Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất nhằm tăng độ tan của curcumin bằng phương pháp alyl hóa

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN ĐÌNH KHÁNH Mã sinh viên: 1101266 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT NHẰM TĂNG ĐỘ TAN CỦA CURCUMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ALKYL HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGH

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN ĐÌNH KHÁNH

Mã sinh viên: 1101266

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT NHẰM TĂNG ĐỘ TAN CỦA CURCUMIN BẰNG PHƯƠNG

PHÁP ALKYL HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN ĐÌNH KHÁNH

Mã sinh viên: 1101266

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT NHẰM TĂNG ĐỘ TAN CỦA CURCUMIN BẰNG PHƯƠNG

PHÁP ALKYL HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước hết cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS Phạm Thị Hiền và Ds Nguyễn Thị Hải Quỳnh - người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang và CN Phan Tiến Thành cùng các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Công Nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Bộ môn

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn luôn bên cạnh và động viên em trong cuộc sống cũng như trong học tập

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Trần Đình Khánh

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 3

1.1.1 Cấu trúc hóa học 3

1.1.2 Tính chất lý hóa 3

1.1.3 Độ ổn định 6

1.1.4 Tác dụng sinh học của curcumin 9

1.2 TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CÁC DƯỢC CHẤT MỚI THÔNG QUA VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN 12

1.3 CÁC PHẢN ỨNG ALKYL HÓA CURCUMIN 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT 18

2.2 DỤNG CỤ - THIẾT BỊ 18

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.4.1 Tổng hợp hóa học và tinh chế các sản phẩm 20

2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 21

2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 21

2.4.4 Xác định độ tan 22

2.4.5 Thử hoạt tính sinh học 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 25

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất 4,4-dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin (KT-1) 25

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất

4,4-bis(carboxymethyl)-O,O’-bis(carboxymethyl)-curcumin (KT-2) 26

3.1.3 Tổng hợp tetra natri 4,4-bis(carboxylatomethyl)-O,O’-bis(carboxylatomethyl)-curcumin (KT-3) 27

3.1.4 Tổng hợp dẫn chất (2-hydroxylethyl)-curcumin (KT-4) 27

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 29

3.2.1 Xác định cấu trúc sản phẩm KT-2 29

3.2.2 Xác định cấu trúc sản phẩm KT-3 32

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TAN 35

3.4 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 35

3.4.1 Tiến hành 36

3.4.2 Kết quả thực nghiệm 36

3.5 BÀN LUẬN 38

3.5.1 Về tổng hợp hóa học 38

3.5.2 Về xác định cấu trúc 39

3.5.3 Về độ tan và hoạt tính sinh học 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

(13C - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

AR Tinh khiết phân tích (Analytical reagent)

H pylori Helicobacter pylori

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High-performance liquid chromatography)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS Phổ khối lượng phân tử (Mass spectrometry)

Rf Hệ số lưu giữ (Retension factor)

SKLM Sắc kí lớp mỏng

KT-1

4,4-dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin KT-2 4,4-bis(carboxymethyl)-O,O’-bis(carboxymethyl)-curcumin

KT-3 4,4-bis(carboxylatomethyl)-O,O’-bis(carboxylatomethyl)-curcumin

KT-4 (2-hydroxylethyl)-curcumin

nc Nhiệt độ nóng chảy

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Danh mục các nguyên liệu – hóa chất 18

Bảng 2 2 Danh mục các dụng cụ thiết bị 19

Bảng 3 1 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của KT-2 30

Bảng 3 2 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của KT-2 31

Bảng 3 3 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) của KT-2 31

Bảng 3 4 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) của KT-2 32

Bảng 3 5 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của KT-3 33

Bảng 3 6 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của KT-3 33

Bảng 3 7 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR (500 MHz, D 2 O) của KT-3 34

Bảng 3 8 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR (125 MHz, D 2 O) của KT-3 34

Bảng 3 9 Kết quả xác định độ tan 35

Bảng 3 10 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của KT-4 ở các nồng độ 10, 50, 100 µg/mL 36

Bảng 3 11 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của KT-2 ở các nồng độ 10, 50, 100, 150 µg/mL 37

Bảng 3 12 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của KT-3 ở các nồng độ 10, 50, 100, 150 µg/mL 37

Bảng 3 13 Tóm tắt kết quả xác định độ tan, logP và hoạt tính kháng khuẩn 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của curcumin 3

