khảo sát khả năng diệt khuẩn của ethanol đối vớic hủng vi khuẩn listeria monocytogenes tại công ty cổ phần đầu tư và phát triển đa quốc gia

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯỜ ƯỜNG ĐẠI THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGHIỆ BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHỆ THỰ PHẨ PHẠM THỊ MAI PHẠ THỊ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DIỆT KHUẨN CỦA KHẢ KHẢ DIỆ KHUẨ ETHANOL ĐỐI VỚI CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI CHỦ KHUẨ LISTERIA MONOCYTOGENES TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN ĐẦU TƯ VÀ PHÁT TRIỂN ĐA QUỐC GIA PHẦ ĐẦU PHÁ TRIỂ QUỐ Luận văn tốt nghiệp Luậ nghiệ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Ngà NGHỆ THỰ PHẨ Cần Thơ, Tháng 05/2014 Thơ Thá TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯỜ ƯỜNG ĐẠI THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGHIỆ BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHỆ THỰ PHẨ Luận văn tốt nghiệp Luậ nghiệ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Ngà NGHỆ THỰ PHẨ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DIỆT KHUẨN CỦA KHẢ KHẢ DIỆ KHUẨ ETHANOL ĐỐI VỚI CHỦNG VI KHUẨN CHỦ KHUẨ LISTERIA MONOCYTOGENES TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN ĐẦU TƯ VÀ PHÁT TRIỂN ĐA QUỐC GIA PHẦ ĐẦU PHÁ TRIỂ QUỐ Giáo viên hướng dẫn Giá viê ướng Sinh viên thực viê thự hiệ Ts LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY NGUYỄ PHẠM THỊ MAI PHẠ THỊ MSSV: C1200645 Lớp: CB1208L1 Cần Thơ, Tháng 05/2014 Thơ Thá Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp Ngày 20 tháng 05 năm 2014 Ký tên Phạm Thị Mai Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng i Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤ THUẬ ĐỒNG Luận văn "Khảo sát khả diệt khuẩn ethanol chủng vi "Khả khả diệ khuẩ đối chủ khuẩn Listeria monocytogenes Công ty Cổ phần đầu tư Phát triển Đa khuẩ phầ đầu Phá triể Quốc Gia" sinh viên Phạm Thị Mai thực theo hướng dẫn Ts Lê Quố Nguyễn Đoan Duy Luận văn báo cáo hội đồng chấm luận văn thông qua ngày 23 tháng 05 năm 2014 Cán hướng dẫn Chủ tịch hội đồng Lê Nguyễn Đoan Duy Nguyễ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ � LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: Thầy Lê Nguyễn Đoan Duy, giáo viên hướng dẫn, người tận tình bảo giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài luận văn Q thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập trường Đại học Cần Thơ Chân thành cám ơn Ban Giám Đốc Công ty CP Đầu tư Phát triển Đa Quốc Gia I.D.I tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài luận văn tốt nghiệp Công ty Cám ơn giúp đỡ nhiệt tình anh Nguyễn Văn Sáng - Trưởng phòng Quản lý chất lượng, bạn Nguyễn Thị Lam Kiều - Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm toàn thể đồng nghiệp Trung tâm Kiểm nghiệm suốt thời gian thực tập Công ty Kính chúc người sức khỏe gặp nhiều thành công sống Xin chân thành cám ơn! Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng iii Luận văn tốt nghiệp K38 liên thơng Trường Đại học Cần Thơ TĨM TẮT Khảo sát khả diệt khuẩn cồn etylic vi khuẩn Listeria monocytogenes thực cách hoạt hóa chủng mơi trường BHI pha lỗng mơi trường half-Fraser thành huyền phù ban đầu, cho cồn nồng độ 600, 700, 900 tuyệt đối vào dịch khuẩn để tìm nồng độ cồn thích hợp tiêu diệt hồn tồn lượng chủng khuẩn thử nghiệm Từ nồng độ cồn phù hợp, khảo sát tỷ lệ cồn: huyền phù tối ưu để diệt khuẩn thời gian tối thiểu nhất, từ ứng dụng thực tế mẫu vệ sinh cơng nghiệp có tiêm chủng Listeria monocytogenes Kết kiểm chứng phương pháp đếm khuẩn lạc môi trường thạch ALOA, số liệu tính tốn chương trình STATGRAPHIC PLUS 3.0 Kết phân tích số liệu cho thấy cồn 700 có khả diệt hết vi khuẩn tỷ lệ cồn:huyền phù 6:7 thời gian 60 giây Điều có nghĩa nồng độ cồn etylic phù hợp để tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn Listeria monocytogenes 700 khả ứng dụng thực tế mẫu vệ sinh công nghiệp Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng iv Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i OAN CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ii CHẤ THUẬ ĐỒNG .ii NG LỜI CẢM ƠN .iii .iii TÓM TẮT iv .iv MỤC LỤC v v DANH SÁCH BẢNG vii NG DANH SÁCH HÌNH viii NH viii CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠ ƯƠNG ĐẶT ĐỀ .1 1.1 GIỚI THIỆU GIỚ THIỆ 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU TIÊ NGHIÊ 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU NGHIÊ CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU CHƯƠ ƯƠNG ƯỢC KHẢ LIỆ 2.1 TỔNG QUAN VỀ NHÀ MÁY NHÀ 2.2.1 Lịch sử phát triển 2.2.2 Sơ đồ tổ chức .5 2.2.3 Sản phẩm cung cấp 2.2 QUY TRÌNH VỆ SINH CƠNG NGHIỆP TRONG NHÀ MÁY TRÌ NGHIỆ NHÀ 2.2.1 Vệ sinh hàng ngày 2.2.2 Vệ sinh cuối tuần 2.2.3 Biện pháp sát khuẩn 10 2.