I Chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng bán tổng hợp artesunat trong
ị một số dung môi có độ phân cực khác nhau.
Thí nghiệm 5 : (sử dụng xúc tác NaHC03)
Cho vào bình cầu nút mài 2,0g (7,04 mmol) DHA; l,0g ( 10,20 mmol) anhydrid succinic; 0,4g (4,76mmol) NaHC03 và 10ml các loại dung môi t dichloromethan, methanol, aceton, ethylacetat, diethylether và các hỗn hợp
I gồm aceton, dichloromethan tỷ lệ (5:5) ; (8:2). Khuấy liên tục ở nhiệt độ ■ phòng (22-24°C). Hỗn hợp lúc đầu đục sau trong dần. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thời điểm kết thúc phản ứng. Đối với những hỗn hợp phản ứng theo dõi đến 100 giờ mà vết DHA trên sắc ký lớp mỏng vẫn còn thì cũng dừng phản ứng.
- Với hỗn hợp phản ứng dung môi chỉ có aceton xử lý tương tự như thí nghiệm 4.
- Với các dung môi còn lại xử lý như với thí nghiệm 2. Kết quả được thể hiện ở bảng 2.4:
_ ọ
Bảng 2.4- Anh hưởng của các dung môi đến phản ứng
bán tổng hợp artesunat (xúc tác NaH C03). Dung môi DHA (g) Anhydrid succinic (g) NaHCOj (g) Thời gmn phản ứng (h) SKLM Hỗn hợp phản ứng Hiệu suất (%) Nhận xét SKLM Artesunat thu được
Dichloromethan 2,0 1,0 0,4 48 HếtDHA 93,3 Đạt tiêu
chuẩn
Aceton 2,0 1,0 0,4 96 Hết DHA 92,2 Đạt tiêu
chuẩn Aceton Dichloromethan (5:5) 2,0 1,0 0,4 48 Hết DHA 91,6 Vết phụ Đạt tiêu chuản Aceton Dichloromethan (8:2) 2,0 1,0 0,4 96 Hết DHA 90,8 Đạt tiêu chuán Diethỵlether 2,0 1,0 0,4 96 Còn nhiều DHA Thu hồi DHA Ethylacetat 2 ,0 1,0 0 ,4 9 6 Còn DHA Vếtphụ đậm Không đạt Methanol 2 ,0 1,0 0 ,4 9 6 Còn nhiều DHA Thu hổi DHA Nhận x é t :
Với xúc tác NaHC03, trong dung môi ethylacetat, diethylether, methanol, phản ứng bán tổng hợp artesunat xảy ra không triệt để, trên sắc ký đồ vẫn còn vết DHA không phản ứng hết.
Các phản ứng xảy ra trong dung môi dichloromethan, aceton tốt. Tiến hành thử tạp chất liên quan sản phẩm thu được và định lượng artesunat bằng phương pháp đo quang đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III. Hiệu suất của phản ứng là trên 90%. Như vậy có thể sử dụng các dung môi này để tổng hợp artesunat.
- Thời gian phản ứng trong dung môi aceton gấp đôi thời gian khi sử dụng dung môi dichloromethan.
So sánh về hình thức cảm quan, bột artesunat sản xuất trong dung môi aceton có thể chất mịn hơn so với bột sản xuất trong dung môi dichlromethan
Artesunat do chúng tôi tổng hợp được trong phản ứng sử dụng xúc tác NaHC03, dung môi aceton là bột màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy 134,7°c, góc quay cực riêng [a]D20= +12,8°c (C=4%trong chloroform). Các giá trị về phổ như sau : (Xem phụ lục 2)
IR (KBr) vmax(cm ‘) :
V C-H aliphatic (CH3,CH2) : 2925,6 V > c= 0(ester): 1759,6
ôsCH3: 1373,6 V -OH : 3279,8
ôas CH3: 1453,0 V -C-O- (vòng) :1151,8
V -O-O-(peroxyd): 874,4 ; 834,8
Dữ liệu phổ IR cho thấy cấu trúc của artesunat hoàn toàn phù hợp với phổ của artesunat chuẩn.
Thí nghiệm 6 : (sử dụng xúc tác Na2C 03).
Tiến hành làm tương tự như với thí nghiệm 5 nhưng thay xúc tác NaHC03 bằng 0,2g ( l,88mmol) Na2C 03. Kết quả thu được ở bảng 2.5:
Bảng 2.5- Ảnh hưởng của các dung môi đến phản ứng bán tổng hợp artesunat (xúc tác Na2COs). Dung môi DHA (g) Anhydrìd succinic (g) Na2C03 (8) Thời gian phản ứng(h) SKLM Hỗn hợp phản ứng Hiệu suất (%) Nhận xét SKLMAS thu được
Dỉchloromethan 2,0 1,0 0,2 48 Hết DHA 94,7 Đạt tiêu
chuẩn Aceton 2,0 1,0 0,2 96 Hết DHA 92,1 Vết phụ Đạt tiêu chuẩn Aceton Dỉchloromethan (5:5) 2,0 1,0 0,2 48 Hết DHA 91,7 Vết phụ Đạt tiêu chuẩn Aceton Dichloromethan (8:2) 2,0 1,0 0,2 96 Hết DHA 91,3 Đạt tiêu chuẩn Diethỵlether 2,0 1,0 0,2 96 Còn nhiều DHA Thu hồi DHA Ethylacetat 2,0 1,0 0,2 96 Còn DHA Vết phụ đậm Không đạt Methanol 2,0 1,0 0,2 96 Còn nhiều DHA Thu hồi DHA Nhận xét:
Với xũc tác Na2C 03, phản ứng bán tổng hợp cũng xảy ra rất tốt trong dung môi dichloromethan và dung môi aceton. Hiệu suất phản ứng cao trên
90%. Đạt tiêu chuẩn về tạp liên quan và hàm lượng .
Sử dụng dung môi dichloromethan thời gian phản ứng (48 giờ) chỉ bằng một nửa thời gian khi sử dụng dung môi aceton (96 giờ).
2.2.4- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng ester hoá ❖ Thí nghiệm 7 : (dung môi dichloromethan)
Cho vào bình cầu nút mài 2,0g (7,04mmol) DHA; l,0g (10,20mmol) anhydrid succinic; lOml dung môi dichloromethan. Khuấy và thêm vào bình cầu 0,4g (4,76mmol) NaHC03 hoặc 0,2g ( l,88mmol) Na2C 03. Khuấy liên tục bằng máy khuấy từ ở các nhiệt độ khác nhau. Với các phản ứng từ 34°c trở lên, lắp sinh hàn hồi lưu và đun cách thuỷ. Kiểm tra hỗn hợp phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Khi vết DHA trên sắc ký đồ mất, dừng phản ứng. Sau đó để nguội rồi tiến hành xử lý và tinh chế như ở thí nghiệm 2.
Kết quả được thể hiện ở bảng 2.6 :
Bảng2.6 -Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng ester hóa trong dung môi dichloromethan
TT Xúc tác DHA (g) Nhiệt độ (°C) Thời gian phản ứng (h) Nhận xét SKLM Hiệu suất (%) 1 NaHC03 2,0 22-24 48 Đạt 93,1 2 2,0 34-37 36 Đạt 93,2 3 2,0 46-50 30 Vết phụ 82,3 4 Na2C 03 2,0 22-24 48 Đạt 92,5 5 2,0 34-37 42 Đạt 94,4 6 2,0 4 6 -5 0 30 Vết phụ 85,0
Nhận xét:
- Khi tăng nhiệt độ thòi gian phản ứng giảm. Nhưng nếu tăng lên đến 46-50°
c phản ứng tạo ra nhiều tạp chất rất khó tinh chế, đồng thời hiệu suất phản ứng giảm.
❖ Thí nghiệm 8 : (dung môi aceton)
Tiến hành tương tự như thí nghiệm 7, thay dung môi dichloromethan bằng dung môi aceton, lượng xúc tác là 0,3g (3,57mmol) NaHC03 hoặc 0,2g ( l,88mmol) Na2C 03. Kết thúc phản ứng xử lý như ở thí nghiệm 4 với dung môi aceton.
