Nghiên cứu phương pháp tách cafein từ nguyên liệu trong nước (chè, cà phê) và tổng hợp một số dẫn chất của cafein

Sơ bộ thăm dò tác dụng sinh học các dẫn chất của cafein.... Ngoài ra lá chè, cà phê còn được sử dụng trong dân gian để làm thuốc kích thích, lọi tiểu, cầm ỉa chảy, chữa lỵ, chữa phù thũn

g I

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỂN

< I Ì P H I Í Í M Ì P H Á P T Á C H C A F E E S T Ừ

S G U T Ê S T L I Ệ U T R O N G X Ư Ớ C ( C H È , C À P H Ê )

V À T Ổ IV G H Ợ P M Ộ T S Ố d Ẩst c h ấ t c ủ a C A F E E V

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược s ĩ KHÓA 1998-2003

Người hướng dẫn : TS Giang Thị Sơn

TS Nguyễn Ngọc Anh Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa Hữu Cơ Thời gian thực hiện: Từ 3/2003- 5/2003

V2 ® ữ l

Hà Nội, s- 2003

Ẩiờĩ) @cÀM ƠQl ĩ

'C fa u ếa l/ưírưý Uêri ỉiùn n ỹ/d ên cửu líc /t ctổc, /í/lá n tỉiử ĩn ỹ c à ìtỹ wói ầ€ể

<fi/ảỷệ đ ã ìệÁiM ũ n Á của CMC lỉưỉ/iỷ cỗ ff ifio im cún Ậêy ìỉ/ỉiđìt 'Mền của f/ỉíửĩì f fý

ỹ ìm t ỸrM / đ iiv/ị

-'Vói lò n ỹ h ath f/ưwtỹ im Ậ iết ơn báu áắCy tô i x in c/ưzn MtwrJt cảm ớn

m (ỗừvnỹ Õ7ù ữhi-t, 3ĨP jVỹiMýễn tÂ/ỹỌc lỉđvtÂ

J\rAữriỹ rttyiMt tíiMty đ ã ừm ũ rd i íiư ớn ỹ dẫn tm ỹ iù rd i rtiù ều U ìời ỹ ia r t cAỈ /lỏCy

cứa đ ê ỉưiàn {/ỉừvrdi CÔMM (tàrtii tấ t

n ỹ ỉiiê ịt n à y.

9 ô i xm ỹ ử i ũ ỉi cảm (ỉn tá i lỉú ỉt/ 3ĨP c€m> lă n ỖT/tu ốể<9 m ón (€<mỹ n(ýhiêfi Qbươe; l/ư ìy 3ĨP %ô JV<jỊ>e &ĩưm pý/ừm ỹ /Á í n^/uêm tu iittj tam

ti fửĩn<j ẩw /w c Qtiổổc- £f€a t/Vồi; cừ nỹ toàvt ỉ/tê cúc t/ưỉiýy Cũ ỹlúũy /iỹ Mbuăt wiền

ỈAmtỹ ểBâ m ôn ydổa y{Ịữu <xĩ, âBo m ôn ^ ên ỹ nỹỉiiêýệ Q>€ềơò đ ã n ỉd ê t ũ/rtÁ ỹiú ỷi

ttừa <fìua.

y(a JVoi) nỹày 20 tíưínỹ 5 Mwm 2003

SPln/ỉi n iên

J\Tỹv(jễìi 3ĩu 37uỉ/yJi yíuyârt

đơ nà ùw điêu Ỉỉiêìi cỉto tô i /wà/H (Aà/ĩỉẢ ù $ <fìuá tứ n /i ỈẢtổc 'nỹẬtiỉmi

MỤC LỤC

ĐẶT VÂN ĐỂ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu về cây chè và cà phê 2

