phân lập và xác định mầm bệnh vi khuẩn trên cá lóc (channa striata) nuôi thương phẩm

Kết quả phân lập được 98 chủng vi khuẩn và định danh được 12 chủng thuộc giống Edwardsiella, 4 chủng thuộc giống Streptococcus, 42 chủng Aeromonas và 11 chủng Aeromonas hydrophila thuộc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ YẾN NHI

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MẦM BỆNH VI KHUẨN

TRÊN CÁ LÓC (Channa striata) NUÔI THƯƠNG PHẨM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ YẾN NHI

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MẦM BỆNH VI KHUẨN

TRÊN CÁ LÓC (Channa striata) NUÔI THƯƠNG PHẨM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths NGUYỄN THỊ THU HẰNG

2014

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MẦM BỆNH VI KHUẨN TRÊN

CÁ LÓC (Channa striata) NUÔI THƯƠNG PHẨM

Nguyễn Thị Yến Nhi * và Nguyễn Thị Thu Hằng

* Lớp BHTS K36, Đại học Cần Thơ Email: nhi103269@student.ctu.edu.vn

ABSTRACT

The aim of this study was to investigate pathogen infection to snakehead in intensive pond culture system in the Mekong Delta provinces: An Giang and Dong Thap, Tra Vinh A total of 52 samples, showing secretion of swimming lethargic, feeding reduction, mucus mass, red spots and white spots on the body and threadfin, were colected from the culture ponds in the period of February to April, 2014 The result

indicated 3 genera of bacteria which infected to cultured snakehead: 11 Aeromonas

hydrophila, 12 Edwardsiella, 4 Streptococcus; and the results showed that the

selected bacterial isolates showed the highest sensitivity to florfenicol (FFC) and doxycycline (DO), cefazolin (KZ) and cotrim (COT) but were completely resistant to erythromycin (E), gentamicin (GM) and neomycin (N)

Keywords: Channa striata, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella, Streptococcus.

TÓM TẮT

Đề tài nhằm khảo sát một số loài vi khuẩn thường gây bệnh trên cá lóc nuôi thâm canh trong ao ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (An Giang, Đồng Tháp và Trà Vinh) Tổng số có 52 mẫu cá được thu trong thời gian từ tháng 2 đến tháng 4 năm 2014 Mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, lở loét, xuất huyết, thận và tỳ tạng có nhiều đốm trắng, vây tưa rách Kết quả phân lập được 98 chủng vi khuẩn và

định danh được 12 chủng thuộc giống Edwardsiella, 4 chủng thuộc giống

Streptococcus, 42 chủng Aeromonas và 11 chủng Aeromonas hydrophila thuộc giống Aeromonas Bên cạnh đó, kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng vi khuẩn A

hydrophila vẫn còn nhạy cao với florfenicol và doxycycline, chiếm 72,2%, cotrim

chiếm 45,5% và nhưng kháng với erythromycin và gentamin, chiếm tới 90,9%, cefazolin chiếm 63,6%, neomycin chiếm 45,3%

1 GIỚI THIỆU

Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã không ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế đất nước nói chung Trong đó, đối tượng cá lóc (Channa striata) với những ưu điểm như

là loài cá có kích thước lớn, thịt thơm ngon, sinh trưởng nhanh, giá thành cao, thị trường tiêu thụ ổn định, thức ăn không đòi hỏi chất lượng quá cao và giá thành sản xuất thấp nên các quốc gia đang phát triển đặc biệt chú trọng đến phát triển nuôi loài

cá này Tuy nhiên, nuôi cá lóc cũng gặp không ít khó khăn về con giống, thức ăn, đặc biệt khi nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn, thiệt hại cũng nhiều hơn và ảnh hưởng đến năng suất

và chất lượng thực phẩm Một số bệnh thường xuất hiện trên cá lóc như bệnh do vi khuẩn, bệnh ký sinh trùng và bệnh do nấm gây ra (Lư Trí Tài, 2010) Theo kết quả khảo sát của Phạm Đăng Phương (2010) cho thấy có 7 loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi cá lóc: bệnh xuất huyết (50,7%), bệnh ký sinh trùng (49,6%), bệnh lở loét (19,5%), bệnh gan thận mủ (13,3%), bệnh đẹn họng (đỏ xoang miệng) (15%), bệnh chướng hơi sình bụng (8,8%) và bệnh nấm trên thân cá (3,5%) Theo điều tra của Nguyễn Thanh Phương và ctv (2007) thì số nông hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện vào mùa lũ chiếm tới 88% Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện trên động vật thủy sản do vi khuẩn chiếm tới 50,9% Tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn lên tới 100% (Bùi Quang Tề, 2008).Qua những nghiên cứu trên, có thể nói bệnh cá chủ yếu là do vi khuẩn, nấm, và ký sinh trùng, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn gây ra là nguyên nhân gây nên thiệt hại lớn cho cá lóc nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành NTTS Do vậy, tiến hành thực hiện

đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá lóc (Chana striata) nuôi thương

phẩm” là rất cần thiết nhằm cung cấp đầy đủ và khái quát hơn về bệnh vi khuẩn trên

cá lóc Từ đó, đưa ra được các biện pháp phòng và trị bệnh trên đối tượng này được hiệu quả hơn

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm cá lóc

Mẫu cá lóc bệnh được thu từ 8 ao nuôi thâm canh ở An Giang (Long Xuyên và Châu Phú), 3ao nuôi thâm canh ở Đồng Tháp (Tam Nông) và 4 ao ở Trà Vinh Mẫu được thu trong khoảng thời gian có cá bệnh xuất hiện từ tháng 2 đến tháng 4 năm 2014 Mỗi ao thu 3 mẫu cá khỏe (không có dấu hiệu bệnh lý) và 3-5 mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý Mẫu cá được phân tích tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh học Thủy sản - Khoa thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ

Phương pháp phân lập vi khuẩn

Quan sát và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý bên ngoài Dùng cồn 70% sát trùng bên ngoài

cá, lau sạch, mổ xoang bụng, quan sát và ghi nhận dấu hiệu bên trong Phân lập vi khuẩn bằng cách rạch một đường ở gan, thận và tỳ tạng bằng dao tiệt trùng, dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm từ điểm vừa rạch và cấy trên môi trường NA hoặc TSA Mẫu cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C Sau 24 đến 48 giờ, ghi nhận màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc và tiến hành tách ròng đến khi đạt đĩa cấy thuần (Từ Thanh Dung, 2012)

Phương pháp định danh vi khuẩn

Các chỉ tiêu về hình thái, một số chỉ tiêu về sinh lý và sinh hóa được chọn để xác định vi khuẩn phân lập được trên cá lóc bệnh theo các chỉ tiêu định danh vi khuẩn

mô tả bởi John (1999) và Barrow and Feltham (1993) Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow and Feltham, 1993) Đặc điểm sinh lý sinh hóa được xác định theo cẩm nang của Cowan

và Steels (Barrow and Feltham, 1993) và bộ kít API 20E (BioMerieux)

Phương pháp lập kháng sinh đồ

Phương pháp lập kháng sinh đồ được thực hiện theo tài liệu The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2006), sử dụng môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany), chọn 7 loại kháng sinh (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France): Doxycycline (DO/30µg), Florfenicol (FFC/30µg), Cefazolin (KZ/10µg), Neomycin (N/30µg), Gentamycin (GM/10µg), Erythromycin

(E/30µg), Cotrim (COT/1.25/23.75/µg) Dòng vi khuẩn chuẩn Escherichia coli

ATCC 25922 được sử dụng làm chủng tham chiếu Đo đường kính vòng vô trùng (mm): Dựa vào chuẩn đường kính của vòng vô trùng theo tài liệu (CLSI) (2006) nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, nhạy trung bình và kháng

3.1 Dấu hiệu bệnh lý

Qua 4 đợt thu mẫu, tổng cộng đã thu được 52 mẫu cá (An giang: 24 mẫu; Đồng Tháp: 13 mẫu; Trà Vinh: 15 mẫu) trong đó có 9 mẫu cá giống và 43 mẫu cá thịt Nhìn chung, các mẫu cá lóc có dấu hiệu bệnh lý như: bơi lờ đờ trên mặt nước, màu sắc nhợt nhạt, thân, vây và xoang miệng xuất huyết (Hình 1A), đặc biệt ở An Giang

cá lóc có dấu hiệu bệnh lý nặng hơn như có các vết loét ăn sâu vào cơ, mòn, cụt vi đuôi và xuất hiện các búi bông gòn trên vết loét (Hình 1B) Bên cạnh đó, khi giải phẫu thấy có nhiều đốm trắng li ti trên gan, thận và tỳ tạng (Hình 1C); xoang bụng có dịch đỏ, gan bầm đen, gan và tỳ tạng bị sưng to (Hình 1D)

Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu khảo sát mầm bệnh trên cá lóc nuôi

thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp của Phạm Minh Đức và ctv (2012) Nghiên

cứu này cũng đã xác định cá lóc nhiễm mầm bệnh vi khuẩn thường có một số dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như xuất huyết, lở loét, có đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng, nội tạng có mùi hôi… Đồng thời các dấu hiệu cá bơi lờ đờ, ăn ít; thân, vây và đầu bị xuất huyết; nội quan sẫm màu, có chất dịch màu đỏ bầm trong xoang bụng ở cá lóc giống trong đề tài nghiên cứu của Nguyễn Tín Trọng (2011) và Nguyễn Văn Út (2013)

