Luận án tiến sĩ vật lý Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN VẬT LÝ PHẠM MINH TÂN CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ

PHẠM MINH TÂN

CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT

QUANG CỦA HẠT NANO SILICA

CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ

PHẠM MINH TÂN

CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT

QUANG CỦA HẠT NANO SILICA

CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới PSG.TS Trần Hồng Nhung và PGS.TS Tống Kim Thuần, những người thầy luôn tận tụy hết lòng hướng dẫn tôi, tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong thời gian tôi học tập

và nghiên cứu ở Viện Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Hồng Nhung đã luôn giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần, tạo mọi điều kiện cho tôi có cơ hội học tập, trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu ở trong và ngoài nước

Tôi xin chân thành cảm ơn: TS Nghiêm Thị Hà Liên, TS Vũ Thị Thùy Dương, CN Trần Anh Đức, ThS Nguyễn Thị Vân, ThS Trần Thu Trang, ThS Nguyễn Thị Thùy, PGS.TS Đỗ Quang Hòa, TS Vũ Dương, TS Phạm Long và các bạn đồng nghiệp trong nhóm NanoBiophotonics đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm và các trao đổi khoa học trong suốt quãng thời gian tôi học tập, nghiên cứu ở Viện

Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm luận án Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện

để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình Tôi xin cảm ơn NCS Nguyễn Đình Hoàng, ThS Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo quang học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS Lê Quang Huấn, ThS Trần Thanh Thủy, ThS Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tôi trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo và bạn đồng nghiệp trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn các thầy cô và bạn đồng nghiệp trong Phòng Đào tạo, các thầy cô, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên Khoa Vật lý và Công nghệ, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện về thời gian, vật chất và động viên tôi để tôi có thể hoàn thành được luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô, chú, anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Điện tử học Lượng tử, Viện Vật lý

Cuối cùng, tôi xin dành những lời cảm ơn sâu nặng nhất đến những người thân thương trong gia đình tôi: Bố, mẹ, vợ, con, các anh chị em và các cháu đã dành cho tôi những tình cảm, động viên, chia sẻ cho tôi rất nhiều trong những năm tháng làm việc vất vả này

Phạm Minh Tân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PSG.TS Trần Hồng Nhung và PGS.TS Tống Kim Thuần Các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Phạm Minh Tân

Luận án được hoàn thành bởi kinh phí của đề tài NAFOSTED

Mã số: 103.06.101.09

Và đề tài cấp Nhà nước

Mã số: 01/2/2011/HĐ-NCCBUD

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN……… …… i

DANH MỤC CÁC BẢNG……… ……iii

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ……… …v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN 10

1.1 Chất màu hữu cơ 10

1.1.1 Cấu trúc hóa học 10

1.1.2 Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học 11

1.1.3 Quang phổ của chất màu 13

1.1.4 Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ 15

1.1.5 Hiện tượng dập tắt vì nồng độ 16

1.1.6 Ảnh hưởng của môi trường 17

1.1.6.1 Ảnh hưởng của dung môi 17

1.1.6.2 Sự kết tụ các phân tử màu 18

1.2 Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ 18

1.2.1 Các hạt nano silica và latex 18

1.2.2 Các hạt nano silica/ormosil 19

1.2.3 Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ 20

1.2.3.1 Phương pháp Stober 20

1.2.3.2 Các phương pháp micelle 21

1.2.4 Các đặc trưng hóa lý 22

1.2.4.1 Vật liệu nền 22

1.2.4.2 Độ chói và độ bền quang 23

1.2.4.3 Th ế Zeta 24

1.2.5 Các hạt nano silica hợp sinh 26

1.2.5.1 Yêu c ầu của các hạt nano silica hợp sinh 26

1.2.5.2 S ự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học 27

1.2.6 Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học 31

1.2.6.1 Phép th ử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays) 31

1.2.6.2 Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học 31

1.1.6.3 Đầu dò DNA siêu nhạy 32

1.1.6.4 Phân tích đa kênh 32

1.1.6.5 Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm 33

1.1.6.6 Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer) 34

1.2.6.7 Vận chuyển thuốc 35

1.3 Các đối tượng sinh học 36

1.3.1 Protein 36

1.3.2 Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) 36

1.3.3 Strepavidin (SA) 37

1.3.4 Kháng thể 37

1.3.5 Kháng nguyên 38

1.3.6 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 39

1.3.7 Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể) 39

1.3.7.1 Khái ni ệm 39

1.3.7.2 Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể 39

1.4 Kết luận chương 1 40

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 41

2.1 Các thí nghiệm chế tạo 41

2.1.1 Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng phương pháp micelle thuận 41

2.1.1.1 Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB 41

2.1.1.2 Bọc hạt nano silica bằng protein 46

2.1.1.3 Ch ế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý 49

2.1.2 Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp micelle đảo 50

2.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với APTES 50

2.1.2.2 Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC 51

2.1.3 Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp Stober 53

2.1.3.1 Chế tạo hạt nano silica chứa FITC Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt 53

2.1.3.2 Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC 54

2.2 Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu 55

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt 55

2.2.1.1 Hi ển vi điện tử quét (SEM) 56

2.2.1.2 Hi ển vi điện tử truyền qua (TEM) 56

2.2.2 Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta 56

2.2.3 Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán 57

2.2.4 Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học 59

2.2.5 Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý 63

2.2.5.1 Phương pháp phổ hấp thụ 63

2.2.5.2 Phương pháp phổ huỳnh quang 64

2.2.5.3 Hiệu suất lượng tử 65

2.2.5.4 Thời gian sống phát quang 67

2.2.6 Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học 68

2.2.6.1 Kính hiển vi quang học 68

2.2.6.2 Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy 70

2.3 Kết luận chương 2 71

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ 73

3.1 Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề mặt theo phương pháp micelle thuận 73

3.1.1 Hình dạng, kích thước hạt 73

3.1.2 Cấu trúc hóa học 74

3.1.3 Đường kính thủy động học 77

3.1.4 Các đặc trưng quang học 80

3.1.4.1 H ấp thụ và huỳnh quang 80

3.1.4.2 Hi ệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang 81

3.2 Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương pháp micelle thuận 85

3.2.1 Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ) 86

3.2.2 Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano 88

3.2.2.1 Tính ch ất quang 88

3.2.2.2 Độ phân cực huỳnh quang 92

3.2.3.3 K ết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp FCS 93

3.3 Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) 95

3.3.1 Hình dạng, kích thước 95

3.3.2 Tính chất quang 96

3.4 Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA) 98

3.4.1 Hình dạng, kích thước 98

3.4.2 Tính chất quang 98

3.4.2.1 Ph ổ huỳnh quang trong nước 98

3.4.2.2 Ph ổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS 99

3.5 Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo 100

3.5.1 Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với APTES 100

3.5.2 Tính chất quang 102

3.6 Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober 104

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt 104

3.6.2 Tính chất quang 105

3.6.3 Chức năng hóa 107

3.6.3.1 K ết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH 2 107

3.6.3.2 K ết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt 108

3.6.3.3 Ch ức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH 110

3.7 Kết luận chương 3 112

CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU SINH HỌC 114

4.1 Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh 114

4.1.1 Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang 114

4.1.1.1 Ch ế tạo phức hệ SiO 2 RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7 114

4.1.1.2 S ử dụng phức hệ SiO 2 RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E coli O157 :H7 114

4.1.1.3 Hi ện ảnh tế bào 114

4.1.1.4 Xây d ựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn 115

4.1.2 Phát hiện tế bào ung thư vú 115

4.1.2.1 Nguyên v ật liệu và hóa chất 115

4.1.2.2 Ch ế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể HER2 (SiO 2 RB@HER2) 115

4.1.2.3 Nuôi c ấy tế bào 115

4.1.2.4 Sử dụng phức hệ SiO 2 RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4 116 4.1.2.5 Thí nghi ệm đếm tế bào trong dòng chảy 116

4.1.3 Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474 116

4.1.3.1 Ch ế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể HER2 (SiO 2 FITC@HER2) 116

2.1.3.2 Nh ận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO 2 FITC@HER2 116

4.2 Kết quả phát hiện vi khuẩn E coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang 117

4.2.1 Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang 117

4.2.2 Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi khuẩn E coli O157:H7 119