1.2 Cấu trúc hóa học, tính chất chung và tác dụng của cafein 9

1.2.1 Cấu tạ o 9

1.2.2 Tính chất vật l ý 9

1.2.3 Tính chất hóa h ọ c 9

1.2.4 Tác dụng sinh học của cafein 10

1.3 Nghiên cứu về cafein và dẫn chất 12

1.3.1 Tách cafein từ chè, cà phê 12

1.3.2 Tổng hợp dẫn chất của cafein 12

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 18

2.1.1 Nguyên liệu và dụng c ụ 18

2.1.2.Phương pháp thực nghiệm 19

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 20

2.2.1 Tách, chiết cafein 20

2.2.2 Tổng hợp dẫn chất của cafein 26

2.2.3 Xác định cấu trúc các chất 30

2.2.4 Sơ bộ thăm dò tác dụng sinh học các dẫn chất của cafein 33

2.3 Nhận xét và đánh giá kết quả 37

2.3.1 Tách, chiết cafein 37

2.3.2 Tổng hợp hoá học 37

2.3.3 Thăm dò tác dụng sinh học 37

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 38

PHỤ LỤC: 39

CHÚ GIẢI NHŨNG TỪVIÊT TẮT:

C H C I 3 : Cloroform

DMF : Dimethyl formamid MeOH : Methanol

ĐẶT VẤN ĐỂ

Chè, cà phê là loại nước uống được nhiều người ưa thích Ngoài ra lá chè,

cà phê còn được sử dụng trong dân gian để làm thuốc kích thích, lọi tiểu, cầm

ỉa chảy, chữa lỵ, chữa phù thũng, dùng riêng hoặc kết hợp với một số vị khác Cây chè được đánh giá là nguồn dược liệu quý không những có công năng bảo

vệ sức khỏe mà còn có tác dụng điều trị giúp con người chữa được nhiều loại bệnh [10,23]

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu chiết, tách và tổng hợp cafein sử dụng

ở dạng riêng hoặc kết hợp với các chất khác tạo các chế phẩm có tác dụng sinh học như: Optalidon, Coje Vì vậy hiện nay nhiều biệt dược trong thành phần có chứa cafein ra đời, góp phần làm cho sản phẩm thuốc ngày càng trở nên phong phú hơn [23,30,31,34]

Từ xa xưa loài người đã biết sử dụng cây cỏ, các chất vô cơ để phòng bệnh và chữa bệnh Nhưng khi xã hội loài người phát triển, có nhiều bệnh mới xuất hiện, bên cạnh đó còn có tình trạng các vi khuẩn kháng thuốc do đó thuốc sử dụng không còn tác dụng, nếu chúng ta chỉ sử dụng thuốc ở dạng thảo dược thì không đáp ứng được nhu cầu về phòng và chữa bệnh Vì vậy việc phát triển ngành hoá học chiết xuất và tổng hợp hữu cơ rất cần thiết và cần được quan tâm nhiều hơn, đó chính là nền tảng cho những thuốc bán tổng hợp và tổng hợp ra đời

Xuất phát từ nguồn nguyên liệu trong nước, những thông tin nghiên cứu

về cafein và để góp phần làm phong phú thêm các dẫn chất cũng như tác dụng sinh học của cafein, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu với mục tiêu:

> Tách cafein từ chè, cà phê bằng những phương pháp khác nhau

> Tổng hợp các dẫn xuất oxim, hydrazon, thiosemicarbazon của cafein và thăm dò tác dụng sinh học của chúng

1

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu về cây chè và cà phê

* Các nghiên cứu và ứng dụng của chè, cà phê [23]

Cây chè có tên khoa học là Calmelia sinensis o.ktze Nước hãm của lá chè là một loại thức uống phổ biến của hầu hết các dân tộc trên thế giới Người ta uống chè quanh năm, từ những vùng băng giá của Bắc cực đến vùng

có khí hậu khắc nghiệt như Châu Phi Người Trung Quốc đã từng đánh giá:

“Chè là một loại nước uống bổ dưỡng, có giá trị sinh học cao nhờ chữa được một số bệnh về tim mạch, về tiêu hóa, là loại thuốc lợi tiểu, phòng chống ung thư và chống nhiễm xạ”

Cây chè được phát triển mạnh từ thế kỷ 16, có nguồn gốc ở Bắc Ấn Độ và

nam Trung Quốc Hiện nay chè được trồng nhiều nước trên thế giới Việt Nam cũng là một trong những quê hương của cây chè, được trồng ở trên 30 tỉnh trong cả nước, cây chè và cà phê chủ yếu tập trung ở các tỉnh trung du và miền núi: Thái Nguyên, Vĩnh Phú, Hòa Bình, Hà Giang, Tây Nguyên, Lâm Đồng [5,8,19]