Bảng2.7- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng ester hóa trong dung môi aceton
TT Xúc tác DHA (g) Nhiệt độ (°C) Thời gian phản ứng (h) Nhận xét SKLM Hiệu suất (%) 1 NaHC03 2,0 22-24 96 Đạt 92,5 2 2,0 34-37 64 Đạt 94,2 3 2,0 46-50 50 Vết phụ 89,3 4 Na2C 03 2,0 22-24 96 Đạt 91,5 5 2,0 34-37 60 Đạt 93,4 6 2,0 4 6 -5 0 48 Vết phụ 83,2 Nhận xét:
- Khi tăng nhiệt độ thời gian phản ứng giảm. Nhưng nếu tăng lên đến 46- 50° c phản ứng tạo ra nhiều tạp chất rất khó tinh chế.
Hiệu suất phản ứng ở 34-37°C cao nhất (93,4% với xúc tác Na2C 03; 94,2% với xúc tác NaHC03). Sản phẩm đạt tiêu chuẩn về thử tạp liên quan và hàm lượng theo dược điển Việt Nam III.
2.3- BÀN LUẬN
2.3.1- Cơ chế phản ứng bán tổng hợp Artesunat và ảnh hưởng của chất xúc tác
Phản ứng bán tổng hợp artesunat từ DHA và anhydrid succinic thực chất là phản ứng este hóa giữa alcol và acid carboxylic. Phản ứng theo cơ chế thế nucleophin lưỡng phân tử 2 giai đoạn SN2(CO):
tiến hành phản ứng ester hóa cần lựa chọn tác nhân acyl hóa, lựa chọn xúc tác cho thích hợp. Trong phản ứng bán tổng hợp artesunat DHA đóng vai trò tác nhân nucleophin.
Các phương pháp bán tổng hợp dẫn xuất ester của DHA trước đây cho DHA tác dụng với chlorid acid, anhydrid acid hoặc acid carboxylic tương ứng với sự có mặt của chất xúc tác là amin bậc 3: pyridin, triethylamin, 4-DMAP hoặc hỗn hợp các xúc tác này.
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn các chất vô cơ có tính chất kiềm NaHC03, Na2C 03 làm xúc tác cho phản ứng ester hoá thay cho các xúc tác hữu cơ. Trong môi trường kiềm, điện tích dương phần củanguyên tử carbon trong nhóm cabonỵl > c= 0 được tăng lên, giúp cho phản ứng ester hóa nhanh chóng đạt tới trạng thái cân bằng.
2.3.2- Ảnh hưởng của dung môi, tỷ lệ xúc tác, nhiệt độ và thời gian phảnứng ứng
❖ Tỷ lệ xúc tác :
Với tỷ lệ xúc tác thấp, phản ứng cho hiệu suất thấp do phản ứng xảy ra không hoàn toàn. Khi tỷ lệ xúc tác tăng dần hiệu suất cũng tặng theo. Nhưng
R - C - x + Y — ► n 0 0 ' f I m _ (1) R - C - X (2) R—c Y + X II o
nếu tiếp tục tăng lượng xúc tác, phản ứng sẽ tạo ra nhiều tạp chất. Nguyên nhân do NaHC03, Na2C 03 đồng thời xúc tác cho phản ứng thủy phân ester, nên khi tăng xúc tác đến một mức độ nhất định phản ứng sẽ xảy ra theo chiều ngược lại, artesunat thủy phântạo ra DHA. Mặt khác, khi tỷ lệ NaHC03, Na2C 03 cao sẽ tạo natri artesunat rất dễ bị phân hủy. Vì vậy lượng xúc tác sử dụng phải vừa đủ để phản ứng không tạo ra tạp chất và hiệu suất đạt được là cao nhất.
❖ Dung môi :
Với các xúc tác kiềm hữu cơ như : pyridin, triethylamin, 4- DMAP, các dung môi như cloroform, dichloromethan đã được sử dụng làm dung môi bán tổng hợp artesunat. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau với xúc tác kiềm vô cơ NaHC03, Na2C 03, nhận thấy sử dụng dung môi aceton và đichloromethan phản ứng xảy ra gần như hoàn toàn, kết thúc phản ứng DHA hầu như không còn trong hỗn hợp phản ứng. Với dung môi aceton thòi gian phản ứng kéo dài hơn dung môi dichloromethan nhưng hiệu suất artesunat thu được là không khác nhau mà chất lượng artesunat thu được trong dung môi aceton tốt hơn. Như vậy, dung môi aceton có thể thay thế cho dung môi dichloromethan độc hại.