4.3 Nhận biết tế bào ung thư vú 121

4.3.1 Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang 121

4.3.2 Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào 124

4.4 Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC 127

4.5 Kết luận chương 4 127

KẾT LUẬN 129

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 131

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN

DLS Dynamic Light Scattering

DMSO Dimethyl Sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

EDC Ethylene dichloride

FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy

FITC Fluorescein Isothiocyanate

HĐBM Hoạt động bề mặt

HSLT Hiệu suất lượng tử

IHQ Cường độ huỳnh quang

IHT Cường độ hấp thụ

LSCM Laser Scanning Confocal Microscope MES axit 2-(N-morpholino)etansulfonic MTEOS Methyl triethosyxilane

NP Nano particles – các hạt nano

Ormosil Organically modifiled silicate

PEG polyethylene glycol

PDT Photodynamic Therapy

Precursor Tiền chất

PTTMEOS 3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol

SiFITC Hạt nano silica chứa FITC

SiRB Hạt nano silica chứa RB

TCSPC Time-correlated single photon counting

TEOS Tetraethyl orthosilicate

TGSPQ Thời gian sống phát quang

DANH MỤC CÁC BẢNG

B ảng 1.1 Độ ổn định của huyền phù theo thế Zeta 25

B ảng 2.1 Thí nghiệm xác định lượng BSA đủ để bọc hạt 47

B ảng 2.2 Dãy mẫu thay đổi nhóm chức năng 49

B ảng 2.3 Dãy mẫu thay đổi kích thước hạt 49

B ảng 2.4 Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp micelle đảo 52

B ảng 2.5 Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp Stober v ới lượng NH 4 OH thay đổi 54

B ảng 3.1 Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt nano silica v ới các nhóm chức khác nhau 79

B ảng 3.2 Các thông số về kích thước theo các phương pháp đo khác nhau 83

B ảng 3.3 Các thông số của các mẫu hạt nano silica kích thước khác nhau 87

B ảng 3.4 Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt nano silica v ới kích thước khác nhau 91

B ảng 3.5 Độ phân cực huỳnh quang của RB trong nước, trong ethanol và các h ạt nano kích thước khác nhau 93

B ảng 3.6 Tổng hợp kích thước và hệ số khuếch tán của hạt đo bằng các phương pháp khác nhau 95

B ảng 3.7 Kết quả đo DLS của các mẫu với hợp chất FITC@APTES với lượng ethanol pha loãng khác nhau 101

B ảng 3.8 Kết quả đo DLS và TEM của các mẫu hạt nano silica chứa FITC v ới các kích thước khác nhau chế tạo bằng phương pháp Stober 105

B ảng 3.9 Các thông số của phổ hấp thụ và huỳnh quang 107

B ảng 3.10 Kết quả đo DLS và thế Zeta của các hạt nano silica có nhóm chức

NH 2 được chế tạo bằng phương pháp Stober 108

B ảng 3.11 Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử màu RB và R6G 10

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chất màu FITC 11

Hình 1.3 Cấu trúc mức năng lượng và chuyển dời quang học của phân tử màu 12

Hình 1.4 Ph ổ hấp thụ và huỳnh quang của RB 13

Hình 1.5 Sự phụ thuộc của hiệu suất huỳnh quang vào nồng độ 16

Hình 1.6 Các cách phổ biến kết hợp tâm màu vào các hạt nano silica và latex 19 Hình 1.7 Sự phát xạ huỳnh quang của các hạt nano silica chứa các loại tâm màu khác nhau 19

Hình 1.8 Các hệ micelle: Hệ micelle thuận (a) và Hệ micelle đảo (b) 21

Hình 1.9 Ảnh SEM của các mẫu hạt silica đơn phân tán với các kích thước khác nhau 22

Hình 1.10 Tính ch ất của RuBpy pha trong hạt nano silica 24

Hình 1.11 Bi ểu diễn thế Zeta của một hạt 25

Hình 1.12 Các cách thường tiếp hợp phân tử sinh học với hạt nano 28

Hình 1.13 Các cách gắn kết đồng hóa trị thông thường giữa phân tử sinh học và hạt nano 29

Hình 1.14 Mô tả cách gắn kết đặc hiệu của hạt nano silica với vi khuẩn lao Mycobacterium 29

Hình 1.15 Hình ảnh các vi khuẩn E coli 31

Hình 1.16 Mô tả thí nghiệm đánh dấu DNA xem kẽ dựa vào gắn kết sinh học với hạt nano silica 32

Hình 1.17 Giản đồ phân tích đa kênh bằng hạt nano silica chứa hai loại tâm màu với tỷ lệ nồng độ hai tâm màu khác nhau 33

Hình 1.18 Nguyên tắc hoạt động của máy đếm dòng tế bào (flow cytometry) 35 Hình 1.19 Cấu trúc của một phân tử kháng thể 38

Hình 2.1 C ấu trúc hóa học của các chất precursor và hoạt động bề mặt 42

Hình 2.2 Sơ đồ chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu RB có các nhóm chức NH 2 , NH 2 +OH 43

Hình 2.3 Sơ đồ phản ứng loại bỏ nhóm OH trên bề mặt hạt NH 2 +OH 44

Hình 2.4 Sơ đồ chế tạo hạt nano silica có các nhóm chức –OH và –SH 44

Hình 2.5 Phương trình phản ứng tạo nhóm –SH trên bề mặt hạt nano 45

Hình 2.6 C ấu trúc phân tử SH – PEG – COOH 45

Hình 2.7 Sơ đồ minh họa quá trình bọc BSA lên hạt nano silica 46

Hình 2.8 Phương trình phản ứng tạo liên kết amide 48

Hình 2.9 Mô hình quá trình b ọc SA bằng cách trực tiếp (a) và gián tiếp (b) 48 Hình 2.10 C ấu trúc hóa học của TEOS (a), FITC (b) 50

Hình 2.11 Ph ản ứng giữa FITC và APTES 51

Hình 2.12 Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp micelle đảo 52

Hình 2.13 Ph ản ứng đồng trùng hợp của FITC@APTES với TEOS để tạo liên k ết hóa trị của chất màu trong hạt silica 52

Hình 2.14 Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp Stober 53

Hình 2.15 Ph ản ứng tạo nhóm chức NH 2 trên b ề mặt hạt nano 54

Hình 2.16 C ấu trúc hóa học của Disodium 3-[dihydroxy(oxido)silyl]propanoate (a) và ph ản ứng tạo nhóm chức COOH trên b ề mặt hạt nano (b) 55

Hình 2.17 Các tr ạng thái năng lượng của phân tử hai nguyên tử 59

Hình 2.18 Ph ổ hấp thụ của RB và R6G 65

Hình 2.19 Nguyên lý t ổng quát của kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian 68

Hình 2.20 Sơ đồ nguyên lý hệ đếm Flow cell 71

Hình 3.1 Ảnh TEM của hạt nano SiO 2 -NH 2 &OH (a), SiO 2 -NH 2 (b), SiO 2 -COOH (c), SiO 2 -OH (d) và SiO 2 -SH (e)……… 74

Hình 3.2 Ph ổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO 2 -NH 2 &OH 74

Hình 3.3 Ph ổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO 2 -NH 2 75

Hình 3.4 Ph ổ hấp thụ hồng ngoại của HS-PEG-COOH……… 76

Hình 3.5 Ph ổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO 2 -COOH 76

Hình 3.6 Ph ổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO 2 -OH……… 77

Hình 3.7 Ph ổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO 2 -SH……… 77

Hình 3.8 Ph ổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica v ới các nhóm chức khác nhau 80

Hình 3.9 Ph ổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica v ới các nhóm chức khác nhau 80

Hình 3.10 M ối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và Γr /Γnr (b)……… 82

Hình 3.11 Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có nhóm chức khác nhau……… 84

Hình 3.12 Phân b ố kích thước hạt theo cường độ của phương pháp DLS: SiO 2 -NH 2 &OH (a), SiO 2 -NH 2 (b), SiO 2 -COOH (c), SiO 2 -SH (d)……… 85

Hình 3.13 Ph ổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica v ới các kích thước khác nhau 88