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã đưa ra tác dụng chữa bệnh phong phú của cây chè:

K.Lmai và Nakachi (Nhật Bản) ở trung tâm nghiên cứu ung thư Saitama

cho thấy số người thường xuyên sử dụng chè làm giảm tác dụng rõ rệt lượng lipid trong máu đặc biệt là chất cholesterol

Ông Sirving Keli thuộc viện nghiên cứu sức khỏe và môi trường Hà Lan

đã chứng minh uống chè thường xuyên sẽ giảm nguy cơ chứng viêm màng não

Giáo sư Hoffmane thuộc tổ chức Sức khỏe Hoa Kỳ đã chứng minh chè

có khả năng tiêu diệt mầm mông các khối u và phòng ngừa ung thư

2

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam đặc biệt là các chuyên gia của Viện Nghiên cứu chè Việt Nam đã nghiên cứu, đánh giá, phân tích các thành phần hóa học trong chè đưa ra kết luận tỷ lệ cafein: 2,5-4,5% chiếm tỷ lệ cao so với các alcaloid trong cây.

Cà phê cũng là một loại nguyên liệu có chứa cafein, có nguồn gốc ở vùng rừng núi Etiopi, ngày nay được trồng ở khắp nơi Trong đó Braxin, Columbia

là những nước cung cấp nhiều cà phê nhất Ở Việt Nam cà phê được trồng ở vùng đồi núi trung du của các tỉnh miền Trung và miền Bắc

Có nhiều loại cà phê khác nhau:

- Cà phê chè: Coffea arabica L.Rutaceae

- Cà phê mít: Coffea exsela chev Rutaceae

- Cà phê vối: Coffea robusta Rutaceae

Chè và cà phê là nguồn nguyên liệu cung cấp cafein chủ yếu, ngoài ra còn một số dược liệu chứa cafein: Kola (3% cafein), Cocoa (0,07-0,36%), Guarana (2,5-5% trung bình 3,5%)

> Nụ chè:

Cafein 2-2,5%, nước 10%, muối vô và các men

* Thành phần hóa học của cà phê [5,18].

> Hạt cà phê:

3

Hạt cà phê có nhiều hoạt chất trong đó cafein với tỷ lệ: 0,3-2,5% (hạt khô), ngoài ra còn có theophylin, theobromin, chất béo, protein, trionellin, đường và chất vô cơ

> Lá cà phê chứa khoảng 1,25% cafein, trung bình từ 0,8-1,8%

Lượng cafein thay đổi từ 0,96-2,85% tùy theo nguồn gốc, loài

* Các nghiên cứu về cafein

Cafein là một alcaloid có nhân purin được tìm thấy trong nhiều loài thực vật như chè, cà phê, ca cao, cuarana Là alcaloid chính trong các cây họ chè,

cà phê

1 Một số công trình trên thế giới:

■ Năm 1821, Pelletier và Caventou đã nghiên cứu và chiết xuất cafein [3]

■ Năm 1902, Bamber đã tìm ra trong lá chè có chứa một số chất: cafein, tanin, glucozid và qua phân tích đã xác định được tỷ lệ cafein (thein): 1,1-3,6% trong đó lá non chứa hàm lượng cafein cao hơn do có các men oxy hóa

■ Năm 1919, Cafein đã được tìm ra nhờ nghiên cứu của nhà khoa học Ruge

2 Một số công trình ở Việt nam.

ở Việt Nam cũng có nhiều công trình nghiên cứu về chiết suất và định lượng cafein bằng các phương pháp [23,25]

■ Sử dụng công nghệ C 02 để chiết cafein từ hạt cà phê

■ GS.TS Lê Doãn Diên và cộng sự nghiên cứu chiết suất và định lượng Cafein bằng các phương pháp khác nhau:

- Xác định cafein bằng phương pháp quang phổ

- Xác định hàm lượng cafein theo phương pháp Bertrand

- Chiết suất và định lượng cafein tổng số theo phương pháp G.V.Lauzurevski

■ Tác giả Nguyễn Kim cẩn và cộng sự định lượng cafein trong chè bằng phương pháp quang phổ tử ngoại [7]

4

■ Đặng Văn Hòa đã nghiên cứu xác định hàm lượng cafein bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp [15].

