nghiên cứu bệnh héo vàng do nấm fusarium sp hại hành, tỏi và thử nghiệm phòng trừ bệnh bằng vi khuẩn đối kháng

Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu thì nhiều vùng đã tiến hành đầu tư thâm canh nâng cao năng suất cho các vùng trồng hành tỏi cùng với quá trình phát triển sản xuất là sự phát ph

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -

TRẦN THỊ BÍCH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG DO NẤM FUSARIUM SP

HẠI HÀNH, TỎI VÀ THỬ NGHIỆM PHÒNG TRỪ BỆNH

BẰNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -

TRẦN THỊ BÍCH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG DO NẤM FUSARIUM SP

HẠI HÀNH, TỎI VÀ THỬ NGHIỆM PHÒNG TRỪ BỆNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa từng được sử dụng trong bất kỳ một báo cáo khoa học nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho tôi thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Trần Thị Bích Phương

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị trong cán bộ thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được học hỏi, trau dồi kiến thức, tích lũy được nhiều kinh nghiệm quý báu cho công việc của tôi sau này

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè

đã hết lòng giúp đỡ, ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn

Trân Thị Bích Phương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1Tình hình sản xuất hành tỏi trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.1 Tình hình sản xuất hành tỏi trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình sản xuất hành tỏi ở Việt Nam 5

1.2 Những nghiên cứu về nấm Fusarium trên hành tỏi 1.2.1 Nấm Fusarium oxysporum 8

1.2.2 Nấm Fusarium proliferatum 14

1.3 Những nghiên cứu về phòng trừ Fusarium bằng phương pháp sinh học 17

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phạm vi nghiên cứu 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.4 Vật liệu nghiên cứu: 22

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 22

2.4.2 Một số môi trường chuyên cho phân lập Fusarium sp (John and Brett, 2006) 23

2.4.3 Vật liệu nghiên cứu trong nhà lưới 23

2.5 Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu: 23

2.6.Phương pháp nghiên cứu 23

2.6.1 Phương pháp phân lập nấm Fusarium gây bệnh héo vàng

trên hành: 23

2.6.2.Phương pháp lây bệnh nhân tạo 24

2.6.3.Phương pháp tách chiết DNA tổng số 25

2.6.4.Phương pháp nhân gen ITS phục vụ việc giải trình tự 26

2.6.5.Phương pháp phân tích trình tự 28

2.6.6.Phương pháp nhuộm mô 28

2.6.7.Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn với nấm Fusarium sp. 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Điều tra bệnh héo vàng trên hành tại Hải Dương và Hưng Yên 31

3.2 Phân lập nấm Fusarium sp trên hành. 32

3.3 Đặc điểm hình thái của các nguồn nấm Fusarium sp. 33

3.4 Kết quả lây bệnh nhân tạo theo phương pháp trộn thạch nấm vào đất trồng hành 36

3.5 Kết quả lây bệnh nhân tạo theo phương pháp nhúng hành vào dịch bào tử nấm bệnh 38

3.6 Thí nghiệm đặt ẩm hành 40

3.7 Thí nghiệm đặt ẩm tỏi 42

3.8 Kết quả định danh nấm Fusarium sp. 44

3.8.1.PCR và giải trình tự 44

3.8.2.Tìm kiếm trên Ngân hàng Gen 45

3.9 Đánh giá hình thái 2 của 2 mẫu nấm HC 1-2 và HC 1-3 46

3.10 Kết quả thí nghiệm thử khả năng nhiễm bệnh của một số giống hành tỏi được trồng hàng năm tại Hải Dương, Hưng Yên và Bắc Ninh 49

3.11 Kết quả thí nghiệm thử khả năng nhiễm bệnh của một số giống hành đang được khảo nghiệm tại Hải Dương 50

3.12 Kết quả thí nghiệm thử khả năng bị nhiễm bệnh với các nồng độ bào

tử nấm bệnh khác nhau của các giống hành đang được khảo nghiệm 52

3.13 Kết quả thí nghiệm đối kháng của nấm Fusarium sp với các nguồn vi khuẩn theo phương pháp cấy vạch 54

3.14 Kết quả thí nghiệm đối kháng của các nguồn vi khuẩn với các nguồn nấm Fusarium sp theo phương pháp giếng 55

3.15 Kết quả thí nghiệm đối kháng của các nguồn vi khuẩn với các nguồn nấm Fusarium sp theo phương pháp chiết bằng n-hexan 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

Kết luận 59

Đề nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

Tài liệu trong nước 61

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

F.oxysporum: Fusarium oxysporum

F.proliferatum: Fusarium proliferatum

T.harzianum: Trichoderma harzianum

T.viride: Trichoderma viride

T koningii : Trichodema kiningii

T aureoviride: Trichoderma aureoviride

T pseudokoningii: Trichoderma pseudokiningii

B.subtilis: Bacillus sutilis

CLA: Môi trường thạch lá cẩm chướng

PGA: Môi trường thạch khoai tây đường glucose

PDB: Môi trường khoai tây lỏng

VK: vi khuẩn

WA: Môi trường thạch nước cất

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1: Các loài Fusarium oxysporum gây héo trên cây trồng ở Việt Nam 10

3.1: Điều tra bệnh héo trên hành tại Hải Dương và Hưng Yên 31

3.2: Phân lập nấm Fusarium sp trên hành 32

3.3: Đặc điểm hình thái của 11 nguồn nấm Fusarium sp. 34

3.4: Hình thái bào tử của nấm Fusarium sp. 35

3.5: Kết quả lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp trộn thạch nấm vào đất 37

3.6: Kết quả lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp dịch bào tử 39

3.7 Kết quả thí nghiệm đặt ẩm hành trong dịch bào tử nấm 41

3.8 Kết quả thí nghiệm đặt ẩm tỏi 42

3.9 Kết quả giải trình tự các mẫu nấm Fusarium sp. 45

3.10 Kết quả tìm kiếm loài gần gũi trên GenBank của 2 mẫu HC1-2 và HC1-3 dựa trên trình tự vùng ITS 46

3.11: Đặc điểm hình thái của một số nấm Fusarium sp thuộc phức hợp loài G fujikuroi 47

3.12 Kết quả lây bệnh nhân tạo của một số giống hành, tỏi 49

3.13 Kết quả lây bệnh nhân tạo của một số giống hành đang được khảo nghiệm 51

3.14 Kết quả lây bệnh nhân tạo với các nồng độ bào tử nấm bệnh khác nhau 52

3.15 Thí nghiệm đối kháng của các dòng vi khuẩn với nấm HC 1-2 theo phương pháp cấy vạch 54

3.16 Thí nghiệm đối kháng của các dòng vi khuẩn với nấm HC 1-3 theo phương pháp cấy vạch 54

3.17 Thí nghiệm đối kháng của các nguồn vi khuẩn với nguồn nấm Fusarium sp theo phương pháp giếng sau 5 ngày 56

3.18 Thí nghiệm đối kháng của các nguồn vi khuẩn với nguồn nấm Fusarium sp bằng phương pháp chiết với n-hexan sau 5 ngày 57

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1: Nấm Fusarium oxysporum (John and Brett, 2006) 9

2: Nấm Fusarium proliferatum (John and Brett, 2006) 15

3.1: Điều tra hành tại Hải Dương, Hưng Yên 32

3.2: Các mẫu hành héo thu được và phân lập hành 33

3.3: Bào tử và tản nấm Fusarium sp đã phân lập được 36

3.4: Lây bệnh cho hành bằng phương pháp trộn nấm Fusarium sp vào đất 38

3.5: Lây bệnh nhân tạo trên hành bằng phương pháp dịch bào tử 40

3.6: Kết quả lây bệnh bằng phương pháp đặt hành trong bông thấm dịch nấm Fusarium sp sau 10 ngày lây bệnh 41

3.7: Lây bênh bằng phương pháp đặt ẩm tỏi 43

3.8: Phân lập lại tỏi được lây bệnh bằng phương pháp đặt ẩm 43

3.9: Kiểm tra nấm bệnh phát triển trong mô tỏi thí nghiệm 44

3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR 45

3.11: Đặc điểm tế bào sinh bào tử nhỏ và cách sinh bào tử nhỏ của 2 mẫu nấm HC1-2 và HC1-3 48