Hình 1 2 Phản ứng của curcumin với gốc tự do 4

Hình 1 3 Dạng hỗ biến ceto-enol trong dung dịch 5

Hình 1 4 Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin 5

Hình 1 5 Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin 6

Hình 1 6 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 7

Hình 1 7 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm 8

Hình 1 8 Sự phân hủy curcumin dưới tác dụng của ánh sáng 8

Hình 1 9 Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin – sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylen (D), tạo phức hợp kim loại – curcumin (E) 12

Hình 1 10 Một số hợp chất bán tổng hợp từ curcumin 14

Hình 2 1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-hydroxyethyl, methoxycarbonylmethyl và ethoxycarbonylmethyl của curcumin 20

Hình 2 2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất carboxymethyl curcumin và muối natri 21

Hình 3 1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-1 25

Hình 3 2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-2 26

Hình 3 3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-3 27

Hình 3 4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-4 với tác nhân 2-cloroethanol 28

Hình 3 5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-4 với tác nhân 2–bromoethanol 29

về hoạt tính sinh học và dược học của củ nghệ cũng như các thành phần chiết xuất từ

củ nghệ, trong đó curcuminoid (chủ yếu là curcumin (77%), và demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin) là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ Hoạt tính sinh học của curcumin rất đa dạng: chống oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đường, ức chế phát triển khối u…[3] Cơ sở thuyết phục và cốt lõi nhất để tiếp tục sử dụng curcumin trong điều trị là tính an toàn gần như tuyết đối của nó Ngày nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào ở trên cả động vật và con người chỉ ra bất kỳ độc tính nào liên quan tới việc sử dụng curcumin, kể cả khi sử dụng với liều rất cao 8g/kg thể trọng [14] Curcumin hiện đang được sử dụng trong hơn 100 nghiên cứu lâm sàng để điều trị nhiều bệnh khác nhau như: ung thư phổi, trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, vảy nến,…[43]

Tuy nhiên, cho đến nay curcumin vẫn chưa có mặt một cách độc lập trong danh mục dược chất chính thức của y học hiện đại Điều này được lý giải bởi đặc tính sinh khả dụng rất thấp của curcumin do hấp thu kém, chuyển hóa và đào thải nhanh ra khỏi cơ thể Một trong các yếu tố hóa - lý quan trọng ảnh hưởng đến điều này là do khả năng kém tan trong nước của curcumin [21,32,35] Do đó hiện nay có nhiều hướng tiếp cận khác nhau đã được tiến hành để tăng sinh khả dụng của hợp chất

curcumin, người ta đi theo hướng cải thiện độ tan và kéo dài thời gian chuyển hóa của curcumin trong cơ thể Một trong các con đường đã được tiến hành đó là đưa curcumin vào các hệ thống phân phối thuốc như liposome, micell, polisaccharid, tạo phức hợp phospholipid và các tiểu phân nano…[33] Tuy nhiên phương pháp này vẫn

có một số hạn chế như không cải thiện được độ ổn định của curcumin trong môi trường kiềm, dễ bị phân hủy bởi ánh sáng Một cách tiếp cận khác là dùng phương pháp hóa học để cải thiện tính tan của curcumin - tạo dẫn chất có khung curcumin và nhóm thân nước bằng cách gắn các nhóm thân nước vào khung curcumin như: lai hóa curcumin với acid amin, với các phân tử đường, alkyl hoặc acyl hóa [33] Các phương pháp biến đổi hóa học này không chỉ tăng độ tan, cải thiện độ ổn định của curcumin mà còn có thể tạo ra hợp chất có dược tính mới, nhiều trường hợp độc tính giảm

Từ thực tế nói trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất nhằm tăng độ tan của curcumin bằng phương pháp alkyl hóa” với 2 mục tiêu chính:

1 Tổng hợp một số dẫn chất có độ tan trong nước tốt hơn curcumin

2 Thử hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

Curcumin (diferuloylmethan), một polyphenol, là một hoạt chất chính của cây

củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) chiếm tới 77% trong hỗn hợp curcuminoid

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của curcumin

 Tên khoa học: 3,5-dion

(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyl-3-methoxylphenyl)hepta-1,6-dien- Tên khác: Diferuloymethan, curcumin I

 Công thức phân tử: C21H20O6

 Khối lượng phân tử: 368,37 đvC [30]

1.1.2 Tính chất lý hóa

1.1.2.1 Tính chất vật lý

 Dạng thù hình: Curcumin tồn tại dưới dạng bột vô định hình hoặc tinh thể

hình kim màu vàng cam [30]

 Nhiệt độ nóng chảy: 183°C [30]

 Độ tan: Curcumin thực tế không tan trong nước ở pH acid và trung tính (<0,1

μg/mL [46]), tan được trong kiềm Curcumin hòa tan được trong nước khi có mặt các chất hoạt động bề mặt như: natri dodecylsulfat, cetylpyridin bromid, gelatin, polysaccharid, polyethylenglycol, cyclodextrin [25] Curcumin tan được trong acid acetic, ethanol (20 mg/mL), methanol, aceton (1 mg/mL), dimethylsulfoxid,

dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, ít tan trong n-hexan, không tan trong ether

[1,35]

 pK a và hệ số phân bố: Curcumin có 3 giá trị pKa khác nhau, trong đó giá trị

thứ nhất và thứ hai là từ 2 nhóm –OH phenol và giá trị thứ ba là từ proton enol Hệ

số phân bố octanol : nước của curcumin là 3,29 [39,40]

 Sự hấp thụ ánh sáng: Curcumin có khả năng hấp thụ bức xạ khả kiến, tạo ra

màu vàng Các cực đại hấp thụ ở trong các dung môi khác nhau dao động ở bước sóng từ 408 nm (carbon tetraclorid) đến 430 nm (DMSO) [26,28] Chúng có khả năng phát huỳnh quang (504 nm) khi bị kích thích bởi bước sóng 424 nm trong aceton [29] 1.1.2.2 Tính chất hóa học

 Tính chất của nhóm hydroxyl trên vòng benzen

Các cặp electron chưa liên kết của oxy trong nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng benzen làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl linh động hơn, điều này giải thích tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin

Ngoài ra khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin còn liên quan đến

sự chuyển nguyên tử hydro của nhóm methylen ở carbon giữa mạch, làm giảm hoạt tính của nhóm này Hai hướng phản ứng này góp phần giải thích tính oxy hóa mạnh

của curcuminoid khi ứng dụng nó trong ngành dược [37] (hình1.2)

Hình 1 2 Phản ứng của curcumin với gốc tự do

 Hiện tượng hỗ biến:

Curcumin và dẫn chất tồn tại trong dung dịch ở dạng cân bằng hỗ biến của dạng diceton đối xứng và dạng ceto-enol được ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử

(hình 1.3) [25]

Hình 1 3 Dạng hỗ biến ceto-enol trong dung dịch

Trong dung dịch nước, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dưới dạng diceton; ngược lại, ở pH >8, dạng enol chiếm ưu thế hơn [36] Tùy theo từng dung môi thích hợp có thể có trên 90% curcumin tồn tại dạng enol [25]

 Ngoài ra curcumin còn thể hiện các phản ứng:

MeO HO

OMe OH

MeO HO

OMe OH

Hình 1 5 Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin

- Phản ứng tạo phức

Curcumin có khả năng cho đi một hay nhiều cặp electron tự do trên các nguyên

tử oxy của cấu trúc ceton – enol, do vậy curcumin có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại khác nhau: Mn2+, Fe2+, Cu2+… Phức của kim loại và curcumin có nhiều màu sắc khác nhau [6]

1.1.3 Độ ổn định

 Ảnh hưởng của pH trong dung dịch nước

Nghiên cứu sự điện li theo pH của curcumin bằng phương pháp HPLC cho kết

quả như sau (xem hình 1.6)

pH < 1: Dung dịch curcumin có màu đỏ do curcumin ở trạng thái proton hóa

H4A+

pH = 1-7: Curcumin ở trạng thái trung tính H3A, trong khoảng pH này, curcumin khó tan trong nước và tạo huyền phù màu vàng

pH > 7.5: Dung dịch curcumin có màu đỏ vì curcumin tồn tại các dạng H2A-,

HA2-, A3 Giá trị hằng số phân ly proton pKa1, pKa2, pKa3 (tương ứng của H2A-, HA

2-, A3-) lần lượt là 7,8; 8,5 và 9,0 [37]

Hình 1 6 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch

 Phân hủy trong môi trường kiềm

Curcumin tương đối ổn định ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH >

7 Tonnesen và Karlsen nghiên cứu quá trình phân hủy curcumin trong khoảng pH

=7-10 bằng phương pháp HPLC, sản phẩm của quá trình phân hủy là acid ferulic và feruloylmethan, sau đó feruloylmethan tiếp tục phân hủy thành vanillin và aceton, acid ferulic phân hủy thành vinylguaiacol và CO2 (hình 1.7) [40]

Hình 1 7 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

 Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng

Dưới tác dụng của ánh sáng curcumin phân hủy thành vanillin, acid vanillic, anhydrid ferulic, acid ferulic Curcumin cũng kém bền ngay cả khi không có mặt oxy Khi có mặt oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy thành 4-vinylguaialcol và vanillin

Trong điều kiện không có oxy, curcumin có thể bị vòng hóa (hình 1.4.) [25].

Hình 1 8 Sự phân hủy curcumin dưới tác dụng của ánh sáng

1.1.4 Tác dụng sinh học của curcumin

Curcumin đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, chống tăng sinh, ngăn ngừa ung thư, chống kí sinh trùng, chống sốt rét hiệu quả Các nghiên cứu trên động vật cho thấy curcumin có hiệu quả trên một số bệnh như tiểu đường, béo phì, bệnh thần kinh, rối loạn tâm thần Dưới đây là một số hoạt tính sinh học nổi bật của curcumin

 Tác dụng chống oxy hóa

Curcumin được biết đến như một tác nhân bảo vệ màng sinh học chống lại sự oxy hóa của peroxid Hầu hết các chất chống oxy hóa đều có một nhóm chức phenol hoặc một nhóm chức diceton Curcumin là một chất chống oxy hóa độc đáo, trong cấu trúc bao gồm nhiều nhóm chức như nhóm β-diceton, liên kết đôi C=C và nhóm phenol [42] Tác dụng chống oxy hóa của curcumin thông qua khả năng dọn các gốc tự do như anion superoxid (O2-) và gốc tự do hydroxyl (OH*), từ đó ngăn cản sự peroxy hóa lipid [12] Curcumin có tác dụng chống oxy hóa mạnh ở pH trung tính và acid

Cơ chế hoạt động của nó bao gồm ức chế một số đường truyền tín hiệu tế bào ở nhiều cấp độ, tác động lên các enzym màng tế bào như enzym cyclooxygenase và glutathion-S-tranferase, điều biến miễn dịch, các tác động lên thành mạch và sự kết dính tế bào - tế bào [36]

Các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa của curcumin mạnh tương đương với vitamin C, vitamin E và β-caroten [12]

 Chống viêm

Curcumin có đặc tính chống viêm vượt trội và đã được sử dụng như một loại thuốc tự nhiên để điều trị các bệnh viêm nhiễm Hoạt tính chống viêm của curcumin tương đương mà không gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm như các thuốc chống viêm steroid và không steroid như indomethacin và phenylbutazon [9]

Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy hiệu quả của curcumin trong việc điều trị bệnh viêm khớp do gút, viêm xương khớp và viêm khớp dạng thấp [36]

 Chống ung thư

Curcumin là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính, có tác dụng kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối [35] Cơ chế của tác dụng chống ung thư của curcumin có thể là do khả năng chống oxy hóa và dọn gốc tự do, cũng như khả năng làm tăng gián tiếp nồng độ glutathion, do đó giúp giải độc gan và ức chế sự hình thành nitrosamin [12]

Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện trên các tác động của curcumin trên các ung thư như ung thư đại trực tràng (CRC), ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, đa u tủy, ung thư phổi…[24]

 Điều trị viêm loét dạ dày – tá tràng

Nghệ đã được chứng minh làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày- tá tràng; tăng gastrin, secretin, bicarbonat, và bài tiết enzym tụy Nghệ cũng được chứng minh có tác dụng ức chế hình thành vết loét, chống lại tác động của các yếu tố gây loét như stress, rượu, một số thuốc như indomethacin, reserpin… làm tăng đáng kể chất nhầy ở thành dạ dày chuột [12]

Curcumin ức chế quá trình tạo kháng nguyên gây viêm và ngăn chặn sự phát

triển của vi khuẩn H pylori Điều đó cho thấy curcumin rất có tiềm năng trong điều trị viêm loét dạ dày khởi phát từ H pylori [12].

 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, làm lành vết thương

Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng dịch chiết nghệ và curcumin có tác dụng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn, điển hình là trực khuẩn lao (Plasmodium falciferum), tụ cầu vàng (Staphylococus aureus), Salmonella paratyphi, Mycrocus pyogenes Dịch chiết ethanol của nghệ có tác dụng chống lại Entamoeba histolytica

[12]

Năm 2010, C Changtam và cộng sự đã tiến hành tổng hợp 55 dẫn chất từ các curcuminoid được chiết từ củ nghệ (curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxy-curcumin) [18], bao gồm các dẫn chất demethyl hóa; dẫn chất ether hóa nhóm -OH của nhân thơm; dẫn chất acetat; dẫn chất dihydro, tetrahydro, octahydro; dẫn chất

isoxazol… Các dẫn chất đã được đánh giá tác dụng kháng khuẩn Mycobacterium tuberculosis H37Ra Kết quả cho thấy các dẫn chất demethyl hóa đều có tác dụng kháng M tuberculosis, tuy nhiên tác dụng kém hơn so với curcuminoid ban đầu Các

nhà nghiên cứu dự đoán rằng khi tăng nhóm phân cực gắn với nhân thơm đã làm giảm

tác dụng kháng M tuberculosis Các dẫn chất alkyl hóa đều có tác dụng kháng M tuberculosis, đáng chú ý là dẫn chất mono-O-n-propylcurcumin và dẫn chất mono- O-n-pentylcurcumin có tác dụng mạnh hơn curcumin lần lượt 4 lần và 8 lần [18] Curcumin cũng ức chế tụ cầu S aureus kháng methicillin với MIC là 125–250 μg/mL [31] Trong nghiên cứu in vitro 3 hợp chất mới của curcumin, indium

curcumin, indium diacetyl curcumin và diacetyl curcumin cho thấy tác dụng chống

lại S aureus, S epidermis, E coli, P aeruginosa, trong đó indium curcumin có tác

dụng chống vi khuẩn tốt hơn so với curcumin và có triển vọng để nghiên cứu trong

in vivo [38]

Các nghiên cứu bổ sung bột nghệ vào môi trường nuôi cấy mô thực vật cho thấy bột nghệ ở nồng độ 0,8 và 1,0 g/L có hoạt tính ức chế đáng kể chống lại sự nhiễm nấm Cơ chế kháng nấm của curcumin có thể là do ức chế desaturase (ERG3) làm giảm sản xuất và tích lũy các tiền chất sinh tổng hợp ergosterol của tế bào nấm, dẫn đến chết tế bào [47]

 Các tác dụng khác

Nhờ có khả năng chống oxy hóa, dọn các gốc tự do gây viêm loét curcumin được

sử dụng trong mỹ phẩm giúp nhanh lành vết thương, liền sẹo Kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của collagen, curcumin đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thương ở mô [3]

Trong các nghiên cứu in vitro, curcumin được chứng minh là gián tiếp ảnh hưởng

tới bệnh Alzheimer thông qua 8 cơ chế khác nhau [41]

1.2 TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CÁC DƯỢC CHẤT MỚI THÔNG QUA VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN

Curcumin được biết đến với nhiều ưu điểm nổi bật về đa dạng tác dụng sinh học cũng như độ an toàn cao Tuy nhiên, việc sử dụng curcumin qua đường uống để điều trị gặp phải một số khó khăn như sinh khả dụng của curcumin rất thấp do độ tan kém, hấp thu kém, bị chuyển hóa nhanh khi vào cơ thể, vì vậy mà một số hoạt tính sinh học chưa có ý nghĩa lâm sàng [41] Gần đây, hướng tạo ra hợp chất mới từ khung curcuminoid có sẵn đã nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Việc biến đổi trong cấu trúc của curcumin bao gồm sửa đổi chuỗi bên aryl, chức diceton, các liên

kết đôi, thay đổi chức methylen hoạt động, tạo phức kim loại của curcumin (Hình 1.9) [11] Những nghiên cứu này đã đạt được một số thành công nhất định trong việc

nâng cao hoạt tính sinh học hoặc sinh khả dụng của curcumin Dưới đây là một số ví

dụ cụ thể về các dẫn chất bán tổng hợp từ curcuminoid

Hình 1 9 Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin – sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylen (D), tạo

phức hợp kim loại – curcumin (E)

J R Fuchs và cộng sự đã thực hiện việc biến đổi trên chức –OH của chuỗi aryl

và đánh giá tác dụng của chúng chống lại dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú Hợp chất 1, 2 được đánh giá là chất gây độc tế bào mạnh chống lại tế bào ung thư tuyến tiền liệt thể phụ thuộc androgen cũng như thể không phụ thuộc androgen

Các hợp chất này cũng ức chế dòng tế bào ung thư vú thể phụ thuộc estrogen và không phụ thuộc estrogen [22]

S Aggrwal và cộng sự đã tổng hợp phức [DLys6]-LHRH-curcumin (3) và nghiên

cứu tác dụng chống ung thư tuyến tụy trên cả in vivo và in vitro Kết quả cho thấy trên in vitro, [DLys6]-LHRH-curcumin ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư So sánh

tác dụng của curcumin và [DLys6]-LHRH-curcumin ở các nồng độ như nhau cho

thấy hoạt tính của curcumin và [DLys6]-LHRH-curcumin là tương đương Trên in vivo, [DLys6]-LHRH-curcumin ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư tuyến

tụy ở chuột, làm giảm trọng lượng và khối lượng khối u một một cách đáng kể so với curcumin [11]

E M Al-Hujaily đã tổng hợp và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của hai chất tương tự curcumin là (4) và (5), qua thực nghiệm cho thấy tác dụng chống ung thư của (4) và (5) gấp 5 lần curcumin ở liều 40 mM Bên cạnh đó các hợp chất này ổn định trong máu và cho sinh khả dụng cao hơn curcumin khi nghiên cứu trên chuột thí nghiệm [13]

J Jankun và cộng sự đã tổng hợp các chất tương tự curcumin trong đó hợp chất (6), (7) đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh enzym cyclooxygenase-1 (COX-1) và COX-2 J Jankun và cộng sự đã thực hiện các nghiên cứu để xác định khả năng ức chế vượt trội của các dẫn chất curcumin tổng hợp so với curcumin Hơn 75% các dẫn chất của curcumin đã đến được đích tác dụng, ức chế P-12-LOX, trong khi các curcumin đã không thể tiếp cận được đích tác dụng và do đó không thể ức chế P-12-LOX [27]

Ví dụ:

- Phản ứng tổng hợp diethyl-curcumin của H Chowdhury và cộng sự (2000)

Sơ đồ phản ứng:

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat, sử dụng tác nhân ethylbromid, đun hồi lưu trong 24-48h Sau phản ứng, lọc và cất loại dung môi, chiết cắn bằng dung môi hữu cơ Pha hữu cơ được rửa sạch bằng nước Làm khan và bốc hơi dung môi thu được sản phẩm với hiệu suất là 86,0% [20]

- Phản ứng tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin của H Ohtsu

và cộng sự (2002)

Sơ đồ phản ứng:

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat và kali iodid, sử dụng tác nhân methyl cloroacetat, đun hồi lưu trong 24h Sản phẩm

được tách ra bằng sắc ký cột, thu được mono-O-methoxycarbonylmethyl-curcumin

và di-O- methoxycarbonylmethyl-curcumin với hiệu suất đều là 20% [32]

- Phản ứng tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin của C Changtam và cộng

sự (2010)

Sơ đồ phản ứng:

- Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat,

sử dụng tác nhân 2-bromoethanol, đun hồi lưu trong 5h Sản phẩm được tách ra bằng

sắc ký cột, mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin và di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin

với hiệu suất lần lượt là 47% và 32% [19]

1.3.2 C-alkyl hóa

C-alkyl hóa thường là phản ứng alkyl hóa các hợp chất chứa nhóm methylen hoạt

động (là các hợp chất có nguyên tử hydro gần các nhóm hút điện tử mạnh) [5] Trong phân tử curcumin, C-4 thuộc cấu trúc β-diceton nên 2 nguyên tử hydro ở vị trí C-4 trở lên rất linh động, liên kết C-H ở đây dễ dàng bị cắt đứt Chính vì vậy mà vị trí C-

4 trong phân tử curcumin có khả năng bị tấn công bởi các tác nhân alkyl hóa, tạo ra

dẫn chất C-alkyl hóa của curcumin

- Phản ứng tổng hợp dẫn chất trimethylcurcumin của U Roughley và cộng sự (1973)

Sơ đồ phản ứng

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat, sử dụng tác nhân methyl ioidid, đun hồi lưu trong 48h Sản phẩm được tách ra bằng sắc

ký cột, thu được trimethylcurcumin với hiệu suất 55% [34]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là bột curcumin chiết xuất từ củ nghệ vàng tại

Bộ môn Công nghiệp dược – Đại học Dược Hà Nội

Các nguyên vật liệu và hóa chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày

trong Bảng 2.1:

