt các amin peroxid Những hợp chất này cũng có chút hoạt tính trên invitro, nhưng không có hoạt tính trên invivo Những nghiên cứu sâu hơn về hệ vòng của phân tử còn đưa ra kết luận rằng sự nguyên vẹn của cấu trúc lập thể là bắt buộc cho hoạt tính chống sốt rét

> Phân bố

Mức độ liên kết với protein huyết tương phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu Ở người, artesunat kết hợp với protein huyết tương khoảng 48% Artesunat có thể qua hàng rào rau thai nên tránh dùng cho phụ nữ có thai

So sánh điều trị bằng artesunat liều 600mg (6 ngàyxlOOmg) với điều trị bằng artemisinin liều 3g (6 ngàyx500mg):

- Thời gian cắt cơn sốt của artesunat (18,9 giờ) nhanh hơn artemisinin (21,8giờ)

- Thời gian sạch ký sinh trùng trong máu của artesunat (26,4 giờ) nhanh hơn artemisinin (31 giờ)

- Tỷ lệ tái phát 20% bệnh nhân, thấp hơn so với artemisinin (35%)

- Thử nghiệm 17 bệnh nhân sốt rét thể não, 15 bệnh nhân đã được chữa khỏi,

ý thức phục hồi đáng kể sau 12 ± 5 giờ

1.3.6- Tương tác thuốc [5,19,21]

Tác dụng của artesunat bị giảm khi có mặt chất xúc tác thuỷ phân như catalase hay các chất khử như acid ascorbic, vitamin E, glutathion dạng khử Tác dụng tăng lên khi có mặt các chất oxy hoá như miconazol, doxarubicin

Các thuốc chống sốt rét khác như mefloquin, primaquin, chloroquin khi phối hợp với artesunat cho tác dụng hiệp đồng tăng cường hay hiệp đồng cộng Ngược lại, các thuốc như pyrimethamin, sulfamid lại có tác dụng đối kháng

- Độc tính bán cấp : cho chuột nhắt trắng uống artesunat liều 4mg/kg trong

5 ngày liền, không thấy tổn thương cấu trúc tế bào mô ở gan và thận

Năm 1994, viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thử nghiệm artesunat trên người Kết quả cho thấy :

- Trên người khoẻ mạnh : không có sự thay đổi về huyết học, sinh hoá, điện tim trước và sau khi thử Tại chỗ tiêm không có phản ứng, không đỏ, không mẩn ngứa

- Trên bệnh nhân nhiễm p falciparum không biến chứng : thuốc có hiệu qủa

điều trị, cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng, không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, hệ tim mạch

1.3.8- Chế phẩm và cách dùng artesunat trong điều trị [2,5]

♦♦♦ Artesunat có hai dạng bào c h ế :

- Viên nén 50mg.

- Bột pha tiêm : lọ chứa 60mg acid artesunic ở dạng bột vô trùng, kèm ống

tiêm chứa lml dung dịch NaHC03 5%

Chỉ định : Điều trị cắt cơn sốt rét do p vivax, p malarie kể cả sốt rét

do nhiễm p falciparum đã kháng các loại thuốc khác.

❖ Liều dùng :

- Dạng uống : điều trị mỗi đợt 12 viên trong 5 ngày

- Dạng tiêm : hoà tan thuốc vào dung dịch NaHCOs 5% cho thêm dung dịch

Glucose đẳng trương để có nồng độ 10 mg/ml

Trẻ em < 6 tu ổ i: lmg/kg/lần Người lớn : 1,2-1,6 mg/kg/lần

Tuỳ theo từng bệnh nhân, sau 4, 24, 48 giờ nhắc lại một lần

1.3.9- Các phương pháp định tính, định lượng artesunat

1.3.9.1- Các phương pháp hoá học

> Phương pháp acid - base :

Phân tử artesunat có một nhóm chức acid tự do nên có thể định lượng trực tiếp artesunat bằng dung dịch NaOH chỉ thị phenolphtalein Căn cứ vào lượng kiềm tiêu thụ để tính ra lượng chất thử cần định lượng Phương pháp này khá đơn giản, thưòng dùng để định lượng nguyên liệu artesunat

1 3.9.2- Các phương pháp quang [15]

> Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại:

Artesunat thuỷ phân trong môi trường kiềm, đun nóng tạo ra sản phẩm Q289 có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 28 nm, do đó có thể định lượng artesunat trong nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm thuỷ phân này trên máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 289nm

> Phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến :

Nhóm chức ester của artesunat phản ứng tạo hydroxamat sắt (III) có màu và đo quang dung dịch thu được ở bước sóng 508 nm

I.3.9.3 Các phương pháp sắc ký [15,25]

> Phương pháp sắc ký lớp mỏng :

Phương pháp sử dụng hệ dung môi khai triển phù hợp để tách hỗn hợp thành các vết riêng rẽ, rồi hiện màu bằng các thuốc thử đặc hiệu Sau đó quan sát màu sắc và so sánh Rf của vết thử với vết đối chiếu

> Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được ứng dụng ngày càng nhiều để định lượng artesunat

Cột được dùng trong HPLC chủ yếu là cột pha đảo Detector thường dùng là detector u v đo trực tiếp hay dẫn xuất hoá sau cột để tăng độ nhạy Ngoài ra, còn có thể dùng detector điện hoá, detector khúc xạ kế

1.4- Bán tổng hợp artesunat

Artesunat được bán tổng hợp từ artemisinin qua giai đoạn trung gian là DHA

1.4.1- Giai đoạn I : Bán tổng hợp DHA [8,14]

Cho đến nay, phương pháp hiệu quả nhất để khử hoá chọn lọc nhóm -

c= 0 lacton của artemisinin thành nhóm -OH bán acetal trong DHA là dùng

tác nhân khử NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp

Trên cơ sở phương pháp này, A.Brossi đã điều chế DHA bằng cách cho một phần artemisinin vào 50 phần methanol ở 0-5° c , rồi cho dần một phần chất khử NaBH4 vào Sau khi tinh chế thu được DHA với hiệu suất 79% TS

Đỗ Hữu Nghị thực hiện phản ứng theo nguyên tắc trên nhưng giảm 6 lần lượng chất khử và dung môi, cải tiến phương pháp tinh chế thu được DHA với hiệu suất trên 90%

1.4.2- Giai đoạn I I : Bán tổng hợp artesunat [9,14]

Các dẫn xuất ester được tổng hợp theo nguyên tắc cho DHA tác dụng vói tác nhân acyl hóa tương ứng, có mặt xúc tác thích hợp Tác nhân acyl hoá

có thể là chlorid acid, anhydrid acid hoặc acid carboxylic Xúc tác cho phản ứng acyl hóa thường là các amin bậc ba như pyridin, triethylamin, 4- dimethylaminopyridin hoặc hỗn hợp các xúc tác này

X: -Cl, -OH, acyloxy R: aryl, akyl

Phương pháp cổ điển sử dụng tác nhân acyl hoá là chlorid acid hoặc anhydrid acid trong môi trường có xúc tác pyridin chỉ thu được kết quả với

số ít ester Năm 1982, Li.Y sử dụng 4-DMAP làm xúc tác cho phản ứng acyl hoá Đây được coi là phương pháp cải tiến, hiệu qủa thu được khả quan nhưng có nhược điểm là phản ứng tạo ra sản phẩm phụ gây khó khăn cho việc tinh chế

DHA được ester hoá thành artesunat khi cho tác dụng với anhydrid succinic, xúc tác là một amin bậc ba: 4-dimetylaminopyridin (4-DMAP) Khi

sử dụng acid succinic làm tác nhân acyl hóa thì phải dùng hỗn hợp 4-DMAP

và dicyclohexyl carbodiimid (DCC) [14]

DHA và anhydrid succinic sử dụng xúc tác là hỗn hợp pyridin, 4-DMAP và đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp [9]

¥

Sơ đồ qui trình bán tổng hợp Artesunat từ Dỉhydroartemisinin

- 4-Dimetylaminopyridin (pA), pyridin (pA), acetonitril (pA).

- Artesunat chuẩn thứ cấp (Bộ môn Công nghiệp Dược)

- Các hoá chất: anhydrid succinic, natri carbonat, natri bicarbonat,p-dimethylaminobenzaldehyd, acid acetic, acid phosphoric (p)

- Dung môi: aceton, ethanol tuyệt đối, ether ethylic, n-hexan, ethyl acetat, dichloromethan, methanol (p)

2.1.2- Thiết bị.

- Cân điện tử Satorius (Đức)

- Máy khuấy từ Heidolph MR3001(Đức)

- Thiết bị cất quay Bucchi (Thụy Sĩ)

- Tủ sấy điện

- Máy đo năng suất quay cực Metller (Thụy Sĩ)

- Máy đo độ chảy Metller (Thụy Sĩ)

- Máy quang phổ UV-VIS Carry 100-Varian (Úc-Mỹ)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Class-VP (Nhật)

- Bản mỏng sắc ký silicagel G (Merck)

- Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer, Phòng thí nghiêm trung tâm, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.3- Phương pháp thực nghiệm

2.1.3.1- Phương pháp tổng hợp Artesunat

- Bán tổng hợp artesunat bằng phản ứng ester hoá DHA với anhydrid succinic, xúc tác NaHC03 và Na2C 03

- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dung môi, nồng độ chất xúc tác, nhiệt

độ, thời gian đến phản ứng bán tổng hợp, từ đó tìm ra các điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu suất cao, chất lượng artesunat tốt

- Theo dõi phản ứng ester hoá bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đánh giá nhanh sự hình thành sản phẩm một cách định tính

- Tinh chế sản phẩm thu được bằng phương pháp kết tinh phân biệt

- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đo quang phổ hấp thụ tử ngoại để định lượng artesunat trong sản phẩm, từ đó tính hiệu suất phản ứng

Sản phẩm artesunat được định tính bằng phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng thử tạp chất liên quan, xác định góc quay cực riêng a D20, nhiệt độ nóng chảy

2.1.3.2- Phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Bản mỏng silicagel G đã được hoạt hóa ở 120° trong 30 phút

- Dung môi khai triển: n-hexan: ethylacetat (6:4)

- Dung dịch th ử : chứa lOmg chế phẩm trong lml ethanol (TT)

- Dung dịch đối chiếu (1): chứa 0,1 mg DHA trong lml ethanol (TT)

- Dung dịch đối chiếu (2): chứa 0,05mg DHA trong lml ethanol (TT)

- Hiện màu : phun thuốc thử ( gồm 0,25 g paradimetyl - aminobenzaldehyd, 50ml acid acetic, 5ml acid phosphoric đặc và 45ml nước) rồi sấy bản mỏng ở 110°c trong 4-5 phút Vết DHA và vết artesunat có màu xanh tím

*1* Tiến hành thử tạp chất liên quan :

Chấm riêng biệt lên bản mỏng IOịhI mỗi dung dịch trên Triển khai bản mỏng đến khi dung môi đi được khoảng 15cm, lấy bản mỏng ra hiện màu và quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng ban ngày Bất kỳ vết phụ nào ngoài vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng vói vết DHA không được đậm màu hơn vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), ngoài vết chính và vết tương ứng với DHA, trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được quá một vết có màu đậm hơn màu của vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2)

❖ Tiến hành sắc ký theo dõi phản ứng ester hóa:

- Dung dịch th ử : hỗn hợp phản ứng

-Dung dịch đối chiếu(l):chứa lmg artesunat chuẩn trong lml ethanol (TT)

- Dung dịch đối chiếu (2): chứa lmg DHA trong lml ethanol (TT)

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 1|J.1 mỗi dung dịch trên Khai triển dung môi, hiện màu Quan sát vết DHA và vết artesunat trên sắc ký đồ

2.1.3.3- Phương pháp định lượng artesunat trong sản phẩm thu được

♦♦♦ Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [22]

- Pha tĩnh : Cột Supelcosil LC18

- Pha động : acetonitril+ dung dịch đệm phosphat pH3 (50:50).