3.12: Kết quả lây bệnh nhân tạo của một số giống hành, tỏi 50

3.13 Lây bệnh nhân tạo với một số giống hành được lựa chọn 51

3.14 Lây bệnh nhân tạo với nguồn nấm HC 1-2 53

3.15 Lây bệnh nhân tạo với nguồn nấm HC 1-3 53

3.16 Khả năng đối kháng của một số dòng vi khuẩn với nấm Fusarium sp. 55

3.17 Thí nghiệm đối kháng của các dòng vi khuẩn theo phương pháp giếng 56

3.18 Thí nghiệm đối kháng của vi khuẩn bằng dịch chiết n-hexan với 58

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây hành (Allium fistulosum) là một trong những loại cây gia vị quan

trọng ở nước ta cũng như nhiều quốc gia khác trên thế giới Bên cạnh việc được dùng làm gia vị, cây hành còn được dùng làm thành phần quan trọng trong nhiều bài thuốc để chữa bệnh cho người như: giảm đau đầu, giảm ho, giảm đau họng, chữa bệnh thiếu máu hay ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư…Trong những năm gần đây, sản phẩm hành củ của nước ta không những đáp ứng đủ nhu cầu trong nước mà còn được xuất khẩu đến nhiều nước trên thế giới và được thị trường ưa chuộng nhờ có chất lượng tốt

Cây tỏi (Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ Hành, nghĩa là có họ

hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây, v.v và cũng được con người sử dụng làm gia vị, thuốc, rau như những loài họ hàng của nó Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước đã phát hiện ra nhiều công dụng của tỏi đối với sức khỏe của con người Trong tỏi có chất Alixin có tác dụng diệt khuẩn Trong y học người ta đã dùng tỏi để chữa bệnh thương hàn, tả lỵ, bạch hầu Tỏi còn chữa đầy hơi bằng cách ăn trực tiếp hoặc giã nhỏ xoa vào bụng khi bị cúm thì ăn tỏi sống hoặc uống rượu tỏi cũng khỏi Tỏi được cho là có tính chất kháng sinh và tăng khả năng phòng ngừa ung thư, chống huyết áp cao, mỡ máu ở con người Một số dân tộc trên thế giới tin rằng tỏi giúp họ chống lại ma, quỷ, ma cà rồng

Theo Tạ Thị Thu Cúc và cộng sự ngày nay hành tỏi được trồng nhiều ở Tiên Sơn - Bắc Ninh, Mê Linh, Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận và Đà Lạt Hành, tỏi có thời gian sinh trưởng ngắn, đáp ứng được yêu cầu tăng vụ, chuyển đổi cơ cấu cây trồng cho nông nghiệp Và là cây trồng rất thích hợp cho vụ thu đông và đông xuân sau khi thu hoạch lúa mùa ở miền Bắc nước ta Trong những năm gần đây diện tích rau màu

vụ đông đã tăng dần do cơ cấu chuyển đổi cây trồng ở vùng ĐBSH và phổ biến nhất là các tỉnh: Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Vĩnh phúc, Bắc Giang cây rau màu đã phát triển mạnh thay thế dần cây có thu nhập thấp nhằm áp ứng nhu cầu tiêu dùng và suất khẩu Ngoài những cây rau truyền thống như: Cà chua, su

hào, bắp cải, cây đậu ăn rau thì cây hành, cây tỏi đang được đầu tư phát triển sản xuất (Tạ Thu Cúc et al., 2000)

Ở nước ta điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, mưa nhiều rất thích hợp cho các bệnh do nấm gây ra Đặc biệt là bênh héo vàng trên hành

tỏi do nấm Fusarium sp gây ra Trong thực tế bệnh có thể phát triển gây hại đến

nhiều vùng trồng hành tỏi Việc phòng chống dịch hại cho cây trồng nông nghiệp

đã và đang là nhân tố quan trọng có ý nghĩa quyết định trong việc mở rộng diện tích, thâm canh tăng vụ, tăng năng suất và hiệu quả sản xuất nông nghiệp Bệnh

héo vàng trên hành tỏi do nấm Fusarium sp gây ra có nguồn gốc từ đất phổ biến

và gây hại nghiêm trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Bệnh héo vàng cũng khó phòng trừ do nấm có khả năng tồn tại trong đất, trong cơ thể cây ký chủ, tàn

dư thực vật, hạt giống, củ giống Nấm Fusarium sp có phổ ký chủ rất rộng gây

hại trên cà chua, khoai tây, dưa chuột, hành ta, tỏi ta Và trên đồng ruộng cũng

khó để phân biệt được héo vàng do Fusarium sp gây ra trên hành tỏi so với các

triệu chứng héo khác Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu thì nhiều vùng

đã tiến hành đầu tư thâm canh nâng cao năng suất cho các vùng trồng hành tỏi cùng với quá trình phát triển sản xuất là sự phát phát triển của các loài vi sinh vật gây bệnh mà chủ yếu là do nấm Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu

nào về bệnh héo vàng do Fusarium sp gây ra trên hành tỏi

Xuất phát từ thực tiễn trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu

bệnh héo vàng do nấm Fusarium sp hại hành, tỏi và thử nghiệm phòng trừ

2.2 Yêu cầu của đề tài

- Xác định bệnh do nấm Fusarium trên và hành tỏi tại Hưng Yên và Hải

Dương về mức độ nhiễm và tỷ lệ nhiễm

- Đánh giá tính gây bệnh của nấm Fusarium trên hành tỏi

- Đánh giá khả năng kháng và nhiễm nấm Fusarium trên một số giống

hành tỏi

- Xác định loài nấm Fusarium thông qua hình thái và giải trình tự

- Đánh giá khả năng phòng chống nấm Fusarium của một số vi khuẩn đối

- Thử nghiệm và xây dựng các biện pháp phòng trừ bệnh héo vàng hại hành,

tỏi trong điều kiện invitro

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Góp phần xây dựng quy trình quản lý dịch hại tổng hợp trên hành, tỏi làm giảm tỷ lệ bệnh héo vàng gây ra, nhằm nâng cao năng suất góp phần và thu nhập cho người dân vùng trồng hành, tỏi tại các địa phương chuyên trồng rau màu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình sản xuất hành tỏi trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình sản xuất hành tỏi trên thế giới

Tỏi được cho là có nguồn gốc từ Trung Á (Tiên Sơn, Trung Quốc) sau đó lan đến khu vực Địa Trung Hải trong thời cổ đại và đã được biết đến ở Ai Cập trong năm 3000 TCN Đây cũng là một cây cổ đại ở Ấn Độ và Trung Quốc Người Tây Ban Nha, trên thế giới ở các vĩ độ khác nhau, từ vĩ độ 5 đến 50 ở cả hai bán cầu, nhưng phổ biến nhất ở Địa Trung Hải và Trung Quốc

Trên thế giới, hành tỏi được trồng trên 175 quốc gia, đem lại nguồn thu nhập lớn cho người sản xuất Theo hiệp hội hành tỏi Hoa Kỳ, năm 2004 diện tích trồng hành tỏi trên thế giới là 2.680.000 ha, năng suất 17,77 triệu tấn/ha, sản lượng 47.670.000 tấn Nước dẫn đầu về diện tích là Hoa Kỳ, về sản lượng là Trung Quốc (chiếm 31%) và năng suất là Nga Ngoài ra Trung Quốc còn là nước trồng tỏi chiếm 1/2 châu Á, 1/3 thế giới (USDA, 2006)

Hiện nay diện tích trồng hành tỏi ngày càng có chiều hướng ngày càng tăng Tại nước Mỹ có khoảng 18.000 vùng trồng hành tỏi Ở hầu hết các loại hành tỏi phù hợp với vùng khí hậu mát mẻ nên được trồng nhiều ở Miền Bắc Đài Loan Năm 2002 khoảng 179.500 ha đất được sử dụng trồng rau tập chung chủ yếu ở các tỉnh Vân Lâm, Trương Hoa, Đài Nam và Chiayi sản lượng đạt 3.462.000 tấn với năng xuất trung bình khoảng 19.300kg/ha trong đó có tỏi Bên cạnh đó Braxin luôn là quốc gia đi đầu trong sản xuất nông sản với 2,4 triệu tấn trị giá 518 triệu USD, tăng 28% về khối lượng và 11% về giá trị với cùng kỳ năm

2005 Trong đó lúa mỳ đạt 272 triệu USD, Lê đạt 23 triệu USD, tỏi trên 21 triệu (Medine and García, 2007)

Theo thống kê của tổ chức FAO, trong năm 2007, diện tích trồng tỏi trên toàn thế giới là 1.072.000 ha và sản lượng đạt 11,8 triệu tấn, trong đó sản lượng ở khu vực Châu Á là 10,4 triệu tấn, chiếm 88,1% so với tổng sản lượng trên thế giới Đến năm 2010, diện tích trồng tỏi trên toàn thế giới đã tăng lên 1.199.929 ha, với tổng sản lượng 17.674.893 tấn/năm Trong đó, Trung