Hình 3.14 Ph ổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica v ới các kích thước khác nhau 88

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nền silica lên cường độ huỳnh quang và HSLT các m ẫu 90

Hình 3.16 M ối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và Γr/Γnr (b)……… 92

Hình 3.17 Cường độ huỳnh quang theo các hướng của chất màu RB trong nước (a), dung môi ethanol (b) và trong các hạt nano kích thước khác nhau (c, d, e, f)……… 92

Hình 3.18 Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có kích thước khác nhau……… 94

Hình 3.19 Kích thước các mẫu theo các phương pháp đo khác nhau………… 95

Hình 3.20 a) Ảnh SEM của các hạt nano silica SiOH 2 - OH trước khi bọc BSA 96

b) Ảnh TEM của các hạt nano silica SiOH 2 -OH sau khi b ọc BSA…

Hình 3.21 a) Ph ổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO 2 - OH@BSA trong nước

Hình 3.22 a) Ph ổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO 2 - OH@BSA trong nước

Hình 3.23 a) S ự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong nước

Hình 3.24 Ảnh SEM của SiO 2 -OH@SA@BSA 98

Hình 3.25 Ph ổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của SiO 2 -OH

Hình 3.26 a) Ph ổ huỳnh quang của SiO 2 -OH b ọc SA trong PBS

Hình 3.27 Ph ổ hấp thụ (a), hấp thụ chuẩn hóa (b) của chất màu FITC tự do

Hình 3.28 Ảnh TEM của các hạt nano SiO 2 @FITC v ới FITC@APTES pha

Hình 3.29 Ph ổ hấp thụ chuẩn hóa của phân tử FITC tự do, hợp chất

Hình 3.30 Ph ổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và

Hình 3.31 Ph ổ huỳnh quang của hợp chất FITC@APTES với lượng ethanol

Hình 3.32 Ảnh TEM của các hạt nano SiO 2 @FITC theo phương pháp Stober 104

Hình 3.33 Ph ổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của hợp chất

Hình 3.34 Ph ổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và

Hình 3.35 Ph ổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu

Hình 3.36 Ph ổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu

Hình 4.1 Hình ảnh các tế bào vi khuẩn E coli O157:H7……… 118

Hình 4.2 Ph ổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn đánh dấu bằng hạt nano

Hình 4.3 a) Ph ổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E coli O157:H7 với

b) Đường cường độ huỳnh quang theo số lượng vi khuẩn (đường màu đỏ) và

Hình 4.4 So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp đếm

Hình 4.5 Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiRB@HER2 (A) và v ới SiRB@BSA B) 122

Hình 4.6 Ảnh huỳnh quang tế bào HeLa sống ủ với phức hệ SiRB@HER2 (A)

và v ới SiRB@BSA (B) 122

Hình 4.7 Ảnh huỳnh quang tế bào KLP4 cố định ủ với phức hệ SiRB@HER 123

Hình 4.8 Ảnh huỳnh quang kết hợp tế bào KPL4 và Hela cố định ủ với phức

Hình 4.9 Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ với phức hệ SiRB@HER2 ở 4

Hình 4.10 Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1……… 125

Hình 4.11 Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1……… 125

Hình 4.12 Đối chứng tế bào HeLa:KPL4 = 5:1……… 126

Hình 4.13 Ảnh truyền qua (a) và huỳnh quang (b) của tế bào BT-474 sau khi

g ắn kết với phức hệ SiFITC@HER2 127

MỞ ĐẦU

Vật liệu phát huỳnh quang ứng dụng trong sinh học có sự tăng trưởng vượt bậc trong 20 năm trở lại đây do phép phân tích sử dụng huỳnh quang có độ nhạy cao, không phá hủy mẫu và không độc [162] Các phương pháp, thiết bị đo huỳnh quang hiện nay được sử dụng trong giám sát môi trường, hóa học lâm sàng, sàng lọc DNA và các phép phân tích gen bằng lai hóa huỳnh quang tại chỗ… Sự phát triển này có phần đóng góp của ngành hóa học chế tạo các chất đánh dấu huỳnh quang gồm các chất màu hữu cơ và các protein tự phát quang

Số lượng các phân tử chất màu sử dụng trong các nghiên cứu y – sinh lên tới hàng trăm loại [134] Tuy có rất nhiều ưu điểm nhưng các chất màu hữu cơ có nhược điểm là độ bền quang kém, dễ bị phân hủy dưới ánh sáng kích thích (hiện tượng tẩy quang), dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường Phổ hấp thụ của các chất màu hẹp nên đối với mỗi loại chất màu đòi hỏi một nguồn laser kích thích phù hợp, vì vậy các kính hiển vi huỳnh quang hiện đại thường được trang bị tới 3 – 4 laser khác nhau và các phép phân tích đa kênh sẽ khó thực hiện với các chất màu Ngoài ra, sự phát triển của sinh học phân tử đòi hỏi nghiên cứu các quá trình sinh học diễn ra ở mức phân tử, nội tế bào trong khoảng thời gian dài Vì vậy độ bền quang kém của phân tử màu hữu cơ là một trở ngại cho những nghiên cứu này Đặc biệt đối với việc hiện ảnh cắt lớp 3D thì trở ngại lớn nhất là sự phân hủy quang của các chất phát quang trong quá trình thực hiện cắt lớp liên tiếp theo trục z; sự phân hủy quang này làm ảnh hưởng tới việc dựng ảnh cấu trúc 3D Do đó việc tìm kiếm các loại chất đánh dấu sinh học mới vẫn là vấn đề thời sự trong các nghiên cứu của khoa học vật liệu trên thế giới

Trong những năm vừa qua có những cải tiến lớn trong các chất đánh dấu sinh học bằng sự ra đời của các chất đánh dấu trên cơ sở vật liệu nano với các ưu điểm nổi trội so với các chất đánh dấu cổ điển như: độ bền quang, độ tương phản cao và bền trong môi trường sinh học Các ưu điểm đó của các chất đánh dấu nano tạo ra khả năng phát hiện các đích sinh học với độ nhạy cao trong các điều kiện

khác nhau: từ chẩn đoán in vitro cho tới hiện ảnh in vivo

[45,52,82,110,141,145,150,153,155,157] Có thể liệt kê một số loại hạt nano thường dùng trong các phân tích sinh học như: các chấm lượng tử [17,30,66,101,104,158], các hạt kim loại (vàng và bạc) [18,28,61,147], các hạt từ [100], các hạt đất hiếm họ Lantan [144,161], các hạt nano chứa chất màu và một số vật liệu nano khác [34,84,113,124,160] Mỗi loại hạt nano có các ưu điểm vượt trội riêng của mình và thích ứng với các ứng dụng khác nhau trong lĩnh vực phân tích sinh học Bên cạnh

đó, một hướng nghiên cứu phát triển mạnh hiện nay là chế tạo vật liệu đa chức năng Phối hợp các vật liệu đơn: hạt từ, kim loại, silica và polymer sẽ cho các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ đa lớp, đa chức năng sử dụng trong cả chẩn đoán và cả điều trị: vừa dẫn đường và mang thuốc, vừa phát hiện, vừa làm giàu, vừa diệt tế bào [70,81,137]

Hạt nano silica chứa tâm màu là các hạt SiO2 xốp kích thước nano chứa được một số lượng lớn phân tử màu hữu cơ trong một hạt silica đơn Nền silica lại

ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương thích sinh học cao Sử dụng các phương pháp và quy trình thích hợp, một số lượng lớn chất màu có thể đưa vào trong một hạt nano silica đơn (từ hàng chục tới hàng nghìn phân tử màu) [38] Do

đó, các hạt nano silica chứa chất màu có độ chói và khuếch đại tín hiệu quang cao gấp nhiều lần so với phân tử màu đơn lẻ [70,97,99,117] Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của các hạt nano silica có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang Nếu lựa chọn các ứng dụng phân tích sinh học thích hợp, các hạt nano silica

có thể tạo ra những cải thiện đáng kể trong độ nhạy phân tích Hơn nữa, do bị cầm giữ trong nền silica, các chất màu được bảo vệ khỏi các ảnh hưởng của môi trường Mặt khác, do nền silica chứa rất ít oxy tự do nên phân hủy quang cũng được giảm thiểu [93,154] Độ bền quang cao cho phép các hạt nano silica được sử dụng trong các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài Hơn nữa, các hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá học để tạo các nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử sinh học như là amin (-

NH2), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH) [87,88,93,100,112,115] Bằng cách điều chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước hạt; số lượng tâm màu trong hạt cũng như loại tâm màu đưa vào, do đó người ta có thể tạo ra một nhóm lớn các hạt phát quang với các tính chất quang đa dạng dùng trong đánh dấu Bản thân silica là chất thân thiện với môi trường sinh học, do đó chúng có thể là các hạt

đa chức năng: vừa phát hiện và vừa mang thuốc trị bệnh [26,52,55,57,62,63,81,84,92,106] Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các chất đánh dấu sinh học mới, hứa hẹn được sử dụng rộng rãi trong các phân tích và đánh dấu sinh học

Các hạt nano silica chứa các phân tử màu (tâm màu) hữu cơ thường được chế tạo bằng 3 phương pháp: Stober, micelle thuận và micelle đảo Điểm cốt lõi của việc chế tạo là tạo các phản ứng sol-gel của các alkoxit silic trong các trung tâm phản ứng kích thước nano có chứa tâm màu, từ đó hình thành các mạng nền SiO2

xốp kích thước nano với các tâm màu nằm trong các lỗ xốp hoặc được gắn với mạng nền bằng liên kết đồng hóa trị Kích thước của hạt phụ thuộc vào kích thước của trung tâm phản ứng Có hai cách để kết hợp tâm màu với nền silica Cách thứ nhất sử dụng liên kết cộng hóa trị của phân tử màu với mạng nền silica [80,135,136], cách thứ hai là bẫy các phân tử chất màu vào trong mạng nền silica (bằng tương tác tĩnh điện, Van der Waals…) [159] Tùy thuộc vào tính chất của tâm màu: phân cực hay không phân cực, tan trong nước hay trong dung môi…, người ta

sẽ lựa chọn một trong ba phương pháp nêu trên để chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu Phương pháp lựa chọn phải đáp ứng các yêu cầu: i) giữ được các tâm màu trong mạng nền silica không bị thất thoát ra ngoài môi trường; ii) tính chất phát quang của tâm màu không bị ảnh hưởng nhiều bởi quá trình chế tạo [68,70]

Phương pháp micelle thuận thường dùng để chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu kỵ nước, không phân cực; phương pháp micelle đảo thường dùng để chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu ưa nước, tâm màu phân cực Ưu điểm của hai phương pháp mày là tạo được các hạt nano silica kích thước nhỏ, rất đơn phân tán

và tâm màu được phân bố đều trong các lỗ xốp của nền nên giảm thiểu được hiện tượng dập tắt huỳnh quang do va chạm Có thể đưa được một lượng lớn tâm màu vào trong một hạt nano [1,24,25,50,54,60,85,133] Nhược điểm của các phương pháp này là chế tạo phức tạp do phải sử dụng các chất hoạt động bề mặt để tạo các trung tâm phản ứng, do đó cần phải có khâu rửa hoạt động bề mặt sau khi chế tạo để

sử dụng được các hạt silica Sử dụng các phương pháp micelle có thể chế tạo được các hạt silica kích thước 10–100 nm [1,24,25,50,54,60,85,133] So với các phương pháp micelle thì phương pháp Stober đơn giản hơn vì không sử dụng hoạt động bề mặt, tuy nhiên các hạt chế tạo bằng phương pháp này thường có kích thước lớn hơn 50–2000 nm [24,25,50,60,81,133,141,146]

Van Blaaderen và cộng sự [135] lần đầu tiên đã đưa chất màu fluorescein isothiocyanate (FITC) vào trong hạt nano silica Họ liên kết phân tử chất màu với precursor APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) bằng liên kết đồng hóa trị, sau đó

sử dụng phương pháp Stober cho quá trình thủy phân và đồng ngưng tụ của liên kết chất màu – APTES với TEOS (triethoxysilane) để tạo hạt nano silica Sử dụng phương pháp Stober, các loại tâm màu khác nhau như: fluorescein isothiocyanate, Oregon green, rhodamine B (RB), rhodamine 6G (R6G), tetramethylrhodamine, Texas red, 6-carboxyl-X-rhodamine, and cyanine Cy5, Ru(bpy), Nile Red… đã được đưa vào trong hạt nano silica

Sử dụng phương pháp micelle đảo, Weihong Tan và cộng sự đã chế tạo được các hạt nano silica chứa các tâm màu khác nhau như : Tris(2,2 0-bipyridyl)dichlororuthenium(II) (RuBpy), tetramethylrhodamine (TMR), TMR-dextran hay fluorescein-dextran [116,118,130,163] Ngoài ra còn một số loại chất màu khác cũng được sử dụng để đưa vào trong hạt nano như: methylene blue (MB) [29], rhodamine 6G (R6G) [130], tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) [75] và rhodamine bisothiocyanate (RBITC) [136] Đối với các chất màu kỵ nước,

để người ta thường liên kết chúng với nhóm dextran – là nhóm ưa nước, sau đó đưa các chất màu này vào trong hạt nano silica bằng phương pháp micelle đảo, ví dụ như fluorescein, Alexa Fluor 647

Sử dụng phương pháp micelle thuận, Qian và cộng sự [103] đã chế tạo các hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ kị nước Nile Red, Prasad và cộng sự đã chế tạo hạt nano ORMOSIL chứa chất màu rhodamine 6G và một số chất màu khác [22,65]

Một trong các ứng dụng quan trọng nhất của các hạt nano trong y - sinh là

đánh dấu cả in vitro và in vivo tế bào ung thư

[33,41-43,54,56,58,69,71,86,90,94,105,107,114,117,142,143,148-152,164] Nhóm của Santra đã chế tạo được hạt nano silica kích thước 70 nm chứa chất màu FITC bằng phương pháp micelle đảo, sau đó được biến đổi bề mặt để có thể thâm nhập vào màng tế bào và mô [117] Các hạt nano chế tạo được có hiệu quả cao trong việc đánh dấu các tế bào ung thư phổi (A549) Kết quả cũng cho thấy, có thể sử dụng hạt nano này để chấn đoán và điều trị trong não thông qua thí nghiệm thành công trong não chuột Ông và cộng sự đã sử dụng hạt nano silica pha tâm màu FITC để nhận biết các tế bào ung thư như tế bào ung thư ở miệng [121], tế bào ung thư phổi [76,119,122] Weihong Tan và đồng nghiệp đã sử dụng hạt nano silica kích thước

60 nm chứa Rubpy đánh dấu các tế bào bạch cầu người [102,118,120] Tương tự như vậy, ông và cộng sự đã báo cáo một phương pháp để nhận biết các tế bào ung thư gan HEPG sử dụng hạt nano silica pha chất màu FITC [46] Zhao và cộng sự đã

chế tạo hạt nano silica chứa chất màu RuBpy và sử dụng để phát hiện vi khuẩn E

được chế tạo thành công và ứng dụng để hiện ảnh dây thần kinh não chuột [68] Xu hướng nghiên cứu hiện nay là chế tạo các hạt nano silica đa thành phần: chứa các tâm màu phát quang trong vùng hồng ngoại gần và thuốc, ưu tiên là thuốc chữa ung

thư để sử dụng trong các thí nghiệm in vivo: vừa theo dõi đường đi của thuốc, vừa

hiện ảnh khối u và vừa nhả thuốc để điều trị [35]