❖ Nhiệt độ:
Tốc độ phản ứng được tính theo công thức: v = - ^ = k.[C]
dt
k là hằng số tốc độ phản ứng được tính theo phương trình Areniwuyt k= B.e-E/RT
Với:
/
B - hằng số với phẳnngẵ ở một điều kiện nhất định E - năng lượng hoạt hóa
R - hằng số khí T - nhiệt độ tuyệt đối
Phương trình trên cho thấy: nhiệt độ càng cao, tốc độ phản ứng càng lớn. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát phản ứng bán tổng hợp artesunat ở các nhiệt độ khác nhau. Khi nhiệt độ là 34- 37°c, phản ứng xảy ra nhanh hơn so vói ở nhiệt độ 22- 24°c. Nhưng khi tăng nhiệt độ lên 46-50°C, phản ứng tạo ra nhiều sản phẩm phụ. Có thể giải thích nguyên nhân là do DHA có cấu trúc vòng lactol và liên kết peroxid, rất dễ bị phá hủy khi gia nhiệt. Như vậy, ta chỉ có thể tăng nhiệt độ của phản ứng đến một mức độ nhất định để rút ngắn được thời gian phản ứng mà không làm phân hủy artesunat.
❖ Thòi gian phản ứng :
Khi sử dụng NaHCOs và Na2C 03 làm xúc tác cho phản ứng bán tổng hợp artesunat, thời gian phản ứng là yếu tố rất quan trọng. Nếu DHA đã tiêu thụ hết mà vẫn để phản ứng tiếp tục, artesunat sẽ thủy phân tạo DHA (phản ứng xảy ra theo chiều nghịch). Do đó cần phải giới hạn thời gian phản ứng. Điều này không xảy ra khi sử dụng xúc tác là các amin hữu cơ như pyridin, 4- DMAP.
2.3.3- Phổ hồng ngoại
DHA đưa vào phản ứng có các dữ liệu về phổ như sau: (xem phụ lục 4) IR (KBr) vmax(cm''):
V C-H aliphatic (CH3,CH2) : 2 9 6 2 ,4 ôs CH3:1376,4
ôasCH3:1445,3 V -OH : 3377,4
V -C-O- (vòng): 1157,2 V -O-O-(peroxyd): 876,7 ; 834,8
So sánh các dữ liệu phổ IR của nguyên liệu DHA và sản phẩm tạo thành artesunat, ta thấy artesunat vẫn giữ được cấu trúc của cầu peroxid, cấu trúc - C-O- (vòng). Cấu trúc DHA không có nhóm chức > c= 0 ester, còn artesunat có đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm > c= 0 ester.
PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1- KẾT LUẬN
1. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã tìm được hai chất xúc tác mới cho phản ứng bán tổng hợp Artesunat, đó là Natri bicarbonat và Natri carbonat. Đến nay, chưa có tài liệu nào trong nước nghiên cứu về hai loại xúc tác này. NaHC03, Na2C 03 dễ kiếm, rẻ tiền, có thể thay thế được cho xúc tác đắt tiền pyridin, 4-DMAP. Mặt khác, xúc tác pyridin, 4-DMAP là những chất độc, khi đưa vào sản xuất cần có thiết bị bảo vệ nên qui trình sản xuất phức tạp. Sử dụng xúc tác NaHC03, Na2C 03 vừa không độc mà vẫn đảm bảo được hiệu suất phản ứng.
2. Đã lựa chọn được dung môi dichloromethan, aceton phù hợp cho phản ứng bán tổng hợp Artesunat với xúc tác NaHC03, Na2C 03. Chúng tôi cũng đã khảo sát và tìm được tỷ lệ xúc tác so với lượng DHA thích hợp để sản phẩm artesunat có chất lượng tốt nhất. Kết quả khảo sát còn cho thấy nếu tiến hành phản ứng ở nhiệt độ cao thì có thể rút ngắn được thời gian phản ứng, nhưng nếu phản ứng ở nhiệt độ trên 45°c sẽ tạo ra nhiều tạp chất, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và giảm hiệu suất phản ứng.
3. Artesunat do chúng tôi tổng hợp đã được kiểm tra chất lượng về nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực, định tính bằng phổ hồng ngoại, thử tạp chất liên quan, hàm lượng. Các chỉ tiêu này đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III và Dược điển Quốc tế.