Quốc là nước sản xuất tỏi lớn nhất thế giới với sản lượng khoảng 13.664.069 tấn/năm (chiếm hơn 77,3% sản lượng của thế giới), kế đến là Ấn Độ (khoảng 833.970 tấn/năm) và Hàn Quốc (271.560 tấn/năm)

Về năng suất, theo số liệu thống kê FAO (2010), năng suất tỏi bình quân của các quốc gia trên thế giới dao động từ 4,4 - 30,0 tấn/ha Trong đó, Tajikistan

là quốc gia đạt năng suất cao nhất (đạt 30,0 tấn/ha), kế đến là Ai Cập (đạt 25,3 tấn/ha) và Trung Quốc (đạt 20,6 tấn/ha) Tuy nhiên, ở khía cạnh ứng dụng khoa học công nghệ để nâng cao năng suất tỏi phải kể đến Trung Quốc Bởi vì, tuy năng suất tỏi của Tajikistan và Ai Cập đạt cao hơn so với Trung Quốc nhưng diện tích gieo trồng lại quá ít, trong khi đó, với diện tích gieo trồng là 664.144 ha nhưng năng suất bình quân của Trung Quốc đã đạt đến 20,6 tấn/ha

Theo thống kê về hành tỏi của Olam thì năm 2012 sản lượng hành tỏi tăng cao Trong đó, sản lượng hành đạt sấp sỉ 83 triệu tấn, trong đó Trung Quốc là nước đi đầu về sản lượng chiếm 27% sản lượng của toàn thế giới, Ấn Độ cũng có sản lượng cao chiếm 20% sản lượng toàn thế giới, tiếp theo là Mỹ chiếm 4% sản lượng toàn thế giới Sản lượng tỏi đạt sấp sỉ 25 triệu tấn, trong só Trung Quốc chiếm đến 42% sản lượng tỏi toàn thế giới, Ấn Độ đứng thứ 2 chiếm 2% sản lượng toàn thế giới (Olam, 2014)

1.1.2 Tình hình sản xuất hành tỏi ở Việt Nam

Tại Việt Nam, tỏi được du nhập khá lâu và được trồng phổ biến trong cả nước, nhưng tập trung chủ yếu ở các tỉnh, thành là Hải Dương, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Quảng Ngãi và Ninh Thuận với tổng diện tích khoảng 6.000 ha Đặc biệt,

mặc dù các giống tỏi đang được trồng ở nước ta đều có nguồn gốc từ nhập nội (vì trung tâm khởi nguyên của cây tỏi là khu vực Trung Á), nhưng có thể do quá trình chọn lọc tự nhiên đã hình thành các giống tỏi địa phương có giá trị sử dụng cao Tuy nhiên, đến nay năng suất bình quân chỉ mới đạt từ 6 - 8 tấn/ha, thuộc nhóm các quốc gia có năng suất tỏi trung bình trên thế giới và còn thấp so với tiềm năng vốn có về khí hậu cũng như điều kiện đất đai

* Đảo Lý Sơn - Quảng Ngãi

Trong bài báo “ Quảng Ngãi và các huyện trong tỉnh “ của Uỷ ban Nhân dân tỉnh Quảng Ngãi cho thấy rằng việc trồng hành, tỏi vẫn rất thịnh đạt, hành tỏi Lý Sơn ngon nổi tiếng không chỉ trong phạm vi tỉnh Quảng Ngãi Nhờ hành tỏi, nông dân ở Lý Sơn có đời sống tương đối ổn định Thời điểm 2005, diện tích trồng tỏi

là 297ha, sản lượng 1.557 tấn (trong đó xã An Vĩnh 146ha, 796 tấn; xã An Hải 151ha, 761 tấn); diện tích trồng hành 282,4ha, sản lượng 1.790 tấn (trong đó xã

An Vĩnh 139ha, 898 tấn; xã An Hải 117,4ha, 671 tấn; xã An Bình 26ha, 221 tấn)

* Huyện Ninh Hải Tỉnh Ninh Thuận

Theo Bạch Thương của Sở kế hoạch và đầu tư Ninh Thuận trong bài báo

“Triển vọng mô hình Tổ hợp tác sản xuất hành tỏi Khánh Tân” cho biết Khánh

Tân (Ninh Thuận) là vùng đất pha cát, tơi xốp giàu mùn và khoáng chất, có giờ nắng trong ngày cao nên rất thích hợp với cây trồng hành, tỏi toàn thôn có khoảng 200-250 ha diện tích chuyên canh cây hành, tỏi cung cấp cho thị trường mỗi năm từ 500 đến 1.000 tấn, trong đó có 50% là hành lá làm rau Khánh Tân được thiên nhiên ưu đãi, có khí hậu, thổ nhưỡng thích hợp với hành, tỏi, ngay cả trồng trong mùa mưa hành, tỏi vẫn rất ít khi bị nấm bệnh Trồng hành, tỏi là nghề truyền thống có từ lâu đời ở đây, với đặc điểm củ tỏi thơm nồng khó nơi nào bằng, còn củ hành nhổ lên dù để lâu cũng không sợ hư thối

* Huyện Sơn Động Tỉnh Bắc Giang

Theo báo Bắc Giang trong bài “Cây tỏi trên đất Giáo Liêm” cho biết trước đây, nông dân xã Giáo Liêm - Sơn Động - Bắc Giang chỉ cấy hai vụ lúa Nhưng nay, đồng ruộng được canh tác thêm vụ thứ ba trong năm với cây trồng

chính là tỏi, loại cây chịu hạn tốt và cho hiệu quả kinh tế cao Thấy trồng tỏi có hiệu quả kinh tế cao, nhiều hộ đã trồng tỏi vào vụ đông

* Huyện Nam Sách Tỉnh Hải Dương

Theo Bảo Trung và Đại Hoàng của báo điện tử Nhân dân trong bài báo

“Nông dân Hải Dương làm giàu trên đất thuần nông”cho biết xã Nam Trung

huyện Nam Sách tỉnh Hải Dương nhờ trồng tỏi kết hợp với hai vụ lúa đã đưa diện tích bình quân của xã đạt hơn 55 triệu/ha/năm, vụ tỏi 2004- 2005 xã thu hoạch khoảng 4,4 tỷ đồng đến năm 2005 – 2006 tăng 7,5 tỷ đồng Nhờ biết tận dụng và phát huy thế mạnh của địa phương nên nếu năm 2000 thu nhập bình quân theo đầu người của xã chỉ đạt 4,5 triệu đồng/người/năm thì đến 2005 thu nhập bình quân đầu người đạt 6,3 triệu đồng/người/năm Có đến 60- 70% gia đình giàu lên nhờ cây tỏi, có những hộ đã đưa được thương hiệu hành tỏi của quê hương vượt khỏi lũy tre làng Ở xã đã thành lập nhiều cơ sở sản xuất chế biến tỏi

và các sản phẩm được chế biến từ tỏi đã được xuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản

* Huyện Kinh Môn Tỉnh Hải Dương

Theo Nguyễn Thị Thuận, Sở Khoa học và công nghệ Hải Dương trong bài báo “Cây hành Kinh Môn cần thương hiệu” cho thấy nếu như trước đây, người dân Kinh Môn chỉ trồng cây hành với diện tích nhỏ, thu nhập chủ yếu từ cấy 2 vụ lúa, thì nay người dân Kinh Môn coi vụ đông là vụ sản xuất chính, trong đó xác định cây hành là cây trồng chủ lực mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 2-3 lần lúa Vụ đông 2014, toàn huyện có gần 2.500ha trồng hành, chiếm hơn 80% diện tích trồng cây vụ đông Giá trị sản xuất bình quân đạt hơn 100 triệu đồng/ha

* Huyện Quỳnh Phụ Tỉnh Thái Bình

Theo Vũ Mạnh báo điện tử Thái Bình trong bài báo “Quỳnh Hải vụ đông đến sớm” cho thấy rằng tỉnh Thái Bình cũng là nơi có diện tích trồng tỏi lớn của

cả nước Riêng xã Quỳnh Hải huyện Quỳnh Phụ là xã luôn dẫn đầu huyện về phong trào trồng cây vụ đông Năm 2005 toàn xã phấn đấu gieo trồng 275 ha cây công nghiệp trong đó diện tích trồng tỏi chiếm 15 ha

* Huyện Phù Yên Tỉnh Sơn La

Theo Quốc Tuấn của báo điện tử Sơn La trong bài “Sớm tạo dựng thương hiệu cho tỏi tía Phù Yên “ cho thấy huyện Phù Yên tỉnh Sơn La có sản phẩm tỏi tía, nhất là tỏi một củ hay còn gọi là tỏi 1 nhánh đã trở thành đặc sản của Phù Yên, thường được người tiêu dùng trong và ngoài tỉnh chọn mua Từ năm 2005-

2007, diện tích trồng tỏi của Phù Yên đạt cao nhất từ 150 đến 250 ha Sau giai đoạn đó đến nay, diện tích giảm dần, dao động từ 40-60 ha và hiện là 50 ha

1.2 Những nghiên cứu về nấm Fusarium trên hành tỏi

1.2.1 Nấm Fusarium oxysporum

1.2.1.1 Phân loại nấm Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum thuộc:

Loài : Fusarium oxysporum

Theo Burgess (1994) đã đưa ra cơ sở phân loại nấm F.oxysporum gồm 7

chỉ tiêu như sau:

1) Hình thành bào tử lớn

2) Hình thành bào tử nhỏ

3) Hình dạng và kiểu bào tử nhỏ

4) Kích thước của bào tử nhỏ

5) Sự có mặt hay không có mặt của bào tử hậu trên môi trường PGA

6) Đường kính tản nấm trên môi trường PGA

7) Hình thái tản nấm

Nấm F oxysporum có phạm vi ký chủ rất rộng lớn và tồn tại nhiều dạng khác nhau trong đất Mặt khác, thành phần và sự phân bố của nấm F oxysporum

trong đất có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện và mức độ gây hại trên cây ở mỗi vùng sinh thái khác nhau

Đặc điểm sinh học của nấm F oxysporum rất rõ rệt, sợi nấm phát trển

mạnh, màu sắc biến đổi từ màu trắng đến màu tím violet, tản nấm thường sinh sắc tố màu hồng đến màu tím đậm trên môi trường PDA Bào tử lớn hình thành trên môi trường PDA có kích thước ngắn trung bình hoặc dài, phần lớn có 3 vách ngăn mỏng, một đầu nhọn hoặc thon nhọn, một đầu hình bàn chân Bào tử nhỏ hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn nhánh ngắn thường không có ngăn ngang, đôi khi có một ngăn Hình dạng bào tử thay đổi từ hình ovan, hình elip hoặc hình quả thận Hậu bào tử thường hình thành hầu hết trên các mẫu phân lập sau 3 – 6 tuần nuôi cấy trên bề mặt thạch của môi trường PDA (Burgess, 1994)

Nấm có 3 chủng sinh lý Chủng 1 phân bố rộng khắp thế giới; chủng 2 được tìm thấy ở bang Ohito, Florida, Australia, Brazil, Anh, Meehico; chủng 3

có ở Brazil, California và Florida (Hoda et al., 2000)

Hình 1: Nấm Fusarium oxysporum (John and Brett, 2006)

A-B: bào tử lớn C-D: bào tử nhỏ E-F: bào tử nhỏ trên môi trường CLA

Mỗi dạng loài F oxysporum thường chỉ gây héo trên một loài ký chủ Một

số dạng loài Fusarium gây héo và các bệnh do chúng gây ra ở Việt Nam Cụ thể:

Bảng 1: Các loài Fusarium oxysporum gây héo trên cây trồng ở Việt Nam

Nấm Fusarium oxyporum phát triển trong đất thích hợp với mọi độ ẩm

trong đất Nấm gây bệnh cho cây trong mọi điều nhiệt độ từ 15 – 350C tối thích

từ 25 – 280C, gây hại mạnh nhất trong điều kiện 26oC Các nghiên cứu của trường đại học Illinois cho thấy thông qua các vết thương cơ giới hay qua tuyến trùng hoặc các loại côn trùng khác, sau khi xâm nhập vào cây, nấm phát triển trong các mô dẫn nước (xylem) và lan rộng sang các phần khác của cây Nấm bịt kín các mạch dẫn và triệu chứng điển hình xuất hiện trên lá Sau khi cây bị bệnh

héo chét nấm Fusarium sản sinh ra bào tử trong mô cây chết và có thể tồn tại một

thời gian dài trong đất cho đến khi gặp môi trường thuận lợi để phát triển (Illinois University, 1988)

Theo như các báo cáo trước đây hầu hết các nấm Fusarium gây héo nằm trong nhóm Fusarium oxyporum Nhóm nấm Fusarium oxyporum có rất nhiều

dạng chuyên tính khác nhau, mỗi dạng gây hại trên một nhóm ký chủ nhất định

và thường chúng có rất nhiều chủng có khả năng gây bệnh nấm xâm nhiễm bộ rễ thực vật làm cản trở quá trình hút nước và trao đổi dinh dưỡng, làm cho cây còi cọc và lá bị vàng Các rễ còn non rất dể bị nhiễm nấm bệnh, các vết thương cơ giới ở phần rễ trong quá trình trồng, canh tác thường góp phần làm bệnh bị trầm trọng thêm Đất nghèo dinh dưỡng thiếu lân hoặc kali, muối và pH không cân bằng cũng làm giảm sức đề kháng của cây đối với các bệnh về rễ (Burgess, 1994)

1.2.1.2 Những nghiên cứu về bệnh héo trên hành, tỏi do nấm Fusarium

oxysporum f.sp.cepae gây ra

Theo Đoàn Thị Thanh, Ở Việt Nam, nấm Fusarium sp đã gây thiệt hại

lớn trên chuối, khoai tây, cà chua, hành ta và nhiều cây trồng khác Nhiều năm dịch bệnh gây tổn thất rất lớn đến sản xuất (Đoàn Thị Thanh, 2012)

Theo báo Hải Dương, vụ đông 2013, cây hành ở huyện Nam Sách (Hải Dương) đang có tình trạng bị nấm héo rũ gây hại Triệu chứng ban đầu xuất hiện

1 - 2 dọc trong khóm chuyển màu vàng nhạt và bị uốn hơi cong queo; sau đó dọc

chuyển vàng nhiều, bò khoằm trên mặt rạ và héo rũ Phát sinh từ giai đoạn cây

hành có dọc vươn cao gần 1 gang tay, cây đang được tưới thúc lần 2 và chủ yếu tập trung ở ruộng không thường xuyên được duy trì ở độ ẩm 80% độ ẩm đồng ruộng (với tỷ lệ từ 1 - 3% khóm bị) Có thể bệnh đã xâm nhập từ phần củ đến phần rễ rồi mới biểu hiện bị hại lên phần dọc lá và lây lan từng phần củ và dọc trong khóm Do phát sinh từ phần củ nên đã gây ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý

và sinh hóa của bộ rễ Thời gian từ bắt đầu bị đến héo rũ hoàn toàn thường kéo dài từ 7 - 8 ngày Theo những chuẩn đoán ban đầu bệnh do một số loài nấm héo

rũ (Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Rhyzoctonia solani) tồn tại trong đất

trồng, củ giống… Gặp thời tiết hanh khô, độ ẩm đất không được duy trì hoặc bơm hay tưới nước quá võng, tưới thừa đạm, nhiều sương về đêm và sáng sớm…

đã làm cho các loài nấm này chiếm ưu thế và xâm nhập gây hại cây hành

Theo Crame thì Fusarium oxysporum f.sp.cepae là một bệnh truyền qua

đất quan trọng của hành trên toàn thế giới, là nguyên nhân gây bệnh của phần thân hành, củ hành và cuối cùng giết chết toàn bộ cây Phương pháp chính của nhiễm bệnh thông qua sự thâm nhập trực tiếp của nấm vào phần gốc thân Nhiễm bệnh cũng có thể xảy ra thông qua các mô bị thương đặc biệt là rễ cây và phần vỏ của củ (Cramer, 2000)

Theo những nghiên cứu bệnh trên hành ở Iran thì héo Fusarium do nấm

Fusarium oxysporum f.sp.cepae là một trong những bệnh quan trọng nhất của

hành ở Iran (Sharifi and Ramezani, 2003)

Thối Fusarium trên hành tây, do Fusarium oxysporum f.sp cepae, là một

bệnh ngày càng tăng tại Hà Lan Thiệt hại rất lớn cho nông dân Hà Lan khi phải

đối mặt với bệnh thối Fusarium trên hành, do giảm năng suất và tăng chi phí bảo quản Thối Fusarium là một mối đe dọa ngày càng tăng đối với sản xuất hành tây

ở vùng ôn đới Nghiên cứu ở Hà Lan nói rõ rằng giống chống chịu có sẵn Tuy nhiên, sản lượng của những giống này vẫn còn thấp và họ không thích hợp cho việc lưu trữ lâu dài (Visser et al., 2006)

Hành tây là một loại rau quả quan trọng về kinh tế và New Mexico sản xuất một số lượng đáng kể trong những tháng mùa hè New Mexico sản xuất 1/3

lượng hành mùa hè của Mỹ với các giống ngắn và trung ngày Thối Fusarium nhân gây bệnh Fusarium oxysporum f sp cepae là một bệnh truyền qua đất, gây

thiệt hại trước và sau thu hoạch cho hành trên toàn thế giới (Ashish and Christopher, 2009)