Trong số các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, E coli O157:H7 được

xem là rất nguy hiểm với liều gây độc thấp (10-100 tế bào) Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzym, đầu dò enzym, ELISA, kít chuẩn PCR [36,37] Tuy nhiên, tất cả các phương pháp nêu trên đều đòi hỏi thời gian (thường không dưới 14 giờ) và khó phát hiện chính xác số lượng vi khuẩn ở nồng độ

thấp Để khắc phục nhược điểm nêu trên, người ta đã sử dụng các hạt nano silica

chứa tâm màu như một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh và chính xác

số lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng miễn dịch huỳnh quang [27,124,129,147,160,164] Sử dụng các hạt nano silica chứa tâm màu Rubpy kích

thước 60-80nm, Weihong Tan cùng các cộng sự đã phát hiện được đơn vi khuẩn E

pháp phát hiện E coli O157:H7 trong thực phẩm mang tính pháp lý ở Việt Nam là

sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E coli O157:H7 trên đĩa

thạch SMAC sau khi ủ ấm ở 37o

C trong 24 giờ [16] Từ những khuẩn lạc nghi ngờ,

tiến hành kiểm tra các tính chất sinh hóa và ngưng kết đặc hiệu để khẳng định là

Trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong y – sinh học ở Việt Nam tiến triển mạnh, tập trung vào chế tạo và ứng

dụng các vật liệu như: chấm lượng tử, các hạt nano kim loại, các hạt nano từ, các

hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ và các hạt nano đất hiếm [50,51,95,131,156] Ngoài ra, các nghiên cứu chế tạo các hạt nano đa thành phần, đa chức năng: vừa làm chất đánh dấu, vừa có tác dụng điều trị cũng bắt đầu phát triển [51] Tại Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhóm của GS.TS Nguyễn Quang Liêm, PGS.TS Phạm Thu Nga đã chế tạo thành công các

chấm lượng tử CdSe/ZnS và CdTe/CdS phân tán trong nước, chấm lượng tử CuInS2, CuInS2/ZnS, CuIn(Zn)S2 và CuIn(Al)S2 tạo bước khởi đầu cho các ứng

dụng trong đánh dấu sinh học Nhóm của GS.TSKH Nguyễn Xuân Phúc, PGS.TS

Lê Văn Hồng, TS Hà Phương Thư đã chế tạo thành công các chất lỏng từ chứa các

hạt nano ứng dụng trong đánh dấu và diệt tế bào ung thư Nhóm của GS.TS Lê

Quốc Minh đã chế tạo vật liệu dây nano Eu/TbPO4.H2O nhằm ứng dụng trong y sinh đánh dấu huỳnh quang, thử nghiệm nhận dạng virus sởi hoặc rota Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, nhóm của GS.TSKH Nguyễn Hoàng Lương đã thành công trong việc dùng các thanh nano vàng để nhận

biết đặc hiệu tế bào ung thư vú Nhóm của PGS.TS Nguyễn Hoàng Hải đã ứng dụng

các hạt nano vàng trong chế tạo cảm biến sinh học xác định nồng độ của virus gây

bệnh với độ nhạy cao Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia

TP Hồ Chí Minh, nhóm của PGS.TS Đặng Mậu Chiến đã chế tạo được các loại

cảm biến nano sinh học, chế tạo vật liệu nano bạc có khả năng khử khuẩn ứng dụng

xử lý nước ao nuôi tôm…

Các hạt nano silica chứa tâm màu bắt đầu được chú ý nghiên cứu ở nước ta

từ 2007 và đã có một số kết quả cho tới thời điểm luận án bắt đầu được thực hiện:

TS Vũ Thị Thùy Dương và ThS Nguyễn Thị Vân đã chế tạo thành công các hạt nano silica chứa tâm màu RB, R6G, Cumarin 540 bằng phương pháp micelle thuận

và ứng dụng chúng trong đánh dấu không đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7 [1]

TS Chu Việt Hà đã sử dụng các hạt nano silica chứa tâm màu RB, Cy3 và Coumarin để nghiên cứu hiệu ứng truyền năng lượng giữa các hạt nano quang [2]

Nhà nước ta đã xét duyệt đề tài độc lập 14ĐTĐL 2009T/29 về "Nghiên cứu

ứng dụng các hạt nano phát quang vào việc đánh dấu tế bào để xác định số lượng

vi khuẩn gây độc trong thực phẩm" Đây là một trong những đề tài cấp nhà nước

đầu tiên trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ nano trong y – sinh do PGS.TS Tống Kim Thuần, Viện Công nghệ Sinh học chủ trì Mục đích của đề tài là sử dụng các

hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ làm chất đánh dấu vi khuẩn E coli O157:H7 -

một loại vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy - bằng phương pháp nhận biết miễn dịch huỳnh quang Mục tiêu của đề tài là xây dựng một phương pháp xác định nhanh số

lượng vi khuẩn E coli O157:H7, tiến tới chế tạo các kit phát hiện nhanh vi khuẩn

Nhóm Quang tử Nano Sinh học thuộc Trung tâm Điện tử lượng tử, Viện Vật lý đã tham gia đề tài này với vai trò cung cấp các hạt nano và xây dựng phương pháp quang phổ xác định số lượng vi khuẩn Mặt khác, đề tài 01/2/2011/HĐ-NCCBUD

hiệu ứng kích thích plasmon để phát hiện tế bào và mô với độ ngạy cao, nhằm ứng dụng vào việc chẩn đoán ở mức độ phân tử” do Viện Vật lý chủ trì đã được duyệt

với mục tiêu ứng dụng các hạt nano vàng và silica phát quang vào chế tạo các sensor sinh học độ nhạy cao

Để đáp ứng đòi hỏi của các để tài thì các hạt nano phải gắn kết được với

các kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E coli nói riêng và các phân tử sinh học đặc hiệu

nói chung để tạo các phức hệ hạt nano - phân tử đặc hiệu Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải chế tạo các hạt nano silica với các lớp tương thích sinh học để gắn kết được với các kháng thể đặc hiệu, đồng thời với việc nghiên cứu tính chất quang để xây dựng phương pháp quang phổ xác định số lượng vi khuẩn Đồng thời phải chế tạo được

các hạt silica ổn định lâu trong nước hoặc trong các đệm sinh học để sử dụng được trong các sensor sinh học

Hơn thế nữa, hiện nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu cơ bản về tính chất quang lý của các tâm màu nói chung trong hạt nano silica, đồng thời chưa có nghiên cứu chuyên sâu về tính chất quang lý của RB trong các hạt nano silica Hơn nữa, việc chức năng hóa và tạo các lớp tương thích sinh học cho các hạt nano silica cũng luôn là vấn đề cần nghiên cứu: mỗi ứng dụng đòi hỏi nhóm chức năng hoặc lớp tương thích sinh học phủ hợp Thí dụ: hạt silica dùng đề gắn kết với các kháng thể cần có các nhóm chức như: amine, thiol, carboxyl, nhưng để gắn hạt silica với phân

tử aptamer thì cần phải bọc hạt bằng streptavidin… Mặt khác, các hạt silica chứa các tâm màu sau khi chế tạo thường phải bảo quản dưới dạng khô vì chúng dễ bị tụ đám trong các môi trường nước - là môi trường của các ứng dụng sinh học Việc làm khô thành dạng bột là một công việc phức tạp, tốn kém, vì vậy việc tìm kiếm môi trường phân tán thích hợp cho các hạt nano silica chứa tâm màu là một vấn đề cần quan tâm giải quyết Đó là những vấn đề mang tính quốc tế mà luận án muốn giải quyết

Xuất phát từ những thực tế nêu trên, đề tài luận án được chọn là: “Chế tạo

và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y - sinh”

Mục tiêu nội dung nghiên cứu của luận án:

1 Chế tạo và nghiên cứu các tính chất quang của các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ định hướng ứng dụng làm chất đánh dấu sinh học

2 Ứng dụng các hạt nano silica chế tạo được làm chất đánh dấu để phát

hiện vi khuẩn E coli O157:H7 và tế bào ung thư vú bằng phương pháp miễn dịch

huỳnh quang

Với hai mục tiêu nêu trên, các nội dung nghiên cứu chính của luận án là:

1 Nghiên cứu chế tạo

a) Chế tạo hạt nano silica chứa chất màu RB bằng phương pháp micelle thuận với các nhóm chức năng khác nhau Bọc hạt nano silica bằng các protein bovine serum albumin (BSA) và Streptavidin (SA)

b) Chế tạo hạt nano silica chứa chất màu FITC bằng phương pháp micelle đảo và phương pháp Stober Khảo sát :

- Ảnh hưởng của lượng ethanol lên khả năng gắn kết của phân tử FITC với precursor APTES và chất lượng hạt chế tạo bằng phương pháp micelle đảo;

- Ảnh hưởng của lượng xúc tác lên chất lượng hạt chế tạo bằng phương pháp Stober;

- Chức năng hóa bề mặt các hạt nhận được Khảo sát ảnh hưởng của lượng precursor lên độ ổn định hạt

- Ảnh hưởng của môi trường phân tán lên độ ổn định của hạt

2 Nghiên cứu các tính chất quang của các hạt nano chế tạo được

- Ảnh hưởng của các nhóm chức và lớp bọc protein lên tính chất quang của các phân tử RB trong nền silica;

- Ảnh hưởng của kích thước hạt lên tính chất quang của các phân tử RB trong nền silica

Các tính chất được khảo sát là: hấp thụ, huỳnh quang, hiệu suất lượng tử, thời gian sống phát quang

3 Nghiên cứu ứng dụng các hạt nano silica trong đánh dấu sinh học bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

- Chế tạo phức hệ hạt nano – kháng thể đặc hiệu;

- Nhận biết đặc hiệu và xây dựng phương pháp phổ huỳnh quang để xác

định số lượng vi khuẩn E coli O157:H7

- Nhận biết đặc hiệu tế bào ung thư vú KPL4 và BT-474

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

- Các kết quả nghiên cứu của luận án mang lại các hiểu biết về các phương chế tạo, tính chất quang và khả năng ứng dụng của các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ RB và FITC làm chất đánh dấu sinh học;

- Các kết quả nghiên cứu chế tạo, tính chất quang và ứng dụng trong nhận biết tế bào ung thư vú của hạt nano silica chứa tâm màu RB mang tính quốc tế;

- Các kết quả ứng dụng đã chứng minh khả năng làm chất đánh dấu sinh học của các hạt nano chế tạo được;

- Việc chế tạo thành công hạt nano silica chứa FITC ổn định trong 3 tháng

mở đường cho việc đưa các hạt nano silica phát quang vào ứng dụng thực tế với vai trò là chất đánh dấu sinh học

Bố cục luận án:

Phần Mở đầu trình bày tổng quan về tình hình nghiên cứu các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ở trong và ngoài nước và các vấn đề nghiên cứu của luận án

Luận án được chia làm 4 chương:

Chương một trình bày tổng quan các kiến thức cơ bản về chất màu, hạt

nano silica và các phương pháp chế tạo hạt nano silica cũng như các ứng dụng hạt nano silica chứa tâm màu trong y – sinh học

Chương hai trình bày các phương pháp và thí nghiệm chế tạo và chức năng

hóa các hạt nano silica pha tâm màu RB và FITC Các phương pháp và thiết bị được

sử dụng để khảo sát các thông số và nghiên cứu tính chất quang của vật liệu và phát hiện đối tượng sinh học bằng miễn dịch huỳnh quang

Chương ba trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo và tạo lớp tương thích

sinh học của các hạt nano silica chứa tâm màu RB và FITC Các kết quả nghiên cứu tính chất quang của các hạt nano chứa tâm màu RB với các cấu trúc hóa học bề mặt

và kích thước khác nhau cũng được trình bày trong chương này

Chương bốn trình bày các thí nghiệm và kết quả ứng dụng hạt nano silica

chế tạo được trong đánh dấu đặc hiệu vi khuẩn E coli O157:H7, tế bào ung thư

KPL4 và BT-474

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN 1.1 Chất màu hữu cơ

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Các chất màu hữu cơ (các chất hữu cơ phát huỳnh quang) từ lâu đã được sử dụng trong các thí nghiệm hóa sinh và lý sinh, trong các nghiên cứu sinh học và y học như theo dõi phân tử, hiện ảnh tế bào, phân tích di truyền, nghiên cứu trình tự DNA… bằng các phương pháp huỳnh quang do độ nhạy của bản thân các kỹ thuật huỳnh quang

Các chất màu dùng trong đánh dấu sinh học là các chất màu hữu cơ chứa các liên kết đôi liên hợp, hấp thụ mạnh ánh sáng kích thích từ vùng tử ngoại đến gần hồng ngoại gần Cấu trúc hóa học của chúng được đặc trưng bởi tổ hợp các vòng benzen, vòng pyridin, vòng azine, vòng pyron,… nằm trong cùng một mặt phẳng Các chất màu phát quang mạnh nhất được chia làm 8 nhóm: xanthaene, polymethine, oxanzin, coumarine, azine và phthalocyamin Cấu trúc hóa học của một số chất màu điển hình dùng trong đánh dấu sinh học:

• Phân tử màu Rhodamine B và Rhodamin 6G:

Hình 1.1 C ấu trúc phân tử màu RB và R6G [132]

Phân tử màu tiêu biểu của họ này là Rhodamine - 590 chloride, còn gọi là Rhodamine 6G (R6G) R6G là phân tử màu quang tử đặc trưng nhất trong số các phân tử màu, bất kỳ phân tử màu nào phát quang tốt đều được so sánh với phân tử màu này do hiệu suất lượng tử của nó gần bằng 1

Phân tử màu Rhodamine B (RB) hay còn được gọi là Rhodamine 610 là một loại dẫn chất của tâm màu họ Rhodamine được sử dụng nhiều làm hoạt chất cho laser màu, các thí nghiệm quang phổ huỳnh quang và ứng dụng sinh học RB có

đỉnh hấp thụ tại 550 nm và đỉnh huỳnh quang tại 590 nm trong ethanol RB là phân

tử màu ion có tính phân cực không cao, tan ít trong nước Sơ đồ cấu trúc của phân

tử màu RB và R6G được chỉ ra ở Hình 1.1

• Phân tử màu Fluorescein Isothiocyanate (FITC)

FITC là một tâm màu được sử dụng rộng rãi trong y-sinh trong vai trò chất đánh dấu huỳnh quang FITC có hai đỉnh hấp thụ tại 454 nm và 480 nm, đỉnh huỳnh quang tại 521 nm Cấu trúc của phân tử màu FITC trình bày trên Hình 1.2

Hình 1.2 C ấu trúc hóa học của chất màu FITC

1.1.2 Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học

Các phân tử chất màu có rất nhiều trạng thái là các tổ hợp của các trạng thái điện tử, trạng thái dao động và trạng thái quay Do vậy không thể xác định chính xác các mức năng lượng của phân tử chất màu Dựa vào mẫu điện tử của Bohr, Jablonski đã đưa ra giản đồ các mức năng lượng đơn giản hóa phản ánh những đặc điểm quan trọng chủ yếu của các chuyển dời lượng tử trong phân tử màu (Hình 1.3)

Trong đó S0, S1, S2, là các trạng thái đơn điện tử (singlet) và các trạng thái điện tử bội ba (triplet) là T1, T2, tương ứng với số lượng tử spin toàn phần S = 0

và S = 1 Ở trạng thái singlet, hai điện tử ở cùng một mức năng lượng sẽ có spin đối song Ngược lại khi một điện tử nằm ở trạng thái triplet, spin của nó song song với spin còn lại Mỗi một trạng thái điện tử kích thích đơn (S1, S2, ) tồn tại một trạng thái bội ba T có năng lượng thấp hơn một chút Mỗi trạng thái điện tử bao gồm một tập hợp dày đặc nhiều mức dao động (đường nét liền) và nhiều mức quay (không vẽ trong hình) Thông thường khoảng cách giữa các mức dao động từ 1400 ÷ 1700

cm-1còn khoảng cách giữa các mức quay nhỏ hơn hai bậc Do va chạm liên kết nội phân tử và tương tác tĩnh điện với phân tử lân cận trong dung môi mà vạch dao động được mở rộng Các mức quay thì luôn mở rộng do va chạm nên dịch chuyển điện tử ở nhiệt độ phòng sẽ cho các phổ băng rộng Ở nhiệt độ phòng khi chưa bị

kích thích các phân tử chủ yếu nằm ở trạng thái dao động cơ bản S00 theo phân bố Boltzmann

