Hoạt động phòng trừ sinh học có thể được tiến hành một cách thủ công bằng cách đưa các vật đối kháng ngoại lai vào trong đất, hoặc bằng cách kích
thích hoạt động của các đối kháng nội sinh thông qua việc bổ sung thêm các lớp
che phủ hoặc phân hữu cơ (Donald and Olaf, 1996)
Bệnh gây ra trên cây cần phải được kiểm soát để duy trì chất lượng và phong phú của thực phẩm, thức ăn, và chất xơ bởi người trồng trên toàn thế giới. Rất nhiều phương pháp khác nhau có thểđược sử dụng để ngăn ngừa, giảm thiểu hoặc kiểm soát bệnh thực vật. Trên đồng ruộng, người trồng thường phụ thuộc
nhiều vào phân bón hóa học và thuốc trừ sâu. Việc sử dụng hóa chất trong sản
xuất nông nghiệp đã góp phần đáng kể vào việc cải tiến ngoạn mục trong năng suất cây trồng và chất lượng trong vòng 100 năm qua. Tuy nhiên, tình trạng ô
nhiễm môi trường do sử dụng quá mức và lạm dụng hóa chất nông nghiệp đã dẫn
đến những thay đổi đáng kể trong thái độ của người dân đối với việc sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp. Ngày nay, có quy định chặt chẽ về việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, và có các quy định để loại bỏ các hóa chất độc hại nhất trên thị trường. Ngoài ra, sự lây lan của bệnh cây ở các hệ sinh thái tự nhiên dẫn
đến việc áp dụng hóa chất cũng không thành công. Do đó, một số nhà nghiên cứu
quản lý dịch hại đã tập trung nỗ lực vào phát triển các yếu tố thay thế cho hóa chất tổng hợp để kiểm soát sâu bệnh. Trong số các lựa chọn thay thế là những người được gọi là kiểm soát sinh học. Một loạt các điều khiển sinh học có sẵn để
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18 sử dụng, nhưng tiếp tục phát triển và áp dụng có hiệu quảđòi hỏi phải có một sự
hiểu biết lớn hơn của sự tương tác phức tạp giữa các cây trồng, con người và môi
trường (Pal and McSpadden Gardener, 2006)
Héo do nấm Fusarium oxysporum là một trong những bệnh quan trọng
nhất của hành ở Iran. Ứng dụng các loại hóa chất đặc biệt như ngâm nước đất, tăng
chi phí sản xuất và hành tây có thể gây nguy hiểm cho môi trường. Một trong những
kỹ thuật hiệu quảđể ngăn chặn bệnh trong đất sinh ra trong kiểm soát sinh học với rhizobacteria đối kháng. Các chủng đối kháng này được sử dụng đểđiều tra những khả năng kiểm soát sinh học của chúng trong ống nghiệm và khả năng ngăn chặn héo đối với hành ( phương pháp điều trịđất và hạt giống). Theo các thử nghiệm sinh hóa , sinh lý và hình thái , phân lập được xác định là vi khuẩn Bacillus spp. và
Pseudomonas fluorescens. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. sản xuất các chất chuyển hóa dễ bay hơi ức chế sự tăng trưởng sợi nấm của Fusarium oxysporum, làm giảm bệnh héo trên hành. Đặc biệt hỗn hợp 2 chủng này cho thấy hiệu quả đối
kháng rất cao. (Sharifi and Ramezani, 2003).
Tại Arhentina, người ta sử dụng chủng Bacillus subtilisđểức chế sự phát triển của nấm bệnh Fusarium verticillioides trên ngô và đã đem lại hiệu quảđáng
kể (Cavaglieri et al., 2005)
Nấm Trichoderma, và vi khuẩn Pseudomonas fluorescens cũng được thử
nghiệm để kiểm soát bệnh héo vàng trên chuối do Fusarium oxysporum gây ra tại
Nam Phi. Các thí nghiệm ban đầu được làm trên môi trường PDA. Sau đó đánh
giá trong nhà kính, các chủng nấm và vi khuẩn đã được thành lập trên rễ chuối
trước khi chúng được trồng trong đất bị nhiễm tác nhân gây bệnh, trong khi các
tác nhân kiểm soát sinh học thương mại đã được áp dụng theo chỉ dẫn của nhà
cung cấp. Cây giống chuối được đánh giá phát triển bệnh sau 7 tuần. Kết quả
đánh giá trong nhà kính cho thấy giảm tỷ lệ mắc bệnh héo Fusarium 87,4%. (Nel
et al., 2006)
Sản phẩm thương mại Trichoderma harzianum KUEN 1585 đã được thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nghiệm để xác định ảnh hưởng của sự tăng trưởng sợi nấm Fusarium oxysporum
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 khác vùng trồng hành. Các khả năng của T. harzianum để kích thích việc sản xuất các hợp chất kháng nấm ở bộ và tăng đường kính củ hành bộ cũng được nghiên cứu. Xử lý hạt giống với T. harzianum giảm tỷ lệ mắc bệnh so sánh với các loại thuốc diệt nấm imidazol, prochloraz trong thực tế và thí nghiệm. Hầu hết
các thành phần thu được từ bộ giống T. harzianum xử lý cho thấy hoạt tính kháng
nấm cao, chống lại mầm bệnh tốt. Nghiên cứu này cho thấy vai trò có thể có của
T. harzianum trong sự cảm ứng của các hợp chất kháng nấm chống lại F. oxysporum f. sp. cepae gây bệnh trên hành.(Coşkuntuna and Özer, 2007)
Theo một nghiên cứu tại Pakistan, để kiểm soát bệnh héo vàng trên cây ớt
ngọt các nhà khoa học thấy rằng năm loài Trichodermađó là: Trichoderma viride,
T. harzianum, T. koningii, T. aureoviride và T. pseudokoningiiđược đánh giá tiềm năng đối kháng Fusarium oxysporum trong điều kiện in vitro. Trong số các loài
Trichoderma thì T. viride cho thấy hiệu suất tốt nhất trong việc kiểm soát sinh sự
phát triển của Fusarium oxysporum tiếp theo T. harzianum, T. aureoviride, T.
koningii và T. pseudokoningii, tương ứng, kết quả là giẩm tới 62, 36, 24, 18 và 6% tốc độ tăng trưởng của nấm bệnh héo vàng trong điều kiện thí nghiệm invitro (Irfan and Khalid, 2007)
Nấm Trichoderma viride, T. harzianum và vi khuẩn Bacillus subtilis có
khả năng ức chế sự tăng trưởng của F.oxysporum f. sp. cepae các tác nhân gây
bệnh thối củ hành trong điều kiện in vitro. Trong số các phương pháp thử đối kháng khác nhau, hiệu quả điều trị kết hợp của T. viride + B. subtilis và T. harzianum + B. subtilisđã ức chế tốt sự phát triển của F. oxysporum f. sp. cepae. Nó còn có khả năng làm giảm sự sinh sản bào tử vô tính và sản xuất chlamydospore. Ngoài ra, xử lý hạt giống với T. viride và sự kết hợp của T. viride + B. subtilisđã giảm tối đa tỷ lệ mắc bệnh (Sudhasha et al., 2009)
Héo vàng do nấm Fusarium oxysporum gây ra được coi là một căn bệnh
gây tử vong cho chuối ở Trung Quốc. Kiểm soát bệnh bằng phương pháp hóa học
có hiệu quả rất thấp. Ngoài ra, kiểm soát sinh học là một chiến lược khả thi chống lại các bệnh truyền qua đất. Người ta đã sử dụng chủng Bacillusđối kháng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 thí nghiệm đối kháng cho thấy sợi nấm bệnh bị biến dạng và kém phát triển. (Sun et al., 2011)
Theo một tạp chí của Anh cho thấy, hiệu quả của các dòng nấm
Trichoderma viride, Trichoderma harzianum và vi khuẩn Pseudomonas sp trong
việc kiểm soát sinh học hành tây bị thối do nấm Fusarium oxysporum.f.sp.cepae
gây ra đang được đánh giá. Các dòng nấm Trichoderma viride, Trichoderma
harzianum và vi khuẩn Pseudomonas sp được thu thập từ các vùng trồng hành tây khác nhau của Tamil Nadu và họ đã được thử nghiệm cho hoạt động đối
kháng của họ chống lại Fusarium oxysporum.f.sp.cepae bằng kỹ thuật nuôi kép.
Trong số các chủng thử nghiệm của Trichoderma sp thì T. harzianum ức chếđến
82,77%. Trong số sáu mươi hai chủng Pseudomonas sp. Pf 12 tác dụng đáng kể
cao nhất, làm giảm của tăng trưởng sợi nấm Fusarium oxysporum f.sp. cepae
đến 74,68%. Báo cáo đã chỉ ra rằng việc kết hợp của loài nấm Trichoderma trên
với vi khuẩn Pseudomonas sp đã làm giảm đáng kể bệnh thối trên hành (Malathi
and Mohan, 2012) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số hệ sinh thái vi khuẩn sống ở Hy Lạp rất thú vị với các đặc tính công nghệ sinh học. Vì vậy Streptomyces phân lập từ môi trường sống của Hy Lạp đã được lựa chọn đa dạng cho hoạt động kháng
nấm chống lại các loại nấm Fusarium oxysporum phổ biến. Loài phân lập được
mã hóa ACTA1551, thành viên của chi Streptomyces, mạnh mẽ có thể ngăn chặn
sự phát triển của nấm khi kiểm tra sinh trắc nghiệm đối kháng trong ống nghiệm.
Mẫu phân lập được tìm thấy là loài Streptomyces rochei sau khi phân tích trình tự
16S rDNA của nó. Sựảnh hưởng của điều kiện môi trường khác nhau, chẳng hạn
như thành phần trung bình, nhiệt độ và độ pH trên các biểu hiện của hoạt động
kháng nấm đã được kiểm tra kỹ lưỡng. Streptomyces rochei ACTA1551 đã có
thểđể bảo vệ hạt giống cà chua khỏi bị nhiễm nấm F. oxysporum và thúc đẩy sự
tăng trưởng của cây cà chua. (Kanini et al., 2013)
Trong 2 năm 2011, 2012, tại viện bảo vệ thực vật Hà Nội, các nhà nghiên
cứu đã phân lập được 7 dòng vi khuẩn và 3 dòng xạ khuẩn từđất cà chua và dưa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 kiểm soát rất tốt đối với bệnh héo vàng trên cà chua và dưa chuột. Trong đó, các dòng vi khuẩn có khả năng làm hạn chế bệnh từ 80,1-86,7%, còn các dòng xạ
khuẩn thì hạn chế bệnh từ 57,3-66,8% (Lê Thu Hiền et al., 2013)
Trong những năm gần đây, các loài vi khuẩn Bacillus đã nhận được sự
quan tâm đáng kể cho việc kiểm soát sinh học của nhiều bệnh nấm. Trong nghiên
cứu mới đây của Trung Quốc, Bacillus amyloliquefaciens Q-426 đã được thử
nghiệm để sử dụng tiềm năng của nó chống lại một loạt các tác nhân gây bệnh.
Lipopeptides như bacillomycin D, fengycin A, B và fengycin được tinh chế từ
nước dùng nuôi cấy vi khuẩn và sau đó xác định bởi phổ ESI-đại chúng. Nồng độ
ức chế tối thiểu của fengycin A với Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae được
xác định là 31,25 ml. Tuy nhiên, nếu dùng đến 50ml thì quan sát thấy các bào tử
F.oxysporum bị ức chế nảy mầm. Như vậy, đây chính là 1 biện pháp nhằm kìm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Nấm Fusarium sp. gây héo vàng trên hành, tỏi
- Thử nghiệm phòng trừ nấm Fusarium sp. gây héo vàng hành tỏi bằng phương pháp sinh học trong điều kiện invitro.
2.2 Phạm vi nghiên cứu
- Không gian: nghiên cứu nấm Fusarium hại hành tỏi tại một số vùng trồng hành tỏi
- Thời gian: vụđông xuân 2014-2015 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3 Nội dung nghiên cứu
- Xác định bệnh do Fusarium trên và hành tỏi tại Hưng Yên và Hải Dương
về mức độ nhiễm, tỷ lệ nhiễm
- Đánh giá tính gây bệnh của Fusarium hành tỏi
- Đánh giá khả năng kháng và nhiễm Fusarium trên một số giống hành tỏi
- Xác định loài Fusarium (hình thái và giải trình tự)
- Đánh giá khả năng phòng chống Fusarium của một số vi khuẩn đối kháng.
2.4 Vật liệu nghiên cứu:
2.4.1. Vật liệu nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
- Hộp Petri, ống nghiệm, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác
- Que cấy, panh, dao, kéo
- Tủ lạnh, tủ sấy, nồi hấp, tủđịnh ôn, kính hiển vi.
- Các nguồn vi khuẩn F29.1; F90.1; F100.5 được phân lập tại Viện Bảo vệ
thực vật. Các nguồn vi khuẩn đã được chứng minh là có khả năng đối kháng với nguồn nấm Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici gây bệnh héo vàng trên cà chua, dưa chuột. Trong đó F29.1 là Bacilus sutilis, F90.1 là Bacilus subtilis, F
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
2.4.2. Một số môi trường chuyên cho phân lập Fusarium sp. (John and Brett, 2006) Brett, 2006)
+Môi trường PGA
Khoai tây: 200g Glucose: 20g Agar: 20g
+ Môi trường WA (nước cất 1 lít, agar: 20g)
+ Môi trường thạch lá cẩm chướng (CLA): lá cẩm chướng được cắt nhỏ
tiệt trùng cho vào đĩa petri và sau đó đổ WA 2% đã tiệt trùng vào
+ Môi trường PDB
Khoai tây 200 g
Glucose 20 g Nước cất 1 lít
2.4.3. Vật liệu nghiên cứu trong nhà lưới
- Chậu vại, xô nhựa
- Bình phun tay có dung tích 500; 1000 ml - Các giống hành, tỏi
2.5. Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu:
Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới- Học viện Nông
Nghiệp Việt Nam (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian: từ tháng 5/2014 – tháng 4/2015
2.6. Phương pháp nghiên cứu
Điều tra, thu thập nguồn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật (VSV) đối kháng: Theo quy chuẩn QCVN 01-38 : 2010/BNNPTNT vềđiều tra dịch hại cây trồng.