■ Ngoài các công trình trên, hiện nay vấn đề nghiên cứu ứng dụng và vai trò của cafein đối với đời sống con người đang là một vấn đề được quan tâm Fujiki cùng nhiều nhà khoa học Nhật Bản, các nhà khoa học Viện Hàn lâm Hoàng gia Anh đã công bố nước chè xanh ngăn chặn sự phát triển của các loại ung thư gan, dạ dày Do cafein và theobromin có trong chè xanh, chè khô đã kích thích tế bào cơ thể sinh sản ra interferon trong máu Chất này đã ức chế

sự phát triển và phân chia các tế bào ung thư

Một số công trình nghiên cứu tổng hợp cafein từ nhiều nguyên liệu khác nhau như [5,34]:

■ Trong công nghiệp Dược phẩm sử dụng nguyên liệu có nhân purin để điều chế cafein

■ Phương pháp Traube là phương pháp cổ điển sử dụng nguyên liệu là dẫn chất của urê và acid cyanacetic

o

+

CN COOH

NaOH

5

* ứng dụng của cafein và chè:

Từ ngàn năm nay, y học cổ truyền đã biết đến tác dụng của trà trong việc chữa bệnh Trà được dùng đơn giản như chế biến lá chè hay đóng gói dùng dần ngoài ra kết hợp với các vị khác cho các tác dụng chữa bệnh khác nhau

❖ Một số bài thuốc đông y sử dụng cây chè làm thuốc [10,22]

+ Công thức 1 (Chè dùng chế xiro Punch):

Chè 20g

6

Rượu Rhum (rượu cất từ mật mía)

Thiên môn lOg

Được dùng để phòng chống ung thư vú, ung thư phổi

Cafein từ lâu đã được sử dụng nhiều trong nghiên cứu, làm thuốc không chỉ ở dạng thảo dược mà rất nhiều ở dạng các biệt dược khác nhau

❖ Một số biệt dược sử dụng cafein làm thuốc (bảng 1.1) [30,31]

BẢNG 1 1 MỘT SỐ BIỆT D ư ợ c THÀNH PHAN CÓ CAFEIN

Dạngbàochế

Cafemol Paracetamol 500mg

Cafein 30mg

Cảm cúm, nhức đầu, đau răng, đau nhức bắp thịt, đau bụng kinh

Viênnén

Coje

Dikaliglycyrrhizinat91,lmg

Clopheniramin maleat

Phenylpropanolamin HC1 66,7mg

Cafein khan 138,9mg

Trị hắt hơi, chảy mũi, ho, ngạt mũi, nhức đầu liên quan đến viêm mũi cấp tính hoặc

Viênnén

dolor-NISIA

Aspirin 250mg Paracetamol 200mg Cafein 25 mg

Hạ nhiệt, giảm đau: đau đầu, đau răng, đau do cảm, cúm

Viênbaofilm

Cafein 25mg Điều trị triệu chứng đau.

ViênnénGynergene

Cafein

Ergotamin tartrat lmg Cafein 25mg

Điều trị đau nửa đầu, và có liên quan đến đau đầu

Viênbaođường

1.2 Cấu trúc hóa học, tính chất chung và tác dụng của cafein

1.2.1 Cấu tạo [3,19,26]

Tên khoa học của cafein: 1,3,7- trimethyl-3,7- dihydro-lH purin - 2,6- dion hoặc 1,3,7- trimethylxanthin Ngoài ra có tên khác: guorin, theinum Công thức cấu tạo:

o

CH31,3,7- trimethylxanthin

1.2.2 Tính chất yật lý [1,3,5,33]

Cafein ở dưới dạng tinh thể hình kim trắng mịn hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng, vụn nát ngoài không khí khô Đun nóng ở 100°c cafein sẽ

mất nước và thăng hoa ở khoảng 200°c Nóng chảy ở 234°C-239°C Dung dịch

cafein có phản ứng trung tính với giấy quỳ Chế phẩm ít tan trong nước lạnh (1:80), dễ tan trong nước sôi (1:2), cloroform Khó tan trong ethanol, tan trong các dung dịch acid và trong các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm ít tan trong benzen

1.2.3 Tính chất hóa học [5]

+ Cafein có tính kiềm yếu do có nguyên tử N ở vị trí 9 Chỉ tạo muối với

các acid mạnh và các muối này không bền dễ phân ly

+ Do cafein có nhân purin nên cho phản ứng murexit:

Đun nóng các chế phẩm với chất oxh như H20 2, H N O 3 , nước brom Sau

đó cho tác dụng với dung dịch NH3 tạo sản phẩm màu đỏ tía, do tạo thành muối amoni của acid purpuric) Màu đỏ tía mất khi thêm một vài giọt dung dịch natri hydroxyd

muối amoni của acid

+ Không tạo tủa với TT Mayer

+ Dung dịch cafein cho kết tủa với dung dịch tanin nhưng tủa tan trong thuốc thử quá thừa

1.2.4 Tác dụng sinh học của cafein [4,10,12]

Theo nhiều tài liệu cho thấy cafein có tác dụng sinh học phong phú Sau đây là tác dụng của cafein đối với một số cơ quan của cơ thể

* Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương:

Cafein tác dụng kích thích thần kinh trung ương, kích thích chọn lọc trên

vỏ não, tăng nhận cảm giác quan, tăng khả năng làm việc trí óc, giảm mệt mỏi

và buồn ngủ

* Trên tim mạch:

Tác dụng phức tạp theo cá thể, liều Dùng cafein sẽ kích thích tim, làm tăng lưu lượng máu qua tim, tăng nhịp tim, tăng sức co bóp cơ tim, tăng cunglượng tim và cung lượng mạch vành Trên huyết áp ít thay đổi ở người bình

thường: cafein có khi làm chậm nhịp do phản xạ trung tâm phế vị phụ thuộc vào từng cá thể.

* Trên hô hấp:

Kích thích hô hấp, làm giãn phế quản, giãn động mạch phổi, tăng không khí phổi do tăng tần số, biên độ hô hấp

* Trên tiẽt niệu:

Có tác dụng lợi tiểu do tăng khối lượng máu, giãn mạch, tim tăng co bóp, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp thu

* Trên cơ trơn:

Giảm trương lực cơ trơn, tác dụng rõ khi cơ trơn co thắt, giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, giãn cơ trơn phế quản, cơ trơn đường tiêu hóa

Chế phẩm được dùng làm thuốc hồi sức cấp cứu, chống mệt mỏi, giảm chứng ngủ gà

* Tác dụng lợi tiểu:

Cafein làm tăng sức lọc cầu thận vì vậy có tác dụng lợi tiểu nhưng tác dụng này kém theophylin và theobromin

* Cafein gây tăng phản xạ có điều kiện:

Bình thường cafein ít ảnh hưởng đến hành não khi ức chế có tác dụng kích thích trung tâm hô hấp và vận mạch

* Trên tiêu hóa điều trị tiêu chảy:

Được kết hợp với các thuốc khác để làm tăng tác dụng giảm đau

Chữa Trụy tim, suy tim trái cấp, phù phổi cấp, phù ngoại vi, kích thích hô hấp khi bị ức chế, dùng làm thuốc giảm đau, chữa suy nhược dây thần kinh, đau dây thần kinh, ngoài ra cafein đã từng được sử dụng làm thuốc mê.

hoa ở nhiệt độ 180-200°c để tách ra khỏi dược liệu và những chất không có

1.3.1.3 Phương pháp chiết Soxlet:

Dựa vào khả năng hoà tan các chất và hồi lưu liên tục của dung môi để chiết các chất ra khỏi dược liệu

1.3.2 Tổng hợp dẫn chất của cafein

Công thức cấu tạo của cafein có nhóm carbonyl nên có khả năng cho phản ứng cộng hợp ái nhân với tác nhân ái nhân như: H2N-B

1 3 2 1 C ơ c h ê p h ả n ứ n g

Nhanhw\ _n h_b h2Q C = N -B

OHThực chất đây là phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl tạo ra sản phẩm trung gian rất không bền và bị tách nước ngay thành sản phẩm ngưng tụ

Đây là phản ứng thuận nghịch, cân bằng và tốc độ phản ứng phụ thuộc vào pH môi trường Bước cộng hợp trong môi trường trung tính hoặc base đều xảy ra nhanh và bước dehydrat hóa là bước quyết định tốc độ phản ứng Bước dehydrat hóa luôn được xúc tác bởi acid nên thêm acid sẽ làm tăng nhanh tốc

Nếu các gốc R, R’ có gắn thêm những nhóm có hiệu ứng cảm ứng -I, sẽ làm tăng khả năng phản ứng của nhóm carbonyl (các halogen, N 0 2) Ngược lại nếu các gốc R, R có gắn thêm nhóm đẩy electron như CH3-, CH3CH2-, chúng có hiệu ứng +1 thì sẽ làm giảm khả năng phản ứng của nhóm carbonyl

Nếu gốc -B gây hiệu ứng hút điện tử (-1, -M) sẽ làm giảm khả năng tham gia phản ứng Ví dụ gốc -B có chứa ;-Br, Cl, -N 02, -COOH

Phản ứng tổng hợp oxim, hydrazon, imin thường sử dụng xúc tác là acid

Có thể dùng acid hữu cơ như acid acetic đặc hoặc dùng acid vô cơ như HC1,

H2S04 Tuy nhiên phản ứng cũng có thể xảy ra ở môi trường trung tính hoặc môi trường kiềm

Đối với trường hợp dùng xúc tác là acid thì lượng acid dùng làm xúc tác

sẽ ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng Acid với vai trò là xúc tác sẽ làm tăng nhanh quá trình proton hóa và cộng hợp sẽ xảy ra nhanh hơn

Tuy nhiên phản ứng sẽ thuận lợi ở một pH nhất định pH này thường gần

với trị số pKa của mỗi cặp carbonyl- tác nhân ái nhân

Ở đó nồng độ [H2N-B].[ > c= 0] là cực đại do đó tốc độ phản ứng là lớnnhất

Có thể biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào pH như sau:

(a): nồng độ ceton được proton hóa theo pH

(b): nồng độ amin dạng tự do theo pH

* Yếu tố dung m ô i:

Dung môi thường dùng là alcol ethylic tuyệt đối, methanol Dung môi, ngoài mục đích là hòa tan các chất tham gia phản ứng còn dùng với mục đích làm tăng hay giảm tính phân cực của liên kết (>c=0 ) để làm tăng nhanh tốc

độ phản ứng Với ethanol và methanol có tác dụng tăng độ phân cực của chất tham gia phản ứng

♦ Các yếu tô'khác:

Ngoài các yếu tố trên ra còn một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng tới tốc

độ, hiệu suất phản ứng như:

♦ Gốc R, R càng cồng kềnh thì phản ứng càng khó xảy ra

♦Tỷ lệ chất tham gia phản ứng:

Đây là phản ứng đồng mol giữa hợp chất có nhóm carbonyl và [H2N-B] nếu cho dư một chất nào đó với số lượng quá mức cho phép sẽ gây ra các sản phẩm phụ làm cho quá trình tinh chế khó khăn thậm chí giảm hiệu suất

♦ Nhiệt độ phản ứng và thời gian phản ứng:

- Nhiệt độ tăng làm tốc độ phản ứng tăng, tuy nhiên chỉ nên duy trì nhiệt

độ phản ứng ở mức độ phù hợp vì ở nhiệt độ cao có thể gây phân hủy sản phẩm

- Thời gian phản ứng nên chọn thời gian phù hợp làm sao cho phản ứng gần như hoàn toàn mà không bị phân hủy sản phẩm

Các công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của các dẫn chất oxim và hydrazon mà chúng tôi tham khảo được cho thấy dẫn chất hyrazon có hoạt tính sinh học rất đa dạng Trong đó có một số tác dụng chủ yếu sau:

a.Tác dụng kháng khuẩn

Đây là tác dụng quan trọng của các hợp chất hydrazon Tác dụng này gặp

ở nhiều dẫn chất khác nhau, Nhưng đáng chú ý nhất là tác dụng của dẫn chất 5-nitrofurfural có công thức chung

0 2N ° ^ C H = N - R

Năm 1999, Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Đặng Thị Kim Huệ

đã tổng hợp dẫn chất furfural với các hydrazin để tạo ra các hydrazon và thử tác dụng sinh học và cho biết chúng có tác dụng kháng khuẩn mạnh [13]

b Tác dụng chống phân bào

Trong quá trình nghiên cứu tìm thuốc chống ung thư, các khoa học thấy một dẫn chất có cấu trúc hydrazon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư Ví dụ:

Năm 2000 Trần Vũ Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Thị Vân, Lê Thị Tập

đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogeno isatin đã cho kết quả là cả 2 dẫn chất này đều có tác dụng ức chế mạnh đối với vi khuẩn lao

d Các tác dụng khác:

Ngoài tác dụng chính kể trên, một số hydrazon còn có tác dụng chống viêm, chống virus, chống kí sinh trùng

> Máy khuấy từ có bộ phận nhiệt.

> Sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng silicagel 60 F250(Merck)

> Đèn soi tử ngoại Vilber lour

> Cân điện

> Phổ tử ngoại ghi trên máy Cary IE UV-Visible Spectrophometer Varian

> Phổ hồng ngoại ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr trong vùng 4000 - 500cm'1.

> Điểm nóng chảy xác định trên máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp

• Phương pháp thăng hoa

• Phương pháp dùng dung môi nước

• Phương pháp Shoxlet

Các chất thăng hoa có khả năng chuyển từ thể rắn sang thể hơi không

qua giai đoạn chảy lỏng ở nhiệt độ nhất định và khi hạ nhiệt độ xuống thấp

các chất này trô lại trạng thái rắn Dựa vào tính chất cafein có khả năng thăng hoa ở nhiệt độ 180-200°c để tách ra khỏi dược liệu và những chất không có tính chất này

* Tiến hành:

Trong một bát sứ cho khoảng 5g búp chè, khô tán nhỏ ở dạng bột Đậy một phễu thủy tinh có tua giấy bên trong Đun cách cát bằng ngọn lửa đèn cồn hay máy jenway 100 Đun nóng đến khi thấy xuất hiện khói mờ trên phễu Để nguội thấy xuất hiện các tinh thể hình kim óng ánh bám trên tua giấy Hiệu suất: 3%

20

2.2.I.2 Phương pháp tách, chiết cafein bằng dung môi hữu cơ

*Nguyên tắc:

Dùng nước sôi chiết suất các hợp chất hòa tan trong đó có cafein Sau đó tách riêng cafein bằng cloroform Cất loại dung môi cloroform Cân các tinh thể còn lại trong bình từ đó tính được hàm lượng cafein có trong mẫu nghiên cứu

*Tiến hành:

Cân chính xác 30g bột lá chè khô đã nghiền nhỏ cho vào bình nón thể tích 250 ml Cho thêm 5ml magie oxit và 150ml nước cất Đun sôi khoảng 15 phút, sau đó lọc dung dịch qua bông, bã còn lại tiếp tục được chiết khoảng 3-4 lần nữa cho đến khi thấy dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử Dragendof Dồn toàn bộ dịch lọc vào một bình nón khác và thêm từ từ từng giọt H2S04 loãng cho đến khi thấy chuyển sang môi trường acid Cô cạn dịch lọc trên nồi cách thủy đến khi còn 1/3 thể tích ban đầu thì lọc qua giấy lọc Cho vào bình gạn và chiết 5 lần bằng chloroform mỗi lần 150ml, trước mỗi lần chiết cho vào 5 ml kiềm loãng (NaOH 10% or dung dịch NH3 loãng), lắc đều trong 30 phút, sau đó rửa cloroform bằng nước cất thu lấy dịch chiết cloroform cho vào bình và thu hồi dung môi bằng hệ thống ống sinh hàn Dùng 20ml nước nóng để tinh chế cafein, loại nước và để khô trong không khí Thu được tinh thể cafein trắng bông Sau đó sấy trong tủ sấy chân không

ở 60°c trong thời gian 6 giờ

Hàm lượng cafein được tính như sau:

H = 1 x i o o %

mTrong đó:

H : Hàm lượng cafein tính theo dược liệu khô (%)

m2 : Trọng lượng bình và tủa cafein sau khi loại dung môi

ĩĩìị : Trọng lượng bình lúc đầu.

m : Số g chè khô dùng để nghiên cứu.

2.2.I.3 Phương pháp chiết Soxlet

* Tiến hành:

Cân lOOg búp chè khô tán nhỏ cho vào dụng cụ chiết Shoxlet, 400ml ethanol được đưa vào bình chiết qua dược liệu, chiết xuất liên tục 3 giờ Dịch chiết chuyển sang một cốc thuỷ tinh có chứa 50g MgO trong 300ml H20 , có khuấy liên tục và tất cả được làm bay hơi trên nồi cách thủy đến khô cắn đun sồi một lần với 500ml H20 và 2 lần với 250ml H20 , lọc nóng qua phễu Buchner Thêm 50ml H2S04 10% vào dịch lọc, sau đó cô còn khoảng 1/3 thể tích ban đầu Lọc nóng loại bớt tạp sau đó chiết suất với 30ml cloroform, lặp lại 5 lần Dung dịch cloroform màu vàng nhạt đem lắc với 10ml NaOH 1%, tiếp theo vói 30ml nước, loại bỏ phần nước Thu hồi cloroform, cắn cafein thô được kết tinh lại với 10ml H20 nóng Thu được các tinh thể hình kim trắng có điểm chảy 235°c

* Kết quả: mj=15,31g

m2=17,96g m2- ni|=2,65g

Hiệu suất: H = ^ ^ X 1 0 0 % = X 1 0 0 = 2 , 6 5 %

H : Hàm lượng cafein tính theo dược liệu khô (%)

m2: Trọng lượng bình và tủa cafein sau khi loại dung môi

rrij: Trọng lượng bình lúc đầu

m : Số g chè khô dùng để nghiên cứu

100: Tính ra %

* Cũng sử dụng tách, chiết cafein từ bột hạt cà phê như các phương pháp như với tách cafein trong chè: Thăng hoa, sử dụng dung môi hữu cơ, phương pháp chiết Shoxlet:

* Kết quả:

Phương pháp thăng hoa:

^càphê ~*ỗ

m c afein = 0,06gHiệu suất = 1,2%

Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ:

m càphẻ- 30g

m ca fe in = 0>29g Hiệu suất= 0,97%

Phương pháp chiết Shoxlet:

mcàphê= 1 0 0g

Hiệu suất =1%

23

Theo tài liệu nhiệt độ nóng chảy của cafein: 235-239°C

b Tạo kết tủa với dung dịch iod-ỉodid trong môi trường acid

Cho 0,05ml dung dịch iod-iodid (TT) vào 2ml dung dịch bão hoà cafein, dung dịch vẫn trong Thêm 0,1 ml dung dịch HC1 (loãng) có tủa nâu xuất hiện, tủa này tan khi trung hoà bằng dung dịch NaOH 2M

c Phản ứng của nhóm xanthin:

Trộn 2-3g chế phẩm với 0,1ml hydroxygen peroxyd (TT) và 0,3ml dung dịch HC1 2M (TT) đun nóng nhẹ trên nồi cách thuỷ tới khô, sẽ có cắn màu đỏ hơi vàng, thêm 0,1 ml dung dịch NH3 2M (TT) màu của cắn sẽ chuyển sang tím đỏ

d Mất khối lượng do làm khô: không quá 0,5% (đối với cafein khan)

(l,000g; 100-105°C; 1 giờ) có nghĩa là: lg mẫu thử đem sấy trong tủ sấy ở áp xuất thường trong thời gian lgiờ, khối lượng không giảm quá 5mg