Tại Thổ Nhỹ Kỳ thì 2 loại nấm Aspergillus niger V Tieghem và

Fusarium oxysporum f sp cepae gây ra nấm mốc màu đen và thối củ trong hành tây (Allium cepa L.) Cả hai loại nấm trên củ giống và đất thường hiện diện trong

đất trồng hành tây rất rộng rãi Hành có thể bị nhiễm bệnh trong quá trình phát triển cây con và củ, và trong lưu trữ phụ thuộc vào thời gian của năm, điều kiện môi trường, và giống cây trồng (Özer et al., 2009)

Hành tây là cây trồng kinh tế quan trọng trên thế giới Hành cũng được trồng phổ biến ở Ghana Ở khu vực phía đông và xung quanh Bawku, Bolgatanga

và khu vực Kusasi là vùng đất rất thích hợp cho trồng hành Một bệnh của hành tây đe dọa sản xuất vụ mùa ở huyện Kwahu Nam (đặc biệt là tại khu vực New Oworobong) của khu vực phía Đông của Ghana đã được chứng minh là thối

Fusarium gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum f sp cepae Các loại nấm thường

xuyên được phân lập từ các tấm thân, củ và rễ của cây bị bệnh trưởng thành, cây

bị bệnh và rễ của một số cây con trông còn khỏe mạnh Các triệu chứng chẩn đoán của bệnh là héo rũ dẫn đến chết toàn cây và củ bị thối mềm Bệnh này được biết là đã có mặt tại khu vực từ những năm 1980 nhưng gần đây nó đã trở nên nghiêm trọng và gây thiệt hại về kinh tế (Awuah et al., 2009)

Ba mươi hai chủng loài Fusarium thu được từ hành tây xứ Wales bị héo (Allium fistulosum ) trồng trên chín trang trại từ sáu khu vực ở Nhật Bản và được xác định được trong đó chủ yếu là F oxysporum (18 chủng ) , F verticillioides (7 chủng ) , và F solani ( 7 chủng ) (Dissanayake et al., 2009)

Theo nghiên cứu của Yvonnes J.smith trường đại học Adelaide, Austrailia

cho thấy Fusarium oxysporum f.sp cepae là tác nhân cơ bản gây lên hiện tượng

thối rễ trên những ruộng hành, và gây ra thối củ trong bảo quản Các cây hành tây còi cọc thu thập từ khu vực trung Murray đã được nghiên cứu tạ viện nghiên

cứu và phát triển Nam Úc, Adelaide vào năm 1995 và Fusarium oxysporum f.sp

cepae được chẩn đoán là nguyên nhân gây bệnh Fusarium oxysporum f.sp

cepae sau đó đã được phân lập từ các cây hành ở miền Nam Úc và được cho là một tác nhân gây bệnh chủ yếu của hành tây (Smith, 2009)

Fusarium oxysporum f.sp cepae là một bệnh gây thiệt hại kinh tế trên cây

hẹ Hiện tượng thối do Fusarium gây ra 45% thiệt hại về sản lượng và 12-30%

mất củ trong lưu trữ tại Debre Zeit (Assefa et al., 2010)

Theo một cuộc điều tra khác tại Thổ Nhỹ Kỳ, người ta tiến hành phân lập

để xác định các loài Fusarium liên quan đến các bệnh về rễ và thân của hành tây,

các cuộc điều tra được thực hiện tại bảy tỉnh của Thổ Nhĩ Kỳ trong năm 2007

Lấy được 332 mẫu và 223 phân lập được 7 loài Fusarium sp Các loài phân lập được xác định là F oxysporum , F solani , F acuminatum , F equiseti , F

proliferatum, F redolens , và F culmorum dựa trên đặc điểm hình thái Ngoài ra,

người ta còn sử dụng mồi đặc hiệu loài để xác định danh tính của các loài

Fusarium và F.oxysporum là loài phổ biến nhất, bao gồm 66,57 % của tổng số loài Fusarium (Bayraktar and Dolar, 2011)

Theo Muharrem Turkkan của trường đại học Ordu, thấy rằng Fusarium

oxysporum f.sp cepae gây ra thối trên hành là một trong những bệnh nghiêm

trọng nhất của hành tây và gây ra thiệt hại năng suất quan trọng trong tất cả các khu vực đang phát triển của thế giới Tác nhân gây bệnh làm cây con chậm lớn

và chết đi Triệu chứng ban đầu của bệnh bao gồm cong, héo, vàng và cuối cùng chết của lá bị héo ban đầu Ngoài ra, củ hành bị bệnh thường bị đổi màu và các

mô bị nhiễm bệnh xuất hiện màu nâu và chảy nước mắt bên trong khi cắt củ hành

ra (Muharrem, 2013)

Hành tây là một trong những cây trồng quan trọng nhất được trồng ở Ấn

Độ Ở Ấn Độ, hành tây là một trong những quan trọng nhất trong số các loại cây trồng khác nhau, hành phát triển và bao gồm diện tích 772,8 ha và sản lượng là 2,970.1 tấn sản xuất trong năm 2010-2011 Ở Maharashtra nó chiếm một diện tích khoảng 170 ha và sản xuất 2800 tấn Cây hành tây bị tấn công bởi nhiều bệnh, gây thiệt hại về chất lượng và số lượng Trong số những bệnh thối củ do

Fusarium oxysporum f.sp cepae là một trong những bệnh phổ biến nhất và quan

trọng về kinh tế của hành tây Ở Ấn Độ, sự xuất hiện của bệnh này lần đầu tiên được báo cáo từ Rajasthan Bệnh được đặc trưng bởi các triệu chứng như héo và chết nhanh chóng của lá Rễ bị ảnh hưởng là màu nâu sẫm, phẳng, rỗng (Ilhe et al., 2013)

1.2.2 Nấm Fusarium proliferatum

1.2.2.1 Phân loại nấm Fusarium proliferatum

Fusarium proliferatum thuộc:

Loài : Fusarium proliferatum

Nấm F.proliferatum được thu hồi từ nhiều vùng trên toàn thế giới Nó là

một nguyên nhân gây ra bệnh thối gốc của cây thông, thối rễ của măng tây, thối thân và bắp ngô và nhiều loại cây khác

Nấm F.proliferatum phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-300C, có sợi nấm ban đầu là màu trắng sau đó chuyển dần sang màu tím trên môi trường PDA

Nấm thường gây ra sự nhầm lẫn với nấm F.oxysporum về đặc điểm hình thái Tuy nhiên với nấm F.proliferatum có thể phân biệt qua quan sát đặc điểm bào tử

nấm Bào tử lớn thưởng mảnh và thẳng, có từ 3-5 vách ngăn Bào tử nhỏ thường không có vách ngăn và mọc theo chuỗi ngắn Hạch nấm màu xanh-đen có thể phát triển ở một số trường hợp nhưng hiếm gặp (John and Brett, 2006)

Hình 2: Nấm Fusarium proliferatum (John and Brett, 2006)

A-B: bào tử lớn C-D: bào tử nhỏ E-F: bào tử nhỏ trên môi trường CLA

1.2.2.2 Những nghiên cứu về bệnh héo trên hành, tỏi do nấm Fusarium

proliferatum gây ra

Năm 2007, từ những cây hành tỏi bị héo tại Serbia, người ta đã phân lập

được nấm bệnh F proliferatum , các nhà khoa học bằng phương pháp lây bệnh

nhân tạo còn thấy được rằng nấm này sinh ra độc tố tích tụ lại trong các cây hành

tỏi bị bệnh Và nấm F proliferatum được xác định là loài nấm gây bệnh quan

trọng cho hành tỏi tại châu Âu (Stankovic et al., 2007)

Fusarium proliferatum đã được báo cáo như là một tác nhân gây thối nâu tép tỏi ở Đông Bắc Hoa Kỳ và Serbia Gần đây, các tác nhân gây bệnh đã được báo cáo ở Tây Ban Nha từ giống tỏi trắng "Garcua" và "Blancomor de Vallelado" trồng ở các tỉnh Segovia Sau đó, củ tỏi bị bệnh từ tỉnh Albacete (cv Morado de