Hình 1: A: Cá lóc bị xuất huyết toàn thân (mũi tên),

B: Lở loét trên thân, mang, mòn cụt vi đuôi và có búi bông gòn xung quanh

loét (mũi tên),

C: tỳ tạng có đốm trắng, gan vàng-xanh (mũi tên),

D: xoang bụng có dịch, gan bầm, tỳ tạng sƣng to (mũi tên)

3.2 Kết quả phân lập và định danh

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 98 chủng vi khuẩn trên cá lóc bị bệnh nuôi thâm canh trong ao Tất cả các chủng vi khuẩn này đều được kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa cơ bản như: nhuộm Gram, oxidase, catalase, di động, O/F Dựa vào đặc điểm hình thái và chỉ tiêu sinh lý đã xác định hai nhóm vi khuẩn là: nhóm Gram dương, hình cầu và nhóm Gram âm, hình que Nhóm vi khuẩn Gram dương được định danh đến giống, riêng các chủng vi khuẩn Gram âm được định danh bằng bộ Kít API 20E để xác định đến loài (Bảng 2)

Theo Tonguthai et al (1999), kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý của vi

khuẩn xác định được 3 nhóm vi khuẩn: Nhóm 1 có 4 chủng thuộc nhóm

Streptococcus có hình cầu, gram dương, catalase âm tính, màu trắng hơi đục, khuẩn

lạc nhỏ li ti; nhóm 2 có 12 chủng thuộc giống Ewardsiella có hình que, gram âm,

khuẩn lạc màu trắng đục, đường kính khoảng 0,02 - 0,035 mm, oxidase âm tính;

nhóm 3 có 42 chủng thuộc giống Aeromonas có hình que, gram âm, khuẩn lạc vàng

nhạt, đường kính khoảng 0,015 - 0,03mm, dạng nguyên, oxidase dương tính

Bảng 1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập trên cá lóc nuôi thương phẩm

Chỉ tiêu

Vi khuẩn

Nhóm 1: Vi khuẩn Streptococcus

Kết quả kiểm tra theo phương pháp Cowan and Steel’s (bảng 1) đề tài đã xác định

được 4 chủng Streptococcus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình cầu, không di

động, không tạo bào tử, khuẩn lạc nhỏ màu trắng đục, oxidase và catalase âm tính, có khả năng lên men O/F Theo Buller (2004),Streptococcus là vi khuẩn Gram dương,

có dạng hình cầu hoặc hình oval, các vi khuẩn thường kết nối lại tạo thành chuỗi dài nên được gọi là liên cầu khuẩn Phát triển tốt trong môi trường máu Bệnh do vi

khuẩn Streptococcus spp đã được ghi nhận lần đầu tiên trên cá hồi tại Nhật Bản bởi Hoshina et al 1958 Sau đó, có rất nhiều loài cá được báo cáo là nhiễm vi khuẩn này như: cá bơn Nhật Bản, cá Koi, cá chẽm, cá rô phi (Inglis et al., 1993; Noga, 2010) Ngoài ra, kết quả của Phạm Văn Thanh Thoán (2011) cho biết vi khuẩn

Streptococcus spp là tác nhân gây bệnh trên cá rô phi (Oreochromis sp.) và theo

Phạm Minh Đức và ctv (2012) cũng xác định vi khuẩn Streptococcus vi khuẩn Gram

dương, có dạng hình cầu, không di động, khuẩn lạc nhỏ màu trắng đục, oxidase và catalase âm tính, có khả năng lên men O/F, gây bệnh cho cá lóc với tần số xuất hiện

là 14,8% Dựa vào những ghi nhận của nhiều tác giả trên có thể kết luận loài vi

khuẩn Streptococcus có khả năng gây bệnh trên cá lóc ở An Giang, Đồng Tháp và

Trà Vinh

Hình 2: A: khuẩn lạc Streptococcus trên môi trường NA;

B : Vi khuẩn Streptococcus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu (100X)

Nhóm 2: Vi khuẩn Edwardsiella

Dựa vào các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa ở bảng 1 kiểm tra theo phương pháp Cowan and Steel’s đề tài đã xác định được 12 chủng vi khuẩn Gram âm thuộc giống

Edwardsiella cùng với những đặc điểm như sau: vi khuẩn có dạng hình que, khuẩn

lạc nhỏ, trắng đục sau 24 giờ trên môi trường NA và có khả năng di động

Edwarsiella phản ứng dương tính với catalase, âm tính với oxidase, có khả năng lên

men O/F Kết quả này hoàn toàn phù hợp với Barrow and Feltham, 1999 và kết quả

của Phạm Minh Đức và ctv (2012) vi khuẩn Edwardsiella được phân lập từ cá lóc

nuôi thâm canh Bên cạnh đó, cá các dấu hiệu bơi lờ đờ, giải phẫu nội tạng thấy xuất hiện nhiều đốm trắng đục cỡ 1-3 mm trên gan và tỳ tạng giống như nghiên cứu của

Phạm Minh Đức và ctv (2012) Như vậy, có thể kết luận rằng vi khuẩn Edwardsiella

có khả năng gây bệnh trên cá lóc ở giai đoạn nuôi thương phẩm

Hình 3: A: khuẩn lạc Edwardsiella trên môi trường NA;

B : Vi khuẩn Edwardsiella là vi khuẩn Gram âm, hình que (100X)

Nhóm 3: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Từ kết quả kiểm tra hình thái, sinh lý tiến hành chọn 20 chủng định danh bằng bộ kít

API 20E trong số 42 chủng thuộc giống Aeromonas Kết quả đã xác định được 11 chủng vi khuẩn A hydrophila, 9 chủng còn lại có sự sai khác và không phù hợp với

một số chỉ tiêu trong bộ kít API 20E

Qua bảng 2 cho thấy 11 chủng vi khuẩn đều cho kết quả dương tính ADH, LDC, IND, VP, GEL, GLU; âm tính với chỉ tiêu ODC, H2S, URE, SOR, INO, RHA, MEL các chỉ tiêu còn lại có sự khác nhau giữa các chủng Mặc dù không thống nhất về tất

cả chỉ tiêu ở cả 11 chủng, tuy nhiên dựa vào cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow

and Feltham, 1993) vẫn có thể khẳng định 11 chủng đều là vi khuẩn A hydrophila

gây bệnh trên cá lóc ở An Giang và Trà Vinh

Vi khuẩn A hydrophila là vi khuẩn Gram âm, hình que, di động, đường kính 0,1-1,0

µm, có thể phát triển ở 37oC, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, có khả năng lên men, oxidase dương tính, kháng với O/129 Kết quả này phù hợp với kết quả đặc

điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn trong nghiên cứu của Inglish et al (1993) và Từ Thanh Dung (2005) Theo Nguyễn Thị Thu Hằng (2005), A

hydrophila khi phát triển trên môi trường TSA thì khuẩn lạc có màu vàng nhạt, tròn,

hơi lồi, nhẵn Đồng thời, các dấu hiệu bệnh lý của những mẫu cá bệnh do nhóm vi khuẩn này đều có dấu hiệu có đốm đỏ ở dưới da, xuất huyết vây lưng và hậu môn

Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) Ngoài ra,

đuôi và vây bị hoại tử, cá có các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng, nội tạng

bị sưng và xung huyết giống với những mô tả về dấu hiệu bệnh lý do vi khuẩn

Aeromonas spp gây ra trên cá (Austin and Austin, 1987; Inglis et al., 1993; Aoki,

1999; Noga, 2010 Bên cạnh những mẫu bệnh có dấu hiệu bệnh lý cũng có mẫu chưa

có biểu hiện bệnh rõ ràng, thậm chí ở mẫu khỏe kết quả cũng phân lập và định danh

được chủng vi khuẩn A hydrophila Điều này chứng tỏ vi khuẩn A hydrophila

không chỉ hiện diện ở cá bệnh mà còn ở cá khỏe

Hình 4: A: khuẩn lạc A hydrophila trên môi trường NA;

B : Vi khuẩn A hydrophila là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn (100X)

Bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp được nghiên cứu đầu tiên bởi Scaperclous (1930)

và nhóm vi khuẩn này đã được biết đến là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chình (Anguilla anguilla) và cá chép (Cyprinus carpio) ở nhiều nước trên thế giới

(Inglis et al., 1993; Aoki, 1999; Cipriano, 2001) Theo báo cáo của Tanasomwang and Saitanu (1979) đã tìm thấy vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết do nhiễm

trùng máu trên cá basa nuôi trong bè gỗ Ngoài ra, một số tác giả cũng nhận định

chính A hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chép và cá trê trắng giống (Saitanu et al., 1982; Angka, 1990). Bên cạnh đó, nghiên cứu gần đây của

Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2012) đã xác định loài vi khuẩn này cũng gây xuất

huyết trên lươn đồng (Monopterus albus) và cũng chính là tác nhân gây bệnh trên cá

rô (Anabas testudineus) (Đặng Thụy Mai Thy và ctv, 2012) Ngoài những nghiên cứu trên, theo Lư Trí Tài (2010), vi khuẩn A hydrophila chiếm cao nhất 38,3% gây bệnh trên cá lóc Tương tự, đến năm 2012 tác giả Phạm Minh Đức và ctv xác định được 4 loài vi khuẩn gây bệnh trên cá lóc nuôi thâm canