Dựa trên nguyên tắc phản ứng ngưng tụ giữa hợp chất có nhóm >c=0 của cafein được chiết ra từ chè, cà phê với các chất có cấu tạo H2N-B. Với hy vọng tìm được những dẫn xuất của cafein có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn tại Bộ môn Công nghiệp Dược (Trường Đại học Dược Hà Nội).
Để thử tác dụng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được, chúng tôi sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch với các khoanh giấy đã tẩm chất thử.
Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn có đường kính tỷ lệ với logarit nồng độ chất thử.
❖ Chuẩn bị môi trường:
Môi trường thạch thường Môi trường canh thang
❖ Chuẩn bị mẫu thử:
Các mẫu thử (gồm 3 dẫn chất của cafein: oxim, 2,4-dinitrophenyl hydrazon, thiosemicarbazon) được pha ở nồng độ 4mg/ml trong dung môi thích hợp (DMF), rồi tẩm vào các khoanh giấy có đường kính 6 mm đã được tiệt trùng. Lặp lại 3 lần. Trong quá trình tẩm, để khoanh giấy 3 phút trong dung môi DMF, gạn bỏ dung môi, mỗi lần tẩm xong đem sấy khô ở nhiệt độ 37°c. Với mỗi khoanh giấy lọc này chứa khoảng 30|ig chất thử.
❖ Vi sinh Vật kiểm định:
Để nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của 3 chất tổng hợp được. Chúng tôi sử dụng 4 loại vi sinh vật, trong đó 2 chủng Gram (+), 2 chủng Gram (-).
Gram (+): Staphylococcus aureus ATTCC 12228
Gram (-): Escherichia coli ATTCC 25922
Samonella typhi DT 220
❖ Chuẩn bị mẫu vi sinh yật thử:
4 chủng vi sinh vật trước khi đem thử được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp, ở đây chúng tôi sử dụng môi trường canh thang. Sau 20 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°c, các vi sinh vật phát triển nhận thấy qua sự vẩn đục trong dung dịch nuôi cấy các chủng. Sau đó làm thành nhũ dịch có nồng
độ 1 07- 1 0 8 tế bào/ml.
❖ Tiến hành:
Môi trường thạch thường đã chuẩn bị trong bình nón đậy kín bằng bông đem hấp tiệt trùng ở 105°c trong thời gian 1 giờ. Lấy ra để nhiệt độ hạ xuống khoảng 45°c. Đổ nhũ dịch có chứa vi sinh vật kiểm định vào môi trường thạch vừa chuẩn bị ở trên, lắc đều đổ ra các đĩa petri với đường kính bằng nhau, đổ khoảng 20ml môi trường để tạo mặt phẳng. Để nguội cho thạch đông cứng lại, đặt khoanh giấy đã tẩm chất thử, chất chứng lên bề mặt thạch theo sơ đồ quy định. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ cho các chất thử khuyếch tán vào môi trường. Sau 24 giờ để ở nhiệt độ 35-37°C thấy có một chất tạo vòng vô khuẩn rõ rệt. Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước chính xác đến 0,1 mm.
Dưới đây là hình ảnh minh họa về tác dụng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được:
Hình 1. Vòng vô khuẩn của các chất I, II, n i trên chủng
Salmonella typhy DT 220 ở nồng độ 4mg/ml
Hình 2. Đĩa thạch thử tác dụng của các chất I, II, III trên chủng
Kết quả được ghi ở bảng sau:
BẢNG2.3. KẾT QUẢ THỬTÁC DỤNG KHÁNG KHUAN c ủ a c á c
CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC
v s v
Chất thử
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Staphylococcus aureus ATTC 12228 Bacillus subtillis ATTCC 6633 Escherichia coli ATTCC 25922 Salmonella typhi DT220 I — — — — II — — — — m — — — 12,06 A — — — — Ghi chú: (-): không có tác dụng. VSV: vi sinh vật. A: Acid benzoic (chứng) 36