2.6.1. Phương pháp phân lập nấm Fusariumgây bệnh héo vàng trên hành:
Theo tài liệu của (Lester et al., 2009)
- Chọn mẫu củ thành, tỏi bị bệnh héo vàng.
- Rửa mẩu thân dưới vòi nước, sau đó khử trùng bằng cồn 70% trong 1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
- Thấm khô trên giấy thấm đã khử trùng hoặc hơ khô trên ngọn lửa đèn
cồn nếu củ to, dày
- Dùng dụng cụ vô trùng cắt ngang phần củ hành, tỏi thành những miếng
cấy dày khoảng 5-10 mm.
- Cấy các miếng này trên môi trường WA, CLA hoặc PPA
- Sau khi cấy xong, úp ngược đĩa petri để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường nuôi cấy và đặt trong tủđịnh ôn 28oC.
- Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh 5-10 mm, lấy phần môi trường
có đầu sợi nấm đặt sang môi trường PGA và để trong tủđịnh ôn 28oC.
2.6.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
2.6.2.1. Lây bệnh theo phương pháp nhúng cây vào dịch bào tử nấm bệnh
Hành, tỏi được trồng trong đất được hấp khử trùng. Sau khoảng 1 tuần, cây mọc thì chuẩn bị cho thí nghiệm lây bệnh nhân tạo
Nấm Fusarium sp. nuôi cấy trên môi trường PGA sau 7 – 9 ngày, cạo sợi
nấm cho vào 200ml nước cất vô trùng, lắc đều. Cho sợi nấm vào nước sao cho
mật độ bào tửđạt 106.
Nhổ nhẹ nhàng cây con ra khỏi chậu, rửa sạch đất dưới vòi nước, sau đó nhúng rễ cây vào dung dịch bào tử nấm trong 30 phút, trồng lại vào chậu đất sạch và tưới hết 200 ml dịch bào tử quanh gốc tỏi, hành.
Theo dõi triệu chứng bệnh sau 7 ngày, 14 ngày; 21 ngày; 30 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi
Tổng số cây bị héo
Tỉ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng số cây lây bệnh
2.6.2.2. Lây bệnh theo phương pháp trộn thạch nấm vào đất trồng cây.
Nấm Fusarium sp. nuôi cấy trên môi trường PGA sau 7 – 9 ngày. Đất trồng cây được hấp khử trùng. Nấm được cắt nhỏ bằng dao cấy, trộn vào đất đã hấp khử trùng. Lượng đĩa thạch nấm sử dụng là 4 đĩa cho 1 chậu đất. Sau đó
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trồng củ hành, tỏi vào các chậu đã có thạch nấm. Có thêm cây đối chứng để so
sánh với các công thức trộn nấm.
Theo dõi triệu chứng bệnh sau 7 ngày, 14 ngày; 21 ngày; 30 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi
Tổng số cây bị héo
Tỉ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng số cây lây bệnh
2.6.2.3. Lây bệnh theo phương pháp đặt ẩm trên bông thấm dịch bào t
Hành, tỏi được đặt ẩm trong hộp bọc kín, tránh tạp nhiễm. Sau khoảng 1
tuần hành, tỏi bắt đầu ra rễ và nảy mầm
Nấm Fusarium sp.cấy trên môi trường PGA sau 7-9 ngày. Sau đó cạo sợi
nấm cho vào tuýp thủy tinh chứa 10ml nước cất khử trùng. Lắc cho bào tử đều
và đếm sao cho lượng bào tử đạt 106 và cho bông thấm nước vào. Sau đó, đặt
hành hoặc tỏi vào các tuýp và đặt các tuýp thí nghiệm vào môi trường sạch. Với
công thức đối chứng, bông được thấm nước cất vô trùng.
Phương pháp này có thể theo dõi sự phát triển của hành, tỏi và nấm bệnh
trong tuýp dễ dàng.
2.6.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Quy trình chiết DNA tổng số
Ngay trước khi chiết, ủđệm chiết CTAB có bổ sung BME với tỉ lệ 1ml đệm
CTAB :10 µL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 600 C trong 30 phút. Chú ý: 1 mẫu chiết cần 0.5 ml đệm.
Dùng que cấy nấm vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt đĩa nấm (phần ngoài rìa) để