(pha dung dịch đệm phosphat pH3 : hòa tan l,36g KH2P 04 vào lOOOml nước cất, điều chỉnh pH đến 3,0 bằng acid H3PO4)

- Phát hiện : detector u v , ở bước sóng Ằ,=216nm

- Vòng nhận mẫu : 20jnl

- Tốc độ dòng: 2ml/phút

- Dung dịch mẫu chuẩn artesunat và dung dịch mẫu thử artesunat nồng độ

4mg/ml (pha loãng bằng acetonitril)

Tính hiệu suất phản ứng theo công thức sau:

st 1115 X WSp 1 M dha

Hiệu suất = - - - 100 (%)

sc mt M as W dha

Trong đó:

St - diện tích pic mẫu thử (mAU.s)

Sc- diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)

mt - lượng cân mẫu thử (g)

mc- lượng cân mẫu chuẩn (g)

X - hàm lượng artesunat của mẫu chuẩn

Wsp - khối lượng sản phẩm (g)

Wdha - khối lượng DHA (g)

Mas - khối lượng phân tử của artesunat

Mdha - khối lượng phân tử của DHA

❖ Định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại [1]

Cân 0,130g chế phẩm chuyển vào bình định mức lOOml, hòa tan bằng ethanol (TT), thêm đến vạch bằng cùng dung môi và lắc đều Lấy chính xác 5,0ml dung dịch trên chuyển vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch NaOH0,1N đến vạch Làm ấm trong nồi cách thủy ở 50± l°c trong 60 phút Làm nguội nhanh bằng nước lạnh Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được trong vòng 20 phút ở bước sóng 289±lnm trong cốc đo dày lcm và mẫu trắng là

dung dịch NaOH 0,1N

Song song tiến hành mẫu chuẩn Tính hàm lượng artesunat bằng cách

so sánh với mẫu chuẩn

Tính hiệu suất phản ứng theo công thức sau:

• w sp J Mpjị^

Hiệu suất = - - - 100 (%)

Dc mt M as W dha

Trong đó:

Dt - độ hấp thụ của mẫu thử

Dc- độ hấp thụ của mẫu chuẩn

mt - lượng cân mẫu thử (g)

mc- lượng cân mẫu chuẩn (g)

X - hàm lượng artesunat của mẫu chuẩn

Wsp - khối lượng sản phẩm (g)

WDHA - khối lượng DHA (g)

Mas - khối lượng phân tử của artesunat

Mdha - khối lượng phân tử của DHA

2.1.3.4-Xác định góc quay cực riêng của artesunat [1]

Nhiệt độ : 19,5-20,5°cDùng tia D của ánh sáng đèn natri phân cực (Ằ,= 589,3nm) Nồng độ artesunat: 4% trong chloroform

Tính góc quay cực riêng của artesunat theo công thức :

Trong đ ó :

a D20: góc quay cực riêng của artesunat

a : góc quay cực đo được của dung dịch

1 : chiều dài của ống đo (dm)

c : nồng độ phần trăm của artesunat trong dung dịch

2.2- KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT.

2.2.1- Khảo sát ảnh hưởng của một số xúc tác đối vối phản ứng bán tổng hợp artesunat

Các công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất ester từ DHA thưòng

sử dụng các amin bậc ba như pyridin, triethylamin, 4-DMAP hoặc hỗn hợp các xúc tác này T.s Đỗ Hữu Nghị đã tiến hành tổng hợp artesunat từ DHA và anhydrid succinic với xúc tác pyridin và hỗn hợp pyridin, 4-DMAP cho hiệu suất cao [8]

Trên cơ sở natri carbonat, natri bicarbonat là các tác nhân có tính kiềm yếu, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng xúc tác cho phản ứng ester hoá của các chất này và so sánh vói các xúc tác khác

❖ Thí nghiệm 1: (sử dụng xúc tác pyridin, 4-DMAP)

Cho vào bình cầu nút mài 2,0g (7,04mmol) DHA; l,0g (10,20mmol) anhydrid succinic; 10ml dung môi dichloromethan Thêm vào bình cầu lml pyridin (hoặc lml pyridin và 0,1 g 4-DMAP) Khuấy liên tục bằng máy khuấy

từ ở nhiệt độ phòng (22-24°C) Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng để xác định mức độ hình thành sản phẩm và thời điểm kết thúc phản ứng Khi vết DHA trên sắc ký đồ mất thì dừng phản ứng

Hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được xử lý và tinh chế như sau :

Loại bỏ pyridin và 4-DMAP bằng cách lắc hỗn hợp phản ứng với dung dịch HC1 5%(khoảng 10ml), điều chỉnh pH đến khoảng 3,0- 4,0 Gạn bỏ pha nước, lấy phần dung môi dichloromethan Rửa bằng nước cất (3 lần X 10ml) Làm khan bằng 2g Na2S04 Lọc loại Na2S04 Cất thu hồi dichloromethan bằng máy cất quay dưới áp suất giảm đến khi còn 1/5 thể tích Thêm 20ml n-hexan, vừa thêm vừa khuấy mạnh Để artesunat kết tinh trong 1 giờ Lọc lấy tinh thể

Tinh thể được kết tinh lại trong 20ml dung mồi A (hỗn hơp gồm n-hexan và aceton (4:1)) Để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Lọc, rửa tinh thể

bằng dung môi A Sấy tinh thể ở 45-50°C trong 4 giờ thu được sản phẩm.

❖ Thí nghiệm 2 : (sử dụng xúc tác NaHC03; Na2CƠ3)

Cho vào bình cầu nút mài 2,0g (7,04mmol) DHA; l,0g (10,20mmol) anhydrid succinic; lOml dung môi dichloromethan Khuấy và thêm vào bình cầu 0,4g (4,67mmol) NaHC03 hoặc 0,2g ( l,88mmol) Na2C 0 3 Khuấy liên tục bằng máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng liên tục trong 3 ngày bằng sắc ký lớp mỏng, 6 giờ sắc ký một lần

Khi sắc ký không còn vết DHA thì dừng phản ứng, xử lý và tinh chế như sau: Hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh pH bằng dung dịch acid acetic 99% đến khoảng 3,0-4,0 Gạn lấy phần dung môi Rửa bằng nước cất (3 lần X

lOml) Làm khan bằng Na2S04 Lọc loại Na2S04 Cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khi còn 1/5 thể tích Thêm n-hexan, vừa thêm vừa khuấy để kết tinh artesunat Lọc lấy tinh thể Sản phẩm thô được kết tinh lại trong 20ml

dung môi A Để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Lọc, rửa tinh thể bằng

dung môi A Sấy tinh thể ở 45-50°C trong 4 giờ thu được sản phẩm

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng thử tạp chất liên quan (mục 2.1.3.2) Định lượng artesunat có trong sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (mục 2.1.3.3), từ đó tính được hiệu suất của phản ứng

Với mỗi loại xúc tác làm 3 mẻ phản ứng, tính kết quả trung bình Kết quả

thu được ở bảng 2.1

Bảng2.1- Anh hưởng của các xúc tác khác nhau đến phản ứng

bán tổng hợp

DHA (g)

Anhydrid succinic (g)

Thời gian phản ứng (h)

SKLM hỗn hợp phản ứng

Điểm chảy

A S (V )

Hiệu suất(%)

Hiệu suất trung bình

- Sắc ký lớp mỏng cho thấy ngoài vết sản phẩm artesunat (Rf= 0,18) và vết DHA (Rf= 0,42) còn xuất hiện vết tạp chất có Rf= 0,64