3.2- ĐỂ XUẤT
1. Tiến hành kiểm tra Artesunat do chúng tôi tổng hợp được về tất cả các chỉ tiêu có trong chuyên luận về nguyên liệu Artesunat của Dược điển Việt Nam III và Dược điển Quốc tế.
2. Cần tiếp tục nghiên cứu sản xuất Artesunat trên quy mô công nghiệp sử dụng NaHC03, Na2C 03làm xúc tác cho phản ứng tổng hợp Artesunat từ DHA và anhydrid succinic
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng V iệt:
1. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học Hà Nội.
2. Bùi Đại, Hoàng Tuấn(2002), Bệnh học truyền nhiễm, NXB Y học HN 3. Nguyễn Văn Hân(2003), Nghiên cứu bán tổng hợp một số dẫn xuất
fluoroalkyl ether của dihydroartemisinin, Luận văn thạc sỹ dược học, Đại học Dược Hà Nội.
4. Nguyễn Trần Giáng Hương(1997), Nghiên cứu độc tính của natri artesunat và ảnh hưởng của nó tới sự chuyển hoá qua gan của một số thuốc khác trên động vật thí nghiệm, Luận án tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội.
5. Hoàng Kim Huyền (1996), sử dụng thuốc trong điều trị sốt rét - tủ sách sau Đại học -Chuyên đề dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội. 6. Đỗ Tất Lợi (1999), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 640-
642.
7. Nguyễn Nghiêm Luật và cộng sự (1995), ảnh hưởng của sodium artesunat trên một số quá trình sinh học ở chuột nhắt trắng, Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Bộ, BộY tế.
8. Đỗ Hữu Nghị (1996).Nghiên cứu chiết xuất, bán tổng hợp và đưa vào sản xuất một số hợp chất tự nhiêncố tác dụng điều trị sốt rét từ nguồn dưọc liệu Việt Nam, Luận án phó tiến sỹ dược học,Trường đại học Dược Hà Nội. 9. Đỗ Hữu Nghị (2001), Giáo trình chiết xuất, Tài liệu sau đại học, Trường
đại học Dược Hà Nội.
10.Nguyễn Duy Sĩ và cộng sự(1994), “Tác dụng invitro trên p.falciparum của artesunat do công ty dược liệu Trung ương I sản xuất”, Tạp chí dược học,{ 2),tr.l4.
11. Nguyễn Đức Tào (1993), Cây thanh hao hoa vàng, chiết xuất và gieo trồng làm thuốc chữa sốt rét, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
12. Nguyễn Đức Tào và cộng sự (1994). “Những kết quả ban đầu đánh giá giá tác dụng dược lý và lâm sàng của artesunat do công ty Dược liệu trung ương I sản xuất”, Tạp chí Dược học, (2),tr.l 1.
13. Viện Dược liệu(2004).Cậy thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2,tr.820-825.
Tài liệu tiếng Anh :
14. China Cooperative Researsh Group on Qinghaosu and its derivatives as antimalarials (1982), ’’The chemistry and synthesis of qinghaosu derivatives”. J. Trad. Chin.Med.2(l),p.9-16.
15. Edlund P.O., Westerlund D., Carlqvist J., Wu B., Jin Y. (1984),’’Determination of artesunate and dihydroartemisinin in plasma by liquid chromatography with post column derivatization and UV- detection”, Acta.Pham.Suec.,21 (4),p.223-234.
16. Herman J.W., Charles B.L and Niesko p. (1990),’’Artemisia annua L.: a source of novel antimalarial drugs”, Pharm. Week.Sicen.,12(5),p.169-181.
17. Li Q.G. et al.(1998), “The pharmacokinetic and bioavailability of dihydroartemisinin, artemether, arteether, artesunic acid and artelinic acid in rat ”, J.pharm.Pharmacol, 50(6),p.l71-182
18. Li R, Liao.T.Y, Huang.K.Y, Chon L .(1982), ’’Pharmacokinetic study of sodium Quinghaosu hemisuccinate invivo”, Chun Tao Yao, 12, p.20-22 19. Mahidol University - Faculty of tropical Medicine (1993), “Clinical
pharmacology of artemisinin compounds”, Clinical pharmacology of antimalarials, p.263-295.
21. Vries P.J. et al.(1996), “Clinical pharmacology and therapeutic potential of artemisinin and its derivatives in the treatment of malaria”,