Hình 1.3 C ấu trúc mức năng lượng và chuyển dời quang học của phân tử màu

Xét tương tác của phân tử chất màu với trường điện từ bên ngoài và theo quy tắc chọn lọc spin, những dịch chuyển giữa các trạng thái đơn là được phép, còn dịch chuyển giữa những trạng thái đơn và bộ ba là bị cấm Hình 1.3 mô tả các chuyển dời chủ yếu của phân tử màu, trong đó các mũi tên nét liền biểu diễn các chuyển dời quang học, các mũi tên nét đứt biểu diễn các chuyển dời phi quang học Như vậy, nhờ bơm quang học các phân tử chất màu có thể chuyển từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái có mức năng lượng cao hơn S1v của trạng thái điện tử kích thích S1 Ở trạng thái này các điện tử nhanh chóng (trong khoảng 10-11 s) hồi phục không bức

xạ xuống mức dao động thấp nhất S10 Trạng thái kích thích S10 có thời gian sống tương đối lâu (từ 10-9- 10-8s) Sự hồi phục bức xạ từ S10 → S0v được gọi là huỳnh quang

Trạng thái bội ba T1 là trạng thái siêu bền (thời gian sống cỡ 10-7s đến 10-6

s), nằm thấp hơn so với các mức điện tử kích thích Sự hồi phục bức xạ từ T1 → S0ν

được gọi là lân quang

Bên cạnh các dịch chuyển bức xạ còn có dịch chuyển không bức xạ Các quá trình dịch chuyển không bức xạ bao gồm sự tích thoát giữa các trạng thái cùng bội: singlet-singlet, triplet-triplet, gọi là sự dịch chuyển nội (internal conversion) và dịch chuyển không bức xạ giữa các trạng thái bội: singlet-triplet, gọi là dịch chuyển do

tương tác chéo nhau giữa các hệ (intersystem crossing) Sự dịch chuyển nội từ S2

(hoặc từ trạng thái đơn kích thích cao hơn) về S1xảy ra rất nhanh cỡ 10-11

s

1.1.3 Quang phổ của chất màu

Các chất màu được gọi là các chất phát quang bất liên tục Như đã nói ở phần trên, các phân tử chất màu hấp thụ bức xạ quang học nằm trong dải quang phổ từ tử ngoại đến gần hồng ngoại gần Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của chất màu là các băng rộng (30 ÷ 100 nm) ít cấu trúc và không trùng chập nhau

400 450 500 550 600 650 700 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

Hình 1.4 Ph ổ hấp thụ và huỳnh quang của RB [132]

Hình 1.4 trình bày phổ hấp thụ, huỳnh quang của chất màu RB trong dung môi ethanol Các phổ hấp thụ và bức xạ của các chất màu hữu cơ tuân theo các định luật huỳnh quang của phân tử; dạng phổ huỳnh quang không phụ thuộc vào bước sóng kích thích; cực đại và toàn bộ phổ huỳnh quang dịch chuyển về phía sóng dài

so với phổ hấp thụ, sự dịch chuyển này xác định bởi dịch chuyển Stockes Phổ huỳnh quang đối xứng gương với phổ hấp thụ Phần sóng dài của phổ hấp thụ thường chồng lên phần sóng ngắn của phổ huỳnh quang Sự hấp thụ ứng với các dịch chuyển từ trạng thái S0 (singlet) lên trạng thái triplet Ti (i= 1, 2, ) là bị cấm theo spin Băng hấp thụ sóng dài ứng với dịch chuyển S0 → S1 Các bước sóng ngắn hơn ứng với các dịch chuyển S0→ S2, S0 → S3,

Với thông lượng bức xạ nhỏ hơn 1026 photon cm-2s-1, các dải hấp thụ và bức

xạ của phân tử chất màu có thể coi là các băng mở rộng đồng nhất, nghĩa là phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của mỗi phân tử chất màu trong dung dịch trùng với phổ tương ứng của tất cả các phân tử chất màu trong dung dịch

Người ta cũng thấy rằng phổ hấp thụ và huỳnh quang của chất màu phụ thuộc rõ rệt vào dung môi hòa tan chất màu Tùy thuộc vào cấu trúc phân tử mà các

chuyển dời quang học của chất màu nằm giữa khoảng từ 200 nm đến 1200 nm (ứng với mức năng lượng 6,2 eV – 1,0 eV) Giới hạn ở phía sóng ngắn là độ bền quang học của phân tử màu (năng lượng liên kết phân tử), giới hạn ở phía sóng dài phụ thuộc vào độ bền nhiệt của phân tử

Huỳnh quang của chất màu được đặc trưng bởi các đại lượng:

thụ, được xác định theo công thức [73,74]:

Huỳnh quang của mẫu vật có thể bị phân cực do nguyên nhân bên trong hay bên ngoài của chất phát huỳnh quang khi kích thích bằng ánh sáng phân cực thẳng Mức độ phân cực của phát xạ được mô tả bởi độ phân cực [20]:

max min max min

Nói chung, ánh sáng huỳnh quang thường là phân cực thẳng, một số trường hợp phân cực elip Sự phân cực là kết quả của tính dị hướng của các tâm bức xạ hoặc là do ảnh hưởng của môi trường dị hướng

gian trung bình của một phân tử ở trên trạng thái kích thích trước khi hồi phục phát

xạ một photon Trên thực tế, sự phát huỳnh quang biểu diễn theo động học:

[S1] = [S1]0 e-t/τ (1.4)

Trong đó: [S1] là số các phân tử tồn tại ở trạng thái kích thích tại thời điểm t [S1]0 là số phân tử được kích thích lúc ban đầu, τ là thời gian để cường độ huỳnh quang suy giảm đi e lần Do đó τ thường được xác định từ phép đo suy giảm huỳnh quang

Thời gian sống huỳnh quang liên hệ với hiệu suất lượng tử theo công thức sau [73,74]:

Chất màu hữu cơ trong dung môi có thời gian sống huỳnh quang khoảng 1÷10 ns Nói chung, thời gian tắt dần huỳnh quang và hiệu suất lượng tử của chất màu phụ thuộc mạnh vào môi trường phân tán

1.1.4 Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ

Độ ổn định nhiệt và quang hóa của chất màu là một thông số rất quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng Tuy nhiên, các tính chất này thay đổi rất nhiều tùy theo cấu trúc hóa học mà thực tế không theo một quy luật chung Độ bền nhiệt liên quan chặt chẽ với sự hấp thụ bị giới hạn về phía sóng dài Chất màu hấp thụ bức xạ hồng ngoại có mức năng lượng ở trạng thái đơn hơi thấp hơn trạng thái siêu bền bội

ba Trạng thái bội ba có hai điện tử lẻ cặp do đó nó hoạt động rất mạnh và dễ dàng

bị oxy hóa bởi oxy tự do trong môi trường hoặc các tạp chất khác, thậm chí với các phân tử màu khác Kết quả là các phân tử màu ở trạng thái này sẽ tạo thành các sản phẩm do quá trình phân ly Tốc độ phân ly phụ thuộc vào hằng số phản ứng và nhiệt

Kết quả tính toán theo công thức trên với giả thiết năng lượng hoạt hóa EA =

24 kcal/mol tương ứng với bước sóng 1,2 µm số phân tử sẽ suy giảm còn ½ số lượng ban đầu Do đó, các chất màu hữu cơ có dải bước sóng bức xạ ở nhiệt độ phòng khó dài hơn 1,0 µm

Mặt khác, hoạt động của các chất màu hữu cơ tại vùng bước sóng ngắn bị giới hạn bởi vì các chất màu này chứa hai liên kết đôi trong cấu tạo phân tử Dải hấp thụ của các phân tử loại này là ≥ 220 nm, lớn hơn năng lượng liên kết phân tử Do

đó, tại vùng bước sóng này luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa sự phân hủy của chất màu và sự phát quang

Các chất màu hữu cơ nói chung có độ bền quang học kém, bị phân hủy quang sau vài lần chiếu sáng do bị oxy hóa bởi oxy tự do trong môi trường như đã nêu ở trên