Pedroñeras) cũng được phân lập và tìm ra là nấm F proliferatum Có rất ít tài liệu

tham khảo cho rằng tác nhân gây bệnh này có thể ảnh hưởng đến tỏi trong chu kỳ

canh tác Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học Tây Ban Nha đã xác định khả

năng gây bệnh cụ thể của sáu chủng F proliferatum về năm loài thuộc chi Allium Các giống khác nhau của hành tây (Allium cepa), tỏi tây (A porrum), hẹ (A

fistulosum ) hẹ (A schoenoprasum) và tỏi (A sativum) được ngâm trong dung dịch

bào tử nấm của mỗi chủng Sau đó cây được trồng trong chậu và giữ trong môi trường có kiểm soát (12 h / 12 h ngày / đêm 25/21°C) Thối rễ đã được quan sát và thu nhỏ bằng các triệu chứng sau ba tuần sau khi lây bệnh Kết quả thực nghiệm các nhà khoa học đã cho thấy rằng ít nhất 5 loài khác nhau của chi Allium có khả

năng bị ảnh hưởng bởi F proliferatum.(García et al., 2011)

Trong tháng 9 năm 2009, củ tỏi bệnh (Allium sativum cv Yamuna Safed)

đã nhận được từ các nhà sản xuất và xuất khẩu tại Hyderabad, Andhra Pradesh,

Ấn Độ Từ năm 2009 đến năm 2010, các triệu chứng tương tự như đã được quan sát trên củ tỏi được lưu trữ trong kho (giống Yamuna Safed và Agrifound trắng)

ở huyện Chittor, Cuddapah và Hyderabad Ở một số địa điểm, khoảng 60% tỏi barlic bị ảnh hưởng Lúc đầu, củ nhiễm cho thấy, những đốm nâu nước ngâm và sau đó bệnh tiến triển càng nhỏ, tổn thương Các chủng được lấy từ 120 mẫu bệnh từ các địa phương Trên cơ sở của hình thái của nó, trình tự và khả năng gây

bệnh của nó, các loại nấm được xác định là Fusarium proliferatum Đây được cho là báo cáo đầu tiên của F proliferatum gây bệnh thối củ tỏi vào ở Ấn Độ

(Sankar and Babu, 2012)

Trong năm 2011, Fusarium gây thối tỏi lưu trữ đã được phát hiện trên các

củ tỏi 'Aglio Bianco' (tỏi trắng) ở huyện Piacenza, Ferrara và Rovigo của Italia

Củ tỏi thu hoạch vào tháng bảy không có triệu chứng Tỏi được lưu trữ khô trong

kho thì khoảng ba mươi phần trăm củ bị mềm Fusarium proliferatum đã tiếp tục

được phân lập từ các củ tỏi bị nhiễm bệnh Việc xác định hình thái đã được khẳng định bởi trình tự gen Áp dụng quy tắc Koch để đánh giá khả năng gây bệnh Bệnh đã được báo cáo ở Serbia, Đức, Tây Ban Nha, Hoa Kỳ, Trung Quốc

và Ấn Độ, và đây là báo cáo đầu tiên về F proliferatum gây thối tỏi ở Italia

(Stefano et al., 2012)

Trong tháng 10 năm 2001 và tháng 1 năm 2002, trong các vùng trồng

hành tây (Allium cepa cv.valencianita) tại các tỉnh San Juan (SJ) và Mendoza

(MZ), Argentina, cây hành được quan sát với triệu chứng lá úa, lá khô, và củ bị đổi màu và thối Trong mùa hè năm 2002, một số củ bị thối với sợi nấm màu

trắng trong hốc thối cũng được quan sát trong củ tỏi được lưu trữ (Allium

sativum) tại tỉnh MZ Căn cứ vào đặc điểm hình thái và lây bệnh nhân tạo, các

tác nhân gây bệnh trong hành tây và tỏi đã được xác định là Fusarium

proliferatum Nguyên nhân gây bệnh này trước đây đã được báo cáo với cây măng tây tại Argentina với các triệu chứng tương tự như hành tây và tỏi Đây

được cho là báo cáo đầu tiên của F proliferatum tấn hành tây và tỏi tại Argentina

(Salvalaggio and Ridao, 2013)

1.3 Những nghiên cứu về phòng trừ Fusarium bằng phương pháp sinh học

Hoạt động phòng trừ sinh học có thể được tiến hành một cách thủ công bằng cách đưa các vật đối kháng ngoại lai vào trong đất, hoặc bằng cách kích thích hoạt động của các đối kháng nội sinh thông qua việc bổ sung thêm các lớp che phủ hoặc phân hữu cơ (Donald and Olaf, 1996)

Bệnh gây ra trên cây cần phải được kiểm soát để duy trì chất lượng và phong phú của thực phẩm, thức ăn, và chất xơ bởi người trồng trên toàn thế giới Rất nhiều phương pháp khác nhau có thể được sử dụng để ngăn ngừa, giảm thiểu hoặc kiểm soát bệnh thực vật Trên đồng ruộng, người trồng thường phụ thuộc nhiều vào phân bón hóa học và thuốc trừ sâu Việc sử dụng hóa chất trong sản xuất nông nghiệp đã góp phần đáng kể vào việc cải tiến ngoạn mục trong năng suất cây trồng và chất lượng trong vòng 100 năm qua Tuy nhiên, tình trạng ô nhiễm môi trường do sử dụng quá mức và lạm dụng hóa chất nông nghiệp đã dẫn đến những thay đổi đáng kể trong thái độ của người dân đối với việc sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp Ngày nay, có quy định chặt chẽ về việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, và có các quy định để loại bỏ các hóa chất độc hại nhất trên thị trường Ngoài ra, sự lây lan của bệnh cây ở các hệ sinh thái tự nhiên dẫn đến việc áp dụng hóa chất cũng không thành công Do đó, một số nhà nghiên cứu quản lý dịch hại đã tập trung nỗ lực vào phát triển các yếu tố thay thế cho hóa chất tổng hợp để kiểm soát sâu bệnh Trong số các lựa chọn thay thế là những người được gọi là kiểm soát sinh học Một loạt các điều khiển sinh học có sẵn để

sử dụng, nhưng tiếp tục phát triển và áp dụng có hiệu quả đòi hỏi phải có một sự hiểu biết lớn hơn của sự tương tác phức tạp giữa các cây trồng, con người và môi trường (Pal and McSpadden Gardener, 2006)

Héo do nấm Fusarium oxysporum là một trong những bệnh quan trọng

nhất của hành ở Iran Ứng dụng các loại hóa chất đặc biệt như ngâm nước đất, tăng chi phí sản xuất và hành tây có thể gây nguy hiểm cho môi trường Một trong những

kỹ thuật hiệu quả để ngăn chặn bệnh trong đất sinh ra trong kiểm soát sinh học với rhizobacteria đối kháng Các chủng đối kháng này được sử dụng để điều tra những khả năng kiểm soát sinh học của chúng trong ống nghiệm và khả năng ngăn chặn héo đối với hành ( phương pháp điều trị đất và hạt giống) Theo các thử nghiệm sinh

hóa , sinh lý và hình thái , phân lập được xác định là vi khuẩn Bacillus spp và

Pseudomonas fluorescens Các chủng vi khuẩn Bacillus spp sản xuất các chất chuyển hóa dễ bay hơi ức chế sự tăng trưởng sợi nấm của Fusarium oxysporum, làm

giảm bệnh héo trên hành Đặc biệt hỗn hợp 2 chủng này cho thấy hiệu quả đối kháng rất cao (Sharifi and Ramezani, 2003)

Tại Arhentina, người ta sử dụng chủng Bacillus subtilis để ức chế sự phát triển của nấm bệnh Fusarium verticillioides trên ngô và đã đem lại hiệu quả đáng

đánh giá trong nhà kính cho thấy giảm tỷ lệ mắc bệnh héo Fusarium 87,4% (Nel

et al., 2006)

Sản phẩm thương mại Trichoderma harzianum KUEN 1585 đã được thử nghiệm để xác định ảnh hưởng của sự tăng trưởng sợi nấm Fusarium oxysporum f.sp cepae (FOC) trong việc kiểm soát các bệnh thối cơ bản trong bộ rễ hành và

khác vùng trồng hành Các khả năng của T harzianum để kích thích việc sản

xuất các hợp chất kháng nấm ở bộ và tăng đường kính củ hành bộ cũng được

nghiên cứu Xử lý hạt giống với T harzianum giảm tỷ lệ mắc bệnh so sánh với

các loại thuốc diệt nấm imidazol, prochloraz trong thực tế và thí nghiệm Hầu hết

các thành phần thu được từ bộ giống T harzianum xử lý cho thấy hoạt tính kháng

nấm cao, chống lại mầm bệnh tốt Nghiên cứu này cho thấy vai trò có thể có của

T harzianum trong sự cảm ứng của các hợp chất kháng nấm chống lại F

oxysporum f sp cepae gây bệnh trên hành (Coşkuntuna and Özer, 2007)