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES 10 KHUẨ 10 2.2.1 Lịch sử phát 10 2.2.2 Phân loại học 11 2.2.3 Hình thái học 13 2.2.4 Đặc điểm 13 2.2.5 Cấu trúc 14 2.2.6 Yếu tố độc lực 15 2.2.7 Con đường xâm nhiễm sinh bệnh học Listeria monocytogenes 16 2.2.8 Nguồn lây nhiễm 18 2.2.9 Bệnh triệu chứng Listeria monocytogenes gây 19 2.3 ETHANOL 20 ETHANOL 20 2.3.1 Cơng thức hóa học .20 2.3.2 Tính chất vật lý 21 2.3.3 Tính chất dung môi 21 2.3.4 Tính chất hóa học 22 2.3.5 Khả diệt khuẩn 23 2.3.6 Cơ chế diệt khuẩn 23 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 CHƯƠ ƯƠNG PHƯƠ ƯƠNG TIỆ PHƯƠ ƯƠNG PHÁ NGHIÊ 24 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24 PHƯƠ ƯƠNG TIỆ NGHIÊ 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 PHƯƠ ƯƠNG PHÁ NGHIÊ 3.2.1 THÍ NGHIỆM 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cồn đến khả diệt chủng khuẩn Listeria monocytogenes 24 3.2.2 THÍ NGHIỆM 2: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ cồn : huyền phù đến khả diệt chủng khuẩn L monocytogenes 28 3.2.3 THÍ NGHIỆM 3: Khảo sát khả diệt khuẩn cồn mẫu vệ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng v Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ sinh cơng nghiệp có tiêm chủng L.monocytogenes 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 CHƯƠ ƯƠNG QUẢ THẢ LUẬ 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CỒN ĐẾN KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT ƯỞNG ĐẾN KHẢ TIÊ DIỆ CHỦNG KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES 34 CHỦ KHUẨ 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ CỒN : HUYỀN PHÙ ĐẾN KHẢ NĂNG TIÊU ƯỞNG HUYỀ PHÙ ĐẾN KHẢ TIÊ DIỆT CHỦNG KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES 36 DIỆ CHỦ KHUẨ 4.3 KHẢ NĂNG DIỆT KHUẨN CỦA CỒN TRÊN NỀN MẪU VỆ SINH CÔNG KHẢ DIỆ KHUẨ TRÊ NGHIỆP CÓ TIÊM CHỦNG LISTERIA MONOCYTOGENES 38 NGHIỆ TIÊ CHỦ .38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 CHƯƠ ƯƠNG LUẬ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 LIỆ KHẢ PHỤ LỤC A: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY I PHỤ TRƯỜ ƯỜNG NUÔ PHỤ LỤC B: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH II PHỤ PHƯƠ ƯƠNG PHÁ PHÂ CH II Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng vi Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Các phản ứng phân biệt Listeria spp.············································· 13 phả phâ biệ spp.············································· Bảng 2.2: Giới hạn tăng trưởng Listeria monocytogenes····························· 14 Giớ trưở ưởng Bảng 2.3: Sự tồn chịu nhiệt Listeria monocytogenes··························· 14 chị nhiệ ···························1 Bảng 2.4: Cấu trúc gene Listeria monocytogenes··································· 15 trú ···································1 Bảng 4.1: Sự thay đổi mật số Listeria monocytogenes theo nồng độ cồn thời gian đổi thờ 60 giây································································································ 34 giâ Bảng 4.2: Sự thay đổi mật số Listeria monocytogenes theo tỉ lệ cồn 700:huyền phù khảo đổi :huyề phù khả sát - ·································································································· 35 Bảng 4.3: Hiệu diệt khuẩn Listeria monocytogenes cồn 700 Hiệ diệ khuẩ đối trê mẫu vệ sinh công nghiệp·········································································· 36 nghiệ ··········································································3 Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng vii Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ tổ chức Công ty···························································· ty···························································· Hình 2.2: Cấu trúc tế bào Listeria monocytogenes·········································· 15 trú Hình 2.3: Cấu tạo vật lý phiên mã nhóm gene định độc lực (LIPI-1) 2.3 phiê nhó quyế định độc vi khuẩn Listeria monocytogenes························································ 16 khuẩ Hình 2.4: Sinh lý bệnh học Listeria monocytogenes···································· 17 2.4 ····································1 Hình 2.5: Chu trình lây nhiễm Listeria monocytogenes cho người······················ 19 2.5 trì nhiễ ngườ ười Hình 2.6: Cấu trúc phân tử ethanol·······················································21 2.6 trú phâ ethanol······················································· ·······················································2 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1·····························································26 trí thí nghiệ ·····························································2 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2·····························································29 trí thí nghiệ ·····························································2 Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3·····························································32 trí thí nghiệ ·····························································3 Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn thay đổi mật số Listeria monocytogenes theo nồng độ cồn thị biể diễ đổi 34 Hình 4.2: Hình ảnh thí nghiệm cồn 600·················································· 35 thí nghiệ Hình 4.3: Hình ảnh thí nghiệm nồng độ cồn 600, 900 tuyệt đối············· 35 4.3 thí nghiệ tuyệ đối Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn thay đổi mật số Listeria monocytogenes theo tỉ lệ 4.4 thị biể diễ đổi cồn:huyền phù······················································································ 36 n:huyề phù Hình 4.5: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn :huyền phù 1:2·························· 37 4.5 thí nghiệ :huyề phù 1:2·························· Hình 4.6: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn :huyền phù 4:5·························· 37 4.6 thí nghiệ :huyề phù Hình 4.7: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn :huyền phù 5:6·························· 37 4.7 thí nghiệ :huyề phù Hình 4.8: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn :huyền phù 6:7·························· 38 4.8 thí nghiệ :huyề phù Hình 4.9: Hình ảnh thí nghiệm mẫu vệ sinh cơng nghiệp······················· 38 4.9 thí nghiệ nghiệ Hình 4.10: Chủng Listeria monocytogenes cấy ria ALOA (đối chứng)············39 4.10 Chủ 10: trê đối ng)············ ············3 Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng viii Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ Tiến hành thí nghiệm theo trình tự sau: � Mẫu thớt: Dùng tăm phết chủng lên bề mặt thớt, sau xịt cồn lên tồn bề mặt thớt để yên vòng phút Dùng ống nghiệm chứa tăm vô trùng tiến hành lấy mẫu theo đơn vị tính cm2 ghi nhãn � Mẫu rổ: Dùng tăm phết chủng lên bề mặt rổ, sau xịt cồn lên toàn bề mặt rổ để yên khoảng 60 giây Dùng ống nghiệm chứa tăm vô trùng tiến hành lấy mẫu theo đơn vị tính cm2 ghi nhãn � Mẫu găng tay: Dùng tăm phết chủng lên găng tay (kể kẽ tay), sau xịt cồn lên tồn găng tay để yên khoảng 60 giây Dùng ống nghiệm chứa tăm vô trùng tiến hành lấy mẫu theo đơn vị tính cm2 ghi nhãn � Mẫu bàn inox: Dùng tăm phết chủng lên bề mặt bàn, sau xịt cồn lên toàn bề mặt bàn để yên khoảng 60 giây Dùng ống nghiệm chứa tăm vô trùng tiến hành lấy mẫu theo đơn vị tính cm2 ghi nhãn Thí nghiệm có nghiệm thức, nghiệm thức cần ống HF đĩa ALOA Ghi nhãn tương ứng lên ống HF đĩa ALOA Chuyển tăm mẫu vệ sinh công nghiệp sang ống HF ghi nhãn tương ứng Trộn mẫu cho đồng chuyển hỗn dịch từ ống HF sang đĩa ALOA tương ứng, đĩa 100 µl Dàn mẫu thật nhanh tay đĩa cho thật khô que cấy trang Ủ đĩa ALOA 370C vòng 24 - 48 đọc kết Ghi nhận tên mẫu nồng độ pha lỗng với đĩa khơng có khuẩn lạc Đếm tất khuẩn lạc điển hình đĩa có diện khuẩn lạc Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 33 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN CHƯƠ ƯƠNG QUẢ THẢ LUẬ 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CỒN ĐẾN KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT ƯỞNG ĐẾN KHẢ TIÊ DIỆ CHỦNG KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES CHỦ KHUẨ Bảng 4.1: Mật số Listeria monocytogenes nồng độ cồn khảo sát thời gian 60 giây khả thờ giâ Nồng độ cồn khảo sát khả Mật số L monocytogenes (CFU/ml) (*) 600 7,1 x 105 a 700 < 10 b 900 < 10 b Tuyệt đối < 10 b (*) Giá trị trung bình lần lặp lại Các chữ a, b, c, .thể khác biệt ý nghĩa nghiệm thức cột Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn thay đổi mật số Listeria monocytogenes theo nồng độ cồn thị biể diễ đổi Theo số liệu bảng 4.1 đồ thị 4.1: tăng nồng độ cồn từ 600 đến 700 mật số L monocytogenes giảm có ý nghĩa, tăng nồng độ cồn từ 700 lên 900 tuyệt đối khơng có khác biệt ý nghĩa mẫu Sự thay đổi mật số L monocytogenes đồ thị 4.1 cho thấy rằng: nồng độ cồn 60%, vi khuẩn L monocytogenes bị diệt bớt chưa đáng kể (giảm từ 108 xuống 105 CFU/ml) Nhưng tăng nồng độ cồn lên từ 70% khả diệt khuẩn thể Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 34 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ rõ rệt, đường đồ thị xuống lao dốc cồn 700 tiêu diệt hết chủng L monocytogenes Khi tăng nồng độ cồn lên 90% 99,9% đường đồ thị nằm ngang nồng độ cồn tiêu diệt hoàn toàn lượng chủng khuẩn thử nghiệm Như vậy, so sánh nồng độ cồn lựa chọn nồng độ cồn 700 hợp lý cồn 700 bay chậm cồn 900 cồn tuyệt đối Mặt khác, xét mặt kinh tế lựa chọn nồng độ cồn 700 có lợi giá thành thấp Hình 4.2 cho biết với mẫu khảo sát với cồn 600 số khuẩn lạc L monocytogenes đếm đĩa ALOA nồng độ pha loãng 10-3 Hình 4.3 cho biết với mẫu khảo sát với cồn 700, 900 tuyệt đối độ pha lỗng (100) khơng có diện khuẩn lạc L monocytogenes đĩa ALOA Hình 4.2: Hình ảnh thí nghiệm cồn 600 thí nghiệ Hình 4.3: Hình ảnh thí nghiệm nồng độ cồn 700, 900 tuyệt đối thí nghiệ tuyệ đối Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 35 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ CỒN : HUYỀN PHÙ ĐẾN KHẢ NĂNG TIÊU ƯỞNG HUYỀ PHÙ ĐẾN KHẢ TIÊ DIỆT CHỦNG KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES DIỆ CHỦ KHUẨ Bảng 4.2: Mật số Listeria monocytogenes tỷ lệ cồn 700:huyền phù khảo sát :huyề phù khả Tỉ lệ cồn : huyền phù khảo sát huyề phù khả Mật số L monocytogenes (CFU/ml) (*) 1:2 7,0 x 105 a 2:3 6,8 x 105 b 3:4 6,0 x 105 c 4:5 5,0 x 102 d 5:6 1,2 x 102 e 6:7 1f (*) Giá trị trung bình lần lặp lại Các chữ a, b, c, .thể khác biệt ý nghĩa nghiệm thức cột Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn thay đổi mật số L monocytogenes theo tỉ lệ cồn:huyền thị biể diễ đổi n:huyề phù phù Từ số liệu bảng 4.2 đồ thị hình 4.4 cho thấy: mật số L monocytogenes tỉ lệ cồn:huyền phù 6:7 giảm đến mức thấp cho kết khác biệt ý nghĩa so với tỉ lệ cịn lại Theo đồ thị hình 4.4, tăng tỉ lệ cồn:huyền phù từ 1:2 lên đến 3:4 mật số L monocytogenes giảm dần khơng đáng kể (vẫn cịn dày đặc Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 36 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ khoảng 105 CFU/ml), đồ thị xuống Khi tăng tỉ lệ cồn:huyền phù lên 4:5 mật số L monocytogenes giảm nhiều (giảm từ 105 xuống 102 CFU/ml), đồ thị xuống dốc Khi tăng tỉ lệ cồn:huyền phù lên 5:6 mật số L monocytogenes giảm khơng nhiều (vẫn cịn 102 CFU/ml), đồ thị gần nằm ngang mật số L monocytogenes lúc không nhiều ban đầu Khi tăng tỉ lệ cồn:huyền phù lên 6:7 mật số L monocytogenes giảm hồn tồn (giảm từ 102 xuống cịn CFU/ml), đồ thị nằm ngang chênh lệch mật số L monocytogenes so với ban đầu Như vậy, tỉ lệ cồn:huyền phù 6:7 cồn 700 diệt hồn tồn chủng L monocytogenes Hình 4.5 cho biết với mẫu khảo sát với tỉ lệ cồn 700:huyền phù 1:2 khuẩn lạc L monocytogenes diện dày đặc đĩa ALOA Hình 4.6 4.7 cho biết với mẫu khảo sát với tỉ lệ cồn 700:huyền phù 4:5 5:6 khuẩn lạc L monocytogenes diện đĩa ALOA Hình 4.8 cho biết với mẫu khảo sát với tỉ lệ cồn 700:huyền phù 6:7 khơng có diện khuẩn lạc L monocytogenes đĩa ALOA Hình 4.5: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn:huyền phù 1:2 (khuẩn lạc diện dày đặc) thí nghiệ n:huyề phù (khuẩ hiệ diệ đặc) Hình 4.6: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn:huyền phù 4:5 (khuẩn lạc diện hơn) thí nghiệ n:huyề phù (khuẩ hiệ diệ Hình 4.7: Hình ảnh thí nghiệm tỉ lệ cồn:huyền phù 5:6 (khuẩn lạc diện nồng độ 100) thí nghiệ n:huyề phù (khuẩ hiệ diệ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 37 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thơng