1.1.5 Hiện tượng dập tắt vì nồng độ

Có nhiều chất huỳnh quang khi tăng dần nồng độ thì chúng phát quang mạnh dần, nhưng chỉ đến một nồng độ C0 nào đó Sau đó nếu nồng độ của chất huỳnh quang đó càng tăng thì hiệu suất càng giảm và khi nồng độ tăng đến một mức nào đó thì hiệu suất huỳnh quang giảm dần đến không Đó là hiện tượng tắt vì nồng độ Khi nồng độ chất màu cao, cường độ huỳnh quang bị dập tắt rất mạnh do va chạm của các phân tử màu ở trạng thái kích thích với các phân tử ở trạng thái cơ bản

Hình 1.5 Sự phụ thuộc của hiệu suất huỳnh quang vào nồng độ

Hiện tượng giảm hiệu suất huỳnh quang khi tăng nồng độ của chất huỳnh quang được gọi là hiện tượng tắt vì nồng độ Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất huỳnh quang vào nồng độ có dạng như Hình 1.5

Đầu tiên khi nồng độ mới bắt đầu tăng đến giá trị tới hạn C0 nào đó, hiệu suất huỳnh quang giữ không đổi Sau đó nếu tiếp tục tăng nồng độ của nó (C > C0) thì hiệu suất huỳnh quang giảm theo hàm exp:

Trong đó: η0 – hiệu suất huỳnh quang khi chưa có hiện tượng tắt vì nồng độ

C0 – giá trị giới hạn của nồng độ ứng với nó bắt đầu xảy ra tắt phát quang

và phụ thuộc vào môi trường

- Ảnh hưởng của nồng độ trên phổ huỳnh quang thường không lớn lắm Sự giảm hiệu suất huỳnh quang khi tăng nồng độ luôn đi đôi với sự thay đổi thời gian sống phát quang τ Ban đầu hiệu suất huỳnh quang giảm cùng tốc độ với thời gian sống phát quang nhưng khi nồng độ lớn thì hiệu suất huỳnh quang giảm nhanh hơn thời gian sống phát quang

Các hiện tượng này có thể giải thích một cách định tính dựa vào lý thuyết tập hợp các phân tử:

Khi nồng độ nhỏ, phổ hấp thụ chủ yếu là do các đơn phân tử quy định, vì thế phổ hấp thụ không thay đổi Khi nồng độ tăng, khoảng cách các phân tử thu hẹp thì các phân tử tương tác với nhau tạo thành các tập hợp phân tử (như các dimer, các kết tụ, ), khi đó phổ hấp thụ là do cả các phân tử tập hợp và các đơn phân tử quy định vì vậy phổ hấp thụ bị thay đổi

Dạng phổ huỳnh quang thay đổi rất ít khi thay đổi nồng độ của chất huỳnh quang, vì phổ huỳnh quang chỉ do các đơn phân tử quy định Tuy nhiên, do số lượng các đơn phân tử bị giảm đi nên cường độ huỳnh quang bị giảm khi nồng độ tăng Sự giảm cường độ huỳnh quang khi nồng độ tăng là một dấu hiệu quan trọng

để nhận biết hiện tượng dập tắt huỳnh quang do nồng độ

Sự giảm thời gian kéo dài của các trạng thái kích thích (thời gian sống phát quang) khi tăng nồng độ có thể được giải thích là do tác dụng nhiễu loạn của những phân tử không bị kích thích trên các phân tử bị kích thích cũng như do sự phá vỡ tính bền vững các trạng thái điện tử của những phân tử bị kích thích

1.1.6 Ảnh hưởng của môi trường

1.1.6.1 Ảnh hưởng của dung môi

Tính axit của dung môi liên quan đến đặc tính của các chất màu hữu cơ Phổ huỳnh quang của các chất màu bị thay đổi theo độ pH môi trường do mức độ ion của các chất màu khi phát quang [49] Một đặc tính quan trọng của chất màu là sự thay đổi trạng thái của điện tử π ở trạng thái kích thích cũng như ở trạng thái cơ bản

do sự tương tác của phân tử màu với dung môi Phức chất tồn tại ở trạng thái kích thích và không thể xác định được bằng phổ hấp thụ Phức chất này làm dập tắt huỳnh quang của chất màu hoặc tạo thành một dải huỳnh quang có xu hướng dịch

đỏ Ví dụ như phổ huỳnh quang của chất màu pyrylium trong ethanol bị dịch đỏ đến

10 nm khi cho thêm một lượng nhỏ dimethyl aniline [59]

1.1.6.2 Sự kết tụ các phân tử màu

Các phân tử màu trong các dung dịch có đặc tính phân cực có xu hướng tạo thành các dimmer hoặc bị kết tụ Các dimmer thường có dải hấp thụ mạnh tại vùng bước sóng ngắn hơn và có thêm một băng hấp thụ yếu ở vùng sóng dài hơn so với dải hấp thụ của monomer [123] Hiện tượng kết tụ này không chỉ làm ảnh hưởng đến cường độ phổ huỳnh quang mà còn làm giảm hiệu suất phát quang của các phân

tử màu Lực tương tác giữa các chất màu có khả năng phân cực đóng một vai trò quan trọng trong quá trình kết tụ các phân tử Các dung môi có hằng số điện môi cao sẽ làm giảm lực đẩy Coulomb giữa các phân tử dễ dàng dẫn đến sự kết tụ

1.2 Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ

1.2.1 Các hạt nano silica và latex

Hạt nano silica và latex (polystyrene) là các hạt nano chứa tâm màu Dựa trên nền hạt là silica hay polymer người ta chia thành hạt nano silica và hạt nano polymer hay hạt latex [24,52,57,77,78] Chất màu có thể được gắn trên bề mặt hoặc đưa vào bên trong hạt nano silica hay latex [93] So với các chất màu hữu cơ thì các hạt nano này có độ bền quang cao hơn vì nền polymer và silica bảo vệ các chất màu hữu cơ khỏi oxy hoá và phân hủy quang Độ chói của tín hiệu huỳnh quang của của các hạt nano silica và latex có thể được điều khiển bằng số phân tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang

Vì vậy, hạt nano silica và latex có độ bền quang tương đối tốt và không nhấp nháy [24,52,57,77,78] Ví dụ, các chất màu pyrene trong hạt polystyrene có cường độ huỳnh quang cao gấp hơn 40 lần ở trong dung môi Những ưu điểm nổi bật này làm cho chúng có ứng dụng rất lớn trong phân tích sinh học

So sánh với các hạt nano

polymer, các hạt nano silica có một

vài ưu điểm Các hạt silica dễ dàng

tạo đơn hạt hơn trong quá trình chế

tạo do các hạt latex có hiện tượng

không mong muốn là kết đám Hơn

nữa, các hạt silica với nhóm –OH trên

bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá

học để tạo các nhóm chức có khả

năng liên kết đặc hiệu với các phân tử

sinh học như là amin (-NH2), carboxyl

(-COOH) hay thiol (-SH) Trong khi

đó, các hạt latex có tính kỵ nước làm cho việc gắn kết với các phân tử sinh học trở nên phức tạp Để khắc phục những nhược điểm này, các lõi kỵ nước của hạt latex được yêu cầu bọc thêm các vỏ ưa nước polymer như polyethylene glycol (PEG), protein như bovine serum albumin (BSA) Thêm vào đó, độ pH của môi trường thay đổi không làm các hạt silica bị phồng lên (swelling) và thay đổi độ xốp (porosity change), trong khi đó các hạt latex bị phồng làm cho các chất màu bị thoát ra ngoài [89] Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các chất đánh dấu sinh học mới

Hình 1.7 Sự phát xạ huỳnh quang của các hạt nano silica chứa các loại tâm

màu khác nhau

1.2.2 Các hạt nano silica/ormosil

Trong những năm gần đây, các hạt nano silica/ormosil (organically modified silicate) được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng y - sinh học như truyền tải gen như một chất mang DNA, chất mang thuốc trong trị liệu quang động học PDT (Photodynamic Therapy) và các lĩnh vực quang tử khác [72,96,98,111,160] So với các hạt nano silica, các hạt nano silica/ormosil có vài ưu điểm: mặc dù nền thủy tinh silica trong suốt về mặt quang học nhưng do được chế tạo bằng phương pháp sol-

gel nên có nhược điểm là có nhiều lỗ xốp nên tính đồng nhất quang học không cao,

Hình 1.6 Các cách phổ biến kết hợp tâm màu vào các hạt nano silica và latex [93]