Theo một nghiên cứu tại Pakistan, để kiểm soát bệnh héo vàng trên cây ớt

ngọt các nhà khoa học thấy rằng năm loài Trichoderma đó là: Trichoderma viride,

T harzianum , T koningii, T aureoviride và T pseudokoningii được đánh giá tiềm năng đối kháng Fusarium oxysporum trong điều kiện in vitro Trong số các loài

Trichoderma thì T viride cho thấy hiệu suất tốt nhất trong việc kiểm soát sinh sự phát triển của Fusarium oxysporum tiếp theo T harzianum, T aureoviride, T

koningii và T pseudokoningii, tương ứng, kết quả là giẩm tới 62, 36, 24, 18 và 6%

tốc độ tăng trưởng của nấm bệnh héo vàng trong điều kiện thí nghiệm invitro (Irfan and Khalid, 2007)

Nấm Trichoderma viride, T harzianum và vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự tăng trưởng của F.oxysporum f sp cepae các tác nhân gây

bệnh thối củ hành trong điều kiện in vitro Trong số các phương pháp thử đối

kháng khác nhau, hiệu quả điều trị kết hợp của T viride + B subtilis và T

harzianum + B subtilis đã ức chế tốt sự phát triển của F oxysporum f sp cepae

Nó còn có khả năng làm giảm sự sinh sản bào tử vô tính và sản xuất

chlamydospore Ngoài ra, xử lý hạt giống với T viride và sự kết hợp của T

viride + B subtilis đã giảm tối đa tỷ lệ mắc bệnh (Sudhasha et al., 2009)

Héo vàng do nấm Fusarium oxysporum gây ra được coi là một căn bệnh

gây tử vong cho chuối ở Trung Quốc Kiểm soát bệnh bằng phương pháp hóa học

có hiệu quả rất thấp Ngoài ra, kiểm soát sinh học là một chiến lược khả thi

chống lại các bệnh truyền qua đất Người ta đã sử dụng chủng Bacillus đối kháng

để chống lại F oxysporum f sp cubense được phân lập từ đất của rễ chuối Các

thí nghiệm đối kháng cho thấy sợi nấm bệnh bị biến dạng và kém phát triển (Sun

et al., 2011)

Theo một tạp chí của Anh cho thấy, hiệu quả của các dòng nấm

Trichoderma viride, Trichoderma harzianum và vi khuẩn Pseudomonas sp trong việc kiểm soát sinh học hành tây bị thối do nấm Fusarium oxysporum.f.sp.cepae gây ra đang được đánh giá Các dòng nấm Trichoderma viride, Trichoderma

harzianum và vi khuẩn Pseudomonas sp được thu thập từ các vùng trồng hành

tây khác nhau của Tamil Nadu và họ đã được thử nghiệm cho hoạt động đối

kháng của họ chống lại Fusarium oxysporum.f.sp.cepae bằng kỹ thuật nuôi kép Trong số các chủng thử nghiệm của Trichoderma sp thì T harzianum ức chế đến 82,77% Trong số sáu mươi hai chủng Pseudomonas sp Pf 12 tác dụng đáng kể cao nhất, làm giảm của tăng trưởng sợi nấm Fusarium oxysporum f.sp cepae đến 74,68% Báo cáo đã chỉ ra rằng việc kết hợp của loài nấm Trichoderma trên với vi khuẩn Pseudomonas sp đã làm giảm đáng kể bệnh thối trên hành (Malathi

and Mohan, 2012)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số hệ sinh thái vi khuẩn sống ở Hy

Lạp rất thú vị với các đặc tính công nghệ sinh học Vì vậy Streptomyces phân lập

từ môi trường sống của Hy Lạp đã được lựa chọn đa dạng cho hoạt động kháng

nấm chống lại các loại nấm Fusarium oxysporum phổ biến Loài phân lập được

mã hóa ACTA1551, thành viên của chi Streptomyces, mạnh mẽ có thể ngăn chặn

sự phát triển của nấm khi kiểm tra sinh trắc nghiệm đối kháng trong ống nghiệm

Mẫu phân lập được tìm thấy là loài Streptomyces rochei sau khi phân tích trình tự

16S rDNA của nó Sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường khác nhau, chẳng hạn như thành phần trung bình, nhiệt độ và độ pH trên các biểu hiện của hoạt động

kháng nấm đã được kiểm tra kỹ lưỡng Streptomyces rochei ACTA1551 đã có thể để bảo vệ hạt giống cà chua khỏi bị nhiễm nấm F oxysporum và thúc đẩy sự

tăng trưởng của cây cà chua (Kanini et al., 2013)

Trong 2 năm 2011, 2012, tại viện bảo vệ thực vật Hà Nội, các nhà nghiên cứu đã phân lập được 7 dòng vi khuẩn và 3 dòng xạ khuẩn từ đất cà chua và dưa chuột khỏe Các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn này theo như nghiên cứu khả năng

kiểm soát rất tốt đối với bệnh héo vàng trên cà chua và dưa chuột Trong đó, các dòng vi khuẩn có khả năng làm hạn chế bệnh từ 80,1-86,7%, còn các dòng xạ khuẩn thì hạn chế bệnh từ 57,3-66,8% (Lê Thu Hiền et al., 2013)

Trong những năm gần đây, các loài vi khuẩn Bacillus đã nhận được sự

quan tâm đáng kể cho việc kiểm soát sinh học của nhiều bệnh nấm Trong nghiên

cứu mới đây của Trung Quốc, Bacillus amyloliquefaciens Q-426 đã được thử

nghiệm để sử dụng tiềm năng của nó chống lại một loạt các tác nhân gây bệnh Lipopeptides như bacillomycin D, fengycin A, B và fengycin được tinh chế từ nước dùng nuôi cấy vi khuẩn và sau đó xác định bởi phổ ESI-đại chúng Nồng độ

ức chế tối thiểu của fengycin A với Fusarium oxysporum f sp spinaciae được

xác định là 31,25 ml Tuy nhiên, nếu dùng đến 50ml thì quan sát thấy các bào tử

F.oxysporum bị ức chế nảy mầm Như vậy, đây chính là 1 biện pháp nhằm kìm

hãm nấm F.oxysporum phát triển (Zhao et al., 2014)

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm Fusarium sp gây héo vàng trên hành, tỏi

- Thử nghiệm phòng trừ nấm Fusarium sp gây héo vàng hành tỏi bằng

phương pháp sinh học trong điều kiện invitro

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Không gian: nghiên cứu nấm Fusarium hại hành tỏi tại một số vùng

trồng hành tỏi

- Thời gian: vụ đông xuân 2014-2015

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định bệnh do Fusarium trên và hành tỏi tại Hưng Yên và Hải Dương

về mức độ nhiễm, tỷ lệ nhiễm

- Đánh giá tính gây bệnh của Fusarium hành tỏi

- Đánh giá khả năng kháng và nhiễm Fusarium trên một số giống hành tỏi

- Xác định loài Fusarium (hình thái và giải trình tự)

- Đánh giá khả năng phòng chống Fusarium của một số vi khuẩn đối

kháng

2.4 Vật liệu nghiên cứu:

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

- Hộp Petri, ống nghiệm, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác

- Que cấy, panh, dao, kéo

- Tủ lạnh, tủ sấy, nồi hấp, tủ định ôn, kính hiển vi

- Các nguồn vi khuẩn F29.1; F90.1; F100.5 được phân lập tại Viện Bảo vệ thực vật Các nguồn vi khuẩn đã được chứng minh là có khả năng đối kháng với

nguồn nấm Fusarium oxysporum f.sp lycopersici gây bệnh héo vàng trên cà chua, dưa chuột Trong đó F29.1 là Bacilus sutilis, F90.1 là Bacilus subtilis, F 100.5 là Bacilus amyloliquefaciens

2.4.2 Một số môi trường chuyên cho phân lập Fusarium sp (John and

+ Môi trường WA (nước cất 1 lít, agar: 20g)

+ Môi trường thạch lá cẩm chướng (CLA): lá cẩm chướng được cắt nhỏ tiệt trùng cho vào đĩa petri và sau đó đổ WA 2% đã tiệt trùng vào

+ Môi trường PDB

Khoai tây 200 g

Glucose 20 g

Nước cất 1 lít

2.4.3 Vật liệu nghiên cứu trong nhà lưới

- Chậu vại, xô nhựa

- Bình phun tay có dung tích 500; 1000 ml

- Các giống hành, tỏi

2.5 Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu:

Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới- Học viện Nông

Nghiệp Việt Nam

Thời gian: từ tháng 5/2014 – tháng 4/2015

2.6 Phương pháp nghiên cứu

Điều tra, thu thập nguồn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật

(VSV) đối kháng: Theo quy chuẩn QCVN 01-38 : 2010/BNNPTNT về điều tra

dịch hại cây trồng

2.6.1 Phương pháp phân lập nấm Fusarium gây bệnh héo vàng trên hành:

Theo tài liệu của (Lester et al., 2009)

- Chọn mẫu củ thành, tỏi bị bệnh héo vàng

- Rửa mẩu thân dưới vòi nước, sau đó khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút

- Thấm khô trên giấy thấm đã khử trùng hoặc hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn nếu củ to, dày

- Dùng dụng cụ vô trùng cắt ngang phần củ hành, tỏi thành những miếng cấy dày khoảng 5-10 mm

- Cấy các miếng này trên môi trường WA, CLA hoặc PPA

- Sau khi cấy xong, úp ngược đĩa petri để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường nuôi cấy và đặt trong tủ định ôn 28oC

- Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh 5-10 mm, lấy phần môi trường

có đầu sợi nấm đặt sang môi trường PGA và để trong tủ định ôn 28oC

2.6.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo

2.6.2.1 Lây bệnh theo phương pháp nhúng cây vào dịch bào tử nấm bệnh

Hành, tỏi được trồng trong đất được hấp khử trùng Sau khoảng 1 tuần, cây mọc thì chuẩn bị cho thí nghiệm lây bệnh nhân tạo

Nấm Fusarium sp nuôi cấy trên môi trường PGA sau 7 – 9 ngày, cạo sợi

nấm cho vào 200ml nước cất vô trùng, lắc đều Cho sợi nấm vào nước sao cho mật độ bào tử đạt 106

Nhổ nhẹ nhàng cây con ra khỏi chậu, rửa sạch đất dưới vòi nước, sau đó nhúng rễ cây vào dung dịch bào tử nấm trong 30 phút, trồng lại vào chậu đất sạch và tưới hết 200 ml dịch bào tử quanh gốc tỏi, hành

Theo dõi triệu chứng bệnh sau 7 ngày, 14 ngày; 21 ngày; 30 ngày

Chỉ tiêu theo dõi

Tổng số cây bị héo

Tỉ lệ bệnh (%) = x 100

Tổng số cây lây bệnh

2.6.2.2 Lây bệnh theo phương pháp trộn thạch nấm vào đất trồng cây

Nấm Fusarium sp nuôi cấy trên môi trường PGA sau 7 – 9 ngày Đất

trồng cây được hấp khử trùng Nấm được cắt nhỏ bằng dao cấy, trộn vào đất đã hấp khử trùng Lượng đĩa thạch nấm sử dụng là 4 đĩa cho 1 chậu đất Sau đó

trồng củ hành, tỏi vào các chậu đã có thạch nấm Có thêm cây đối chứng để so

sánh với các công thức trộn nấm

Theo dõi triệu chứng bệnh sau 7 ngày, 14 ngày; 21 ngày; 30 ngày

Chỉ tiêu theo dõi

Tổng số cây bị héo

Tỉ lệ bệnh (%) = x 100

Tổng số cây lây bệnh

2.6.2.3 Lây bệnh theo phương pháp đặt ẩm trên bông thấm dịch bào t

Hành, tỏi được đặt ẩm trong hộp bọc kín, tránh tạp nhiễm Sau khoảng 1 tuần hành, tỏi bắt đầu ra rễ và nảy mầm

Nấm Fusarium sp cấy trên môi trường PGA sau 7-9 ngày Sau đó cạo sợi

nấm cho vào tuýp thủy tinh chứa 10ml nước cất khử trùng Lắc cho bào tử đều

và đếm sao cho lượng bào tử đạt 106 và cho bông thấm nước vào Sau đó, đặt hành hoặc tỏi vào các tuýp và đặt các tuýp thí nghiệm vào môi trường sạch Với công thức đối chứng, bông được thấm nước cất vô trùng

Phương pháp này có thể theo dõi sự phát triển của hành, tỏi và nấm bệnh trong tuýp dễ dàng

2.6.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Quy trình chiết DNA tổng số

Ngay trước khi chiết, ủ đệm chiết CTAB có bổ sung BME với tỉ lệ 1ml đệm CTAB :10 µL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 600 C trong 30 phút Chú ý: 1 mẫu chiết cần 0.5 ml đệm

Dùng que cấy nấm vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt đĩa nấm (phần ngoài rìa) để lấy sợi nấm và cho vào ống Eppendorf 1.5 ml Lượng nấm lấy tương đương đầu que diêm (~ 100 mg) Chú ý không cạo sâu vào phần môi trường

Cho 0.5 ml đệm CTAB đã ủ ở trên vào ống Eppendorf chứa nấm.Dùng chày nhựa chuyên dụng nghiền nhuyễn nấm Ủ ống ở 650 C trong 10 - 30 phút ở bể nhiệt

Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu dịch trên tủa (~ 450 µL) cho vào ống Eppendorf mới

Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào ống với tỉ lệ thể tích tương

đương Đảo đều ống

Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu dịch trên tủa (~ 400 µL)

Lặp lại các bước 5, 6 thêm một lần nữa và thu dịch trên tủa (~ 300 µL)

Cho thể tích tương đương (300 µL) 2-propanol lạnh vào ống Đảo đều ống và

để lạnh (-200C) 30 phút

Li tâm 13000 g trong 15 phút Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA tổng số

Rửa cặn bằng Ethanol 70 % hai lần (mỗi lần 0.7 – 1 mL)

Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp ống, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

(trong buồng cấy)

Hòa cặn trong 20-50 µL nước cất 2 lần vô trùng hoặc đệm TE và bảo quản

dich DNA ở -20 0C

2.6.4 Phương pháp nhân gen ITS phục vụ việc giải trình tự

Hai mồi ITS4 và ITS5 được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của nấm

Fusarium sp Trình tự trình bày ở dưới đây:

Trình tự mồi ITS4 và ITS 5

Phản ứng PCR có thể được thực hiện với Taq polymerase của bất kỳ hãng

nào.Trong qui trình này, Taq polymerase và đệm PCR tương ứng là của hãng

Fermentas

Cho vào mỗi tube PCR loại 0.5 mL các thành phần sau:

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % đươc chuẩn bị bằng đệm

TAE và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide

Tinh chiết sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết thương mại AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các bước dưới đây được thực hiện dùng kít PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit

(Invitrogen)

Bước 1: Sau khi chạy điện di, dùng dao mổ cắt phần gel agarose chứa sản phẩm PCR Quá trình cắt cần thực hiện nhanh để tránh tổn hại DNA do tác động của tia UV Lượng gel cắt được cân (thường ~ 200 mg)

Bước 2: Cho 600 µl đệm QG vào tube đựng gel chứa DNA, ủ tube ở 50 0C trong thời gian 10 phút trong bể nhiệt Thỉnh thoảng lắc tube để đảm bảo tan gel Bước 3: chuyển toàn bộ đệm QG từ tube 1,5ml sang tube 2ml rồi cho spin

Bước 4: Cho toàn bộ dịch vào cột chứa màng liên kết DNA Ly tâm ở 13000vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột,

Bước 4: Cho 500 µl đệm QG vào cột để hoà tan gel còn sót Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột

Bước 5: Cho 750 µl đệm rửa PE đã vào cột và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm ở 13000vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới cột Ly tâm lại một lần nữa trong 2 phút để đảm bảo loại bỏ hết cồn

Bước 6 (Giải hấp thụ DNA): Cho cột sang 1 tube mới Cho 30 -50 µl nước siêu sach vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 4 phút Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ cột và thu dịch DNA tinh khiết trong tube

Kiểm tra sản phẩm tinh chiết bằng điện di agarose và bảo quản DNA ở -200C Phản ứng giải trình tự trực tiếp được thực hiện với kít BigDyeđ Terminator

v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR dùng mồi PCR Sản phẩm giải trình tự được tinh chiết, làm khô và gửi đọc tại Hàn Quốc

2.6.5 Phương pháp phân tích trình tự

Các chuỗi mẫu được xác đinh danh tính bằng phần mềm tìm kiếm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Phân tích chuỗi và xây dựng cây phả hệ được thực hiện với các phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX1.83, MEGA 4.0 và Vector NTI

2.6.6 Phương pháp nhuộm mô

Tách các lớp mô hoặc dùng dao mổ cắt lát mô, càng mỏng càng tốt Có thể tách được 1 lớp mô khi soi sẽ nhìn rõ mô và nấm

Mô được nhúng vào dung dịch lactophenol có chứa 5% cotton blue trong vòng

3-5 phút

Rửa lại mô bằng nước cất rồi cho lên lam kính soi trên kính hiển vi

2.6.7 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn với nấm

Fusarium sp

2.6.7.1 Phương pháp cấy vạch