Trường Đại học Cần Thơ Hình 4.8: Hình ảnh thí nghiệm tỷ lệ cồn:huyền phù 6:7 (khuẩn lạc khơng diện đĩa) thí nghiệ n:huyề phù (khuẩ khô hiệ diệ trê đĩa) 4.3 KHẢ NĂNG DIỆT KHUẨN CỦA CỒN TRÊN NỀN MẪU VỆ SINH KHẢ DIỆ KHUẨ TRÊ CƠNG NGHIỆP CĨ TIÊM CHỦNG LISTERIA MONOCYTOGENES NGHIỆ TIÊ CHỦ Bảng 4.3: Hiệu sát khuẩn Listeria monocytogenes cồn 700 mẫu vệ sinh Hiệ khuẩ đối trê công nghiệp nghiệ Tên mẫu khảo sát khả Mật số L monocytogenes (CFU/cm2) (*) Thớt Rổ Găng tay Bàn inox (*) Giá trị trung bình lần lặp lại Hình 4.9: Hình ảnh thí nghiệm mẫu vệ sinh công nghiệp (khuẩn lạc không diện đĩa thí nghiệ nghiệ (khuẩ khơ hiệ diệ trê đĩa ALOA) Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 38 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thơng Trường Đại học Cần Thơ Hình 4.10: Chủng L monocytogenes cấy ria ALOA (mẫu đối chứng) Chủ trê (mẫ đối Từ số liệu thí nghiệm bảng 4.3 với hình ảnh thí nghiệm hình 4.9 hình 4.10 nhận thấy với nồng độ cồn lựa chọn từ thí nghiệm ứng dụng mẫu thực tế cho kết hoàn toàn phù hợp (cồn 700 tiêu diệt hoàn toàn chủng L monocytogenes thử nghiệm) Điều có nghĩa hồn tồn áp dụng khả diệt khuẩn cồn 700 thực tế việc sát khuẩn bề mặt thiết bị, dụng cụ người nhà máy chế biến thực phẩm Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 39 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ CHƯƠ ƯƠNG LUẬ NGHỊ Kết luận luậ Khả diệt khuẩn cồn etylic chủng khuẩn Listeria monocytogenes sau khảo sát kết luận rằng: Cồn tiêu diệt hồn tồn Listeria monocytogenes nồng độ 700 với tỉ lệ cồn : huyền phù 6:7 thời gian 60 giây Đề nghị nghị Ưu điểm cồn etylic so với chất diệt khuẩn khác dễ điều chế, dễ bay hơi, chi phí sản xuất thấp, khơng gây hư hỏng thiết bị nhà xưởng, khơng độc hại Do đó, áp dụng vào nhà máy sản xuất để diệt khuẩn bề mặt tiếp xúc thiết bị, máy móc, dụng cụ người sau vệ sinh chất tẩy rửa Do đề tài nghiên cứu quy mơ phịng thí nghiệm nên khả bay cồn ít, áp dụng thực tế nên sử dụng cồn 700 với tỉ lệ cồn: huyền phù 1:1 để vi khuẩn chắn bị tiêu diệt Có thể tiến hành khảo sát khả diệt khuẩn chất diệt khuẩn khác Listeria monocytogenes cồn etylic số vi khuẩn gây bệnh khác Có thể nghiên cứu kết hợp cồn etylic với số hợp chất giúp cồn lâu bay nhằm tăng hoạt tính diệt khuẩn Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 40 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO LIỆ KHẢ Tiếng Việt Tiế Việ Hồ Linh Phương (2009) Ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID' L mono để phát Listeria monocytogenes thực phẩm thủy sản Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành Chế biến thủy sản Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suc-khoe/35535_Canh-giac-voi-vi-khuangay-chet-nguoi-khi-dung-thuc-pham.aspx Tiếng Anh Tiế Aureli P, Fiorucci GC, Caroli D, Marchiaro G, Novara O, Leone L, Salmaso S (2000) An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes New England Journal of Medicine 342 342:1236–1241 BAM: Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes, April 2011, Bacteriological Analytical Manual, Chapter 10: Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods Brackett RE (1987) Antimicrobial effect of chlorine on Listeria monocytogenes J Food Prot 50 999-103 50: Celine A Nadon, David L Woodward, Carol Young, Frank G Rodgers and Martin Weidmann (2001) Correlations between Molecular Subtyping and Serotyping of Listeria monocytogenes Journal of Clinical Microbiology 74 (1): 203 Costigan MJ, Hodges LJ, Marsh KN, Stokes RH, Tuxford CW (1980) The Isothermal Displacement Calorimeter: Design Modifications for Measuring Exothermic Enthalpies of Mixing Aust J Chem 33 (10): 2103 Dagely S, Dawes EA, Morrison GA (1950) Inhibition of growth of Aerobacter aerogenes: the mode of action of phenols, alcohols, acetone and ethyl acetate J Bacteriol 60 60:369–378 David R Lide, editor (2000) CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81st edition CRC press Dongyou Liu, Mark L Lawrence, Lisa Gorski, Robert E Mandrell, A Jerald Ainsworth, and Frank W Austin (2006) Listeria monocytogenes Serotype 4b Strains Belonging to Lineages I and III Possess Distinct Molecular Features Journal of Clinical Microbiology 44 (1): 214-217 Doyle ME, Mazzotta AS, Wang T, Wiseman DW, and Scott VN 2001 Heat resistance of Listeria monocytogenes Journal of Food Protection 64 (3): 410-429 10 Farber JM and Peterkin PI (1991) Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen Microbiology and Molecular Biology Reviews 55 (3): 476–511 11 Fiedler F (1988) Biochemistry of the cell surface of Listeria strains: a locating general view Infection 16 Suppl 2: S92–7 Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 41 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ 12 Garg N, Churey JJ, Splittstoesser DF (1990) Effect of processing conditions on the microflora of fresh-cut vegetable J Food Prot 55 701-703 55: 13 George M Garrity, Julia A Bell and Timothy G Lilburn (2004) Taxonomic Outline of the Prokaryotes Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edition 14 Hanna Miettinen (2006) Listeria monocytogenes in fish farming and processing Academic Dissertation Department of Food and Environmental Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, University of Helsinki, Finland 15 Helle Understad, Inger Nilsson, Henrik Ericsson, Marie-Louise Danielsson-tham (1999) Division of Listeria monocytogenes Serovar 1/2a Strains into Two Groups by PCR and Restriction Enzyme Analysis Applied and Environmental Microbiology 65 65(5): 2054-2056 16 Holland S., Alfonso E., Heidegger D., Mendelsohn A., Ullman S., Miller D (1987) Corneal ulcer due to Listeria monocytogenes Cornea (2): 144–146 17 ISO 11290 - 2, 1st edition (01-07-1998) and Amendment (15-10-2004): Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2: Enumeration method, Amendment 1: Modification of the enumeration medium 18 Jacquet C., Doumith M., Gordon I.J., Martin M.P., Cossart P and Lecuit M (2004) A molecular marker for evaluating the pathogenic potential of foodborne Listeria monocytogenes The Journal of Infectious Disease 189 189:2094-2100 19 José A Vázquez-Boland, Micheal Kuhn, Patrick Berche, Trinad Chakraborty, Gustavo Domínguez-Bernal, Werner Goebel, Bruno González-Zorn, Jürgen Wehland, Jürgen Kreft Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants Clin Microbiol Rev 2001b 14 (3): 584-640 20 Kenneth Todar (2008) Listeria monocytogenes Todar's Online Textbook of Bacteriology Retrieved January 28, 2009 21 Larson EL, Morton HE (1991) Alcohols In: Block SS, editor Disinfection, sterilization and preservation 4th ed Philadelphia (PA): Lea & Febiger , p 191-203 22 Lei Z, Wang H, Zhou R, Duan Z (2002) Influence of salt added to solvent on extractive distillation Chem Eng J 87 (2): 149 23 Lide D.R (2000) CRC Handbook of Chemistry and Physics 81st edition CRC press 24 Martin Cormican, Cyril Carrol, Dan Collins, Hellen Cowman, Geraldine Duffy, Michael Fallon, Seamus Fanning, Cliodhna Foley-Nolan, Colin Hill, Cathal Kearney, Paul Ross, Peter Smith (2005) The Control and Management of Listeria monocytogenes Contamination of Food Food Safety Authority of Ireland, Abbey Court, Lower Abbey Street, Dublin 25 McDonnell G, Russell AD (1999) Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 42 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ 26 McLauchlin J (1987) Listeria monocytogenes, recent advances in the taxonomy and epidemiology of listeriosis in humans Journal of Applied Bacteriology 63 pp 1-11 63, 27 McLauchlin J., Greenwood M.H., Pini P.N (1990) The occurrence of Listeria monocytogenes in cheese from a manufacturer associated with a case of listeriosis Internation Journal of Food Microbiology 10 pp 255-262 10, 28 Mitchell L Gray and Arden H Killinger (1966) Listeria monocytogenes and listeric infection Bacteriological Reviews 30 (2): 309 29 Morton H E (1983) Alcohols In: Bloch S S, editor Disinfection, sterilization, and preservation 3rd ed Philadelphia, Pa: Lea & Febiger, pp 225–239 30 National Food Safety Initiative Project, Agreement No 00-51110-9769, 2000 to 2003, Control Strategies for Listeria monocytogenes in Seafood Processing Plants 31 Nyfeldt, A (1929) Etiologie de la mononucléose infectieuse C R Soc Biol 101 101: 590-592 32 Pemberton RC, Mash CJ (1978) Thermodynamic properties of aqueous nonelectrolyte mixtures II Vapour pressures and excess Gibbs energies for water + ethanol at 303.15 to 363.15 K determined by an accurate static method J Chem Thermodyn 10 (9): 867 33 Robert W Armstrong and Peter C Fung (1993) Brainstem encephalitis (Rhombencephalitis) due to Listeria monocytogenes: case report and review Clin Infect Dis 16 (5): 689–702 34 Ryser, E T., and E H Marth (1999) Listeria, Listeriosis and Food Safety New York, NY: Marcel Dekker, Inc 35 Schlech, W.F., Lavigne, P.M., Bortolussi, R.A., Allen, A.C., Haldane, E.V., Wort, A.J., Hightower, A.W., Johnson, S.E., King, S.H., Nicholls, E.S., Broome, C.V (1983) Epidemic listeriosis evidence for transmission by food N Engl J Med 308 203308: 206 36 Seeliger H P R (1961) Listeriosis 2nd ed Karger, Basel 37 Sykes G (1939) The influence of germicides on the dehydrogenases of Bacterium coli J Hyg., Camb 39 463–469 39: 38 Tilney G.L and Portnoy A.D (1989) Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes The Journal of Cell Biology 109 1597-1608 109: 39 Todd J Ward, Lisa Gorski, Monica K Borucki, Robert E Mandrell, Jan Hutchins, and Kitty Pupedis (2004) Intraspecific Phylogeny and Lineage Group Identification Based on the prfA Virulence Gene Cluster of Listeria monocytogenes Journal of Bacteriology 186 (15): 4994-5002 40 Tompkin, R.B (2002) Control of Listeria monocytogenes in the food-processing environment J Food Prot 65 709-725 65: 41 Trujillo R, Laible N (1970) Reversible inhibition of spore germination by alcohols Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 43 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Trường Đại học Cần Thơ Appl Microbiol 20 620–623 20: Wehr, H.M (1987) Listeria monocytogenes-a current dilemma J Assoc Off Anal Chem 70 769-772 70: Wexler H., Oppenheim J D (1979) Isolation, characterization, and biological properties of an endotoxin-like material from the gram-positive organism Listeria monocytogenes Infection and Immunity 23 (3): 845–857 Whitelock-Jones L., Carswell J., Rassmussen K C (1989) Listeria pneumonia A case report" South African Medical Journal 75 (4): 188–189 Windholz, Martha (1976) The Merck index: an encyclopedia of chemicals and drugs (9th ed.) Rahway, N.J., U.S.A: Merck Yasuda-Yasuki YS, Namiki-Kanie and Hachisaka Y (1978) Inhibition of germination of Bacillus subtilis spores by alcohols Edited by Chambliss G, Vary JC Spores VII Washington, D.C: American Society for Microbiology P: 113-116 Youwen Pan, Frederick Breidt, Jr and Sophia Kathariou (2009) Competition of Listeria monocytogenes Serotype 1/2a and 4b Strains in Mixed-Culture Biofilms Applied And Environmental Microbiology 75 (18): 5846-5852 Zhang S, Farber JM (1996) The effect of various disinfectantss against Listeria monocytogenes on fresh-cut vegetable Food Microbiol 13 311-321 13: http://www.fooddoctors.com/FSF/fsf3.html The Food Safety File, Chapter 4: Listeria monocytogenes, Edition 2008 www.reeis.usda.gov/web/crisproject pages/0185820-surface-destruction-of-Listeria monocytogenes-by-ozone-and-chlorine.html http://textbookofbacteriology.net/Listeria.html http://en.wikipedia.org/wiki/Ethanol Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 44 Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC A: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY PHỤ TRƯỜ ƯỜNG NUÔ Mơi trường Half Fraser (HF) trườ ường Hịa tan 55 g Fraser Listeria selective Enrichment Broth (1.10398) L nước cất, hấp trùng 1210C/15 phút, làm nguội xuống 450C Sau bổ sung chai Fraser suplement (1.00092; 1.00093) nhiệt độ phòng vào lắc Môi trường Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) trườ ường Hòa tan 35 g Listeria Selective Agar Base (1.00427) vào 476 ml nước cất, hấp trùng 1210C/15 phút, làm nguội xuống 45-500C bể điều nhiệt Bổ sung chai supplement (1.00439; 1.00432) nhiệt độ phòng vào, lắc đổ đĩa từ 12-15 ml Môi trường thạch máu Blood Agar (BA) trườ thạ ường Hòa tan g Blood Agar Base (1.10886) 200 ml nước cất, hấp trùng 1210C/15 phút, làm nguội xuống 450C bổ sung 10 ml máu cừu tiệt trùng, lắc đổ đĩa từ 12-15 ml Mơi trường Brain Heart Infusion (BHI) trườ ường Hịa tan 3,7 g Brain Heart Infusion Broth (1.10493) 100 ml nước cất, chiết ống ml, hấp trùng 1210C/15 phút, để nguội nhiệt độ phòng Môi trường D - Xylose; L (+) Rhamnose trườ ường Xylose; - Mơi trường bản: Hịa tan 1,5 g Phenol Red Broth (1.10987) 80 ml nước cất, hấp trùng 1210C/15 phút (dùng cho loại đường) - Pha dung dịch đường: Hòa tan 0,5 g loại đường 20 ml nước cất tiệt trùng lọc qua màng lọc minisert Trộn dung dịch đường sau lọc vào môi trường Phenol Red, chiết ống khoảng ml Môi trường di động Motility trườ ường động Hòa tan 2,2 g Motility test medium (7323674) 100 ml nước cất, hấp trùng 1210C/15 phút, làm nguội xuống 45-500C bổ sung thêm 0,5 ml TTC 1% (2,3,5 tryphenyl tetrazoliumchloride 1%), chiết ống khoảng ml, để nguội Thuốc thử Thuố thử - KOH 3%: Hòa tan g KOH 100 ml nước cất, chứa chai tối màu - Catalase: Dùng dung dịch H2O2 3% (hydrogen peroxyde 3%) Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng I Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC B: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ PHƯƠ ƯƠNG PHÁ PHÂ Phương pháp phân tích dựa tiêu chuẩn ISO 11290-2: 1998/Amendment 1: 2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2: Enumeration method, Amendment 1: Modification of the enumeration medium Nguyên tắc Nguyê - Chuẩn bị huyền phù ban đầu pha loãng thêm cần thiết - Để cho phục hồi khoảng 200C - Cấy trang đĩa môi trường rắn chọn lọc - Ủ 370C 24 - 48 - Đếm khuẩn lạc L monocytogenes điển hình khẳng định test sinh hóa - Từ số khuẩn lạc khẳng định, tính tốn số lượng L monocytogenes g ml mẫu thử Quy trình thí nghiệm trì thí nghiệ Pha lỗng mẫu mơi trường half-Fraser (đến 10-1, 10-2, ) để yên 200C nhằm phục hồi tế bào tổn thương cần thiết Từ ống half-Fraser (HF), dùng micropipette chuyển 0,1 ml dịch sang đĩa ALOA (lặp lại đĩa) Dùng que cấy trang nhẹ nhàng dàn mẫu đĩa khô, lật ngược đĩa ủ 370C 24 - 48 Sau ủ, khuẩn lạc L monocytogenes điển hình có màu xanh ngọc, đường kính khoảng 1,5 - mm, có quầng sáng xung quanh Chọn đĩa có số khuẩn lạc 150, đếm tất khuẩn lạc mọc đĩa Lấy đĩa khuẩn lạc cấy chuyển sang ống BHI, ủ 370C - giờ, sau khẳng định thử nghiệm sinh hóa: - Thử nghiệm biến dưỡng đường: Từ ống BHI, cấy sang ống nghiệm Phenol Thử nghiệ biế ưỡng đường: Red có chứa đường Xylose Rhamnose, quan sát vòng 24 - 48 Kết dương tính ống nghiệm chuyển từ màu đỏ sang màu vàng L monocytogenes lên men đường Rhamnose khơng có khả lên men đường Xylose - Thử nghiệm CAMP: Cấy ria đường chủng Staphylococcus aureus Thử nghiệ Rhodococcus equi theo đường thẳng đứng song song, cách cm đĩa Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng II Luận văn tốt nghiệp K38 liên thông Trường Đại học Cần Thơ thạch máu cừu Sau đó, lấy sinh khối vi khuẩn từ ống BHI cấy ria thẳng góc thành đường song song vào giữa, gần không chạm vào đường cấy S aureus R equi, cách khoảng - mm Cấy đồng thời chủng chứng dương L monocytogenes, L innocua, L ivanovi để kiểm tra đĩa Ủ 37 0C / 1824 Phản ứng dương tính xuất vùng cộng hưởng tan huyết phát triển ranh giới chủng cần thử với chủng cần thử với chủng S aureus R equi - Thử nghiệm tan huyết: Cấy sinh khối từ BHI vào đĩa thạch máu, ủ 370C Thử nghiệ huyế 24 giờ, kiểm tra tan huyết L monocytogenes tan huyết bao quanh vùng sáng hẹp xung quanh đường cấy tượng dung huyết β - Thử nghiệm khả di động: Lấy sinh khối từ BHI cấy đâm sâu vào Thử nghiệ khả động: thạch ống nghiệm chứa môi trường Motility agar Ủ 250C 48 Kiểm tra phát triển xung quanh đường cấy đâm sâu Thử nghiệm dương tính vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm đục môi trường xung quanh Listeria spp di động tạo thành tán dù bề mặt thạch Tính toán kết toá Số lượng L monocytogenes diện g ml sản phẩm tính tốn theo cơng thức: ∑a N= ∑a V (n1 + 0,1n2 )d : tổng số khuẩn lạc L monocytogenes đếm sau khẳng định tất số đĩa giữ lại độ pha loãng V : thể tích dịch khuẩn trang đĩa n1 : số đĩa nồng độ pha loãng thứ n2 : số đĩa nồng độ pha loãng thứ hai d : hệ số pha loãng Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng III ... tổ chức Công ty I Công ty con, công ty liên kết: liê - Công ty cổ phần Đầu tư Du lịch Phát triển thủy sản (TRISEDCO) - Công ty cổ phần Tư vấn Đầu tư Tài (ASTAR) - Cơng ty cổ phần Đầu tư Địa ốc... KHUẨ ETHANOL ĐỐI VỚI CHỦNG VI KHUẨN CHỦ KHUẨ LISTERIA MONOCYTOGENES TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN ĐẦU TƯ VÀ PHÁT TRIỂN ĐA QUỐC GIA PHẦ ĐẦU PHÁ TRIỂ QUỐ Giáo vi? ?n hướng dẫn Giá vi? ? ướng Sinh vi? ?n thực vi? ?... đến khả diệt chủng khuẩn Listeria monocytogenes � Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ cồn : huyền phù đến khả diệt chủng khuẩn Listeria monocytogenes � Khảo sát khả diệt chủng khuẩn Listeria monocytogenes