Bảng 2 1 Danh mục các nguyên vật liệu

2 2-Cloroethanol >99%, Merck, Đức

3 2-Bromoethanol >95%, AKSci, Mỹ

12 Natri hydrocarbonat AR, Trung Quốc

13 Natri sulfat khan AR, Trung Quốc

2.2 DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

Các dụng cụ và thiết bị đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2 2 Danh mục các dụng cụ thiết bị

3 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 g Thụy Sĩ

4 Cân phân tích Sartorius TE 214S, độ nhạy 10-4 g Thụy Sĩ

10 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Bruker

11 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Ascend 500 Mỹ

12 Máy đo phổ khối lượng Agilent 6460 LCMS/MS Mỹ

13 Máy đo phổ khối lượng Agilent 1100 LC/MSD Trap

16

Các dụng cụ khác: Bình chiết, bình cầu; cốc có mỏ; giấy

lọc; nhiệt kế thủy ngân; ống đong; ống nghiệm; pipet chia

vạch,…

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Tổng hợp một số dẫn chất alkyl hóa của curcumin

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy

Xác định cấu trúc các sản phẩm tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) [2] Thử tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất tổng hợp được

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2 1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-hydroxyethyl, methoxycarbonylmethyl và

ethoxycarbonylmethyl của curcumin

 Sản phẩm sau phản ứng alkyl hóa được thủy phân và tạo muối natri (Hình 2.2)

Hình 2 2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất carboxymethyl curcumin và muối natri

- Tinh chế các sản phẩm phản ứng bằng phương pháp chiết với dung môi hữu

cơ thông dụng và kết tinh trong dung môi thích hợp (ethanol 96°, hỗn hợp

ethanol-ether, methanol, )

2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt

độ nóng chảy

SKLM được thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 Merck 70-230 mesh với

hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Nhiệt độ nóng chảy được ghi trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học

Dựa trên các kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR

 Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại của các chất được ghi trên máy Shinmadzu hoặc Jasco

FT/IR-6700 với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000 – 400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng film mỏng

dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Phổ IR được ghi tại Phòng phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hoặc Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia - Trường Đại Học Dược Hà Nội

 Phổ khối lượng (MS)

Được ghi theo phương pháp ESI trên máy đo phổ khối lượng Agilent 1100 LC/MSD Trap tại phòng phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và trên máy Agilent 6460 LCMS/MS tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại Học Dược Hà Nội

 Nguyên tắc:

- Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định (vi khuẩn), hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ

ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:

D

 =

n

D

n i i

D



: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

Di: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thí nghiệm làm song song (n =3)

 Giống VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh học, Trường Đại học Dược Hà

Nội cung cấp gồm 5 vi khuẩn gram(+) và 4 vi khuẩn gram(-) sau:

- Vi khuẩn Gram(+):

Staphylococcus aureus ATCC 1128 (S aureus)

Bacillus pumilus ATCC 10241 (B pumilus)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (B subtilis)

Bacillus cereus ATCC 9946 (B.cereus)

Sarcina lutea ATCC 9341 (S lutea)

- Vi khuẩn Gram(-):

Escherichia coli ATCC 25922 (E coli)

Proteus mirabilis BV 108 (P mirabilis)

Shigella flexneri DT 112 (S flexneri)

Salmonella typhi DT 220 (S typhi)

 Môi trường thử nghiệm : Canh thanh, thạch thường

 Mẫu kháng sinh chuẩn

- Benzathin penicillin G: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(+)

- Streptomycin base: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(-)

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất dimethoxycarbonylmethyl-curcumin (KT-1)

Xử lý phản ứng

 Cất loại dung môi ra khỏi khối phản ứng bằng máy cất quay chân không Thêm methanol và cất nhiều lần để loại tác nhân dư khỏi khối phản ứng

 Sau khi loại dung môi và tác nhân dư, hòa tan hoàn toàn hỗn hợp bằng 200

mL ethyl acetat và một lượng vừa đủ diclomethan (để trợ tan), chuyển vào bình chiết

500 mL Rửa pha hữu cơ bằng nước cất cho đến khi được pH trung tính Làm khan pha hữu cơ bằng Na2SO4 khan Lọc loại chất làm khan Cất loại dịch lọc đến còn khoảng 45 mL Thêm 45 mL ethanol và đun nóng hỗn hợp đến tan hoàn toàn Để kết tinh trong 1 giờ Lọc lấy tinh thể, sấy khô ở 60-70°C

Tóm tắt kết quả:

 Khối lượng sản phẩm: 1,23 g (Hiệu suất 69,10%)

 Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nhạt

kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước = 6 : 2 : 2

Xử lý phản ứng

 Cất loại bớt 1,4-dioxan ra khỏi khối phản ứng bằng máy cất quay chân không

ở nhiệt dộ dưới 95°C đến khi có tủa xuất hiện

 Chuyển hỗn hợp vào bình chiết 250 mL Chiết lấy sản phẩm bằng ethyl acetat (50 mL x 3 lần) và một lượng vừa đủ methanol để trợ tan, rửa pha hữu cơ bằng nước cho đến pH không đổi (pH=3-4) Làm khan pha hữu cơ bằng Na2SO4 khan Lọc loại

bỏ chất làm khan Bốc hơi dịch lọc đến còn 50 mL Để kết tinh lạnh qua đêm Lọc lấy tinh thể, sấy khô ở 60°C

Kết quả

 Khối lượng sản phẩm: 0,15 g (Hiệu suất 40,95%)

 Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nhạt

 Nhiệt độ nóng chảy: 183,8 - 188,2°C

 Rf = 0,52 (hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước = 6 : 2 : 2)

3.1.3 Tổng hợp tetra natri

độ phòng trong 3 giờ Cất loại dung môi đến cắn Nghiền cắn với 5 mL methanol Lọc thu phần tủa, sấy khô ở 60°C

Kết quả

 Khối lượng sản phẩm: 0,05 g (Hiệu suất 86,33%)

 Cảm quan: tinh thể màu vàng nhạt

 Nhiệt độ nóng chảy: 278,2 - 282°C (phân hủy)

 Rf = 0,52 (hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước = 6 : 2 : 2)

3.1.4 Tổng hợp dẫn chất (2-hydroxylethyl)-curcumin (KT-4)

 Đi từ 2 - cloroethanol

Sơ đồ phản ứng

Hình 3 4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-4 với tác nhân 2-cloroethanol

Tiến hành phản ứng

Đun hồi lưu hỗn hợp gồm: 1,00 g (2,71 mmol) curcumin, 1,69 g (12,20 mmol)

K2CO3 khan và 80 mL aceton khan Thêm 12,7 mL (0,19 mol) 2-cloroethanol Đun

hồi lưu trong 24 giờ Kết thúc phản ứng kiểm tra bằng SKLM với 2 hệ dung môi

dicloromethan : methanol = 9:1; n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7

Xử lý phản ứng

 Lọc loại K2CO3 Cất dịch lọc để thu hồi aceton

 Hòa tan phần còn lại vào 100 mL dicloromethan Rửa pha dicloromethan với dung dịch natri hydroxyd 0,1N 3 lần, mỗi lần 20ml, pH nước rửa đạt ~ 11 Rửa lại pha hữu cơ bằng nước cất cho đến khi được pH trung tính Làm khan bằng natri sulfat khan Lọc loại chất làm khan

 Bốc hơi dịch lọc đến kiệt Hòa tan cắn thu được trong 30,0 mL ethanol nóng (60°C) trong bình nón Để nguội, thêm từ từ diethyl ether cho đến khi xuất hiện tủa (~10ml) Làm lạnh hỗn hợp để kết tủa hoàn toàn Lọc lấy tủa, sấy khô ở 60-70°C Kết quả

 Khối lượng sản phẩm: 0,21 g (Hiệu suất 16,98%)

 Cảm quan: bột vô định hình màu vàng hơi sẫm

 Nhiệt độ nóng chảy: 176,0 - 178,0°C

 Rf = 0,65 (CH2Cl2 : MeOH = 9:1), Rf = 0,21 (EtOAc : n-hexan = 7:3)

 Đi từ 2 - bromoethanol

Sơ đồ phản ứng

Hình 3 5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp KT-4 với tác nhân 2–bromoethanol

Tiến hành phản ứng

Tiến hành tương tự theo quy trình tổng hợp KT-4 sử dụng tác nhân 2–cloroethanol, trong đó thực hiện phản ứng với 1,00 g (2,71 mmol) curcumin, 1,69 g (12,20 mmol) K2CO3 khan và 80,0 mL aceton khan Thêm 1,9 mL (0,0269 mol) 2-bromoethanol

Kết quả

 Khối lượng sản phẩm: 0,41 g (Hiệu suất 33,14%)

 Cảm quan: bột vô định hình màu vàng nâu

4 hoàn toàn phù hợp với tài liệu [7] Kết quả phổ của các sản phẩm KT-2, KT-3 được trình bày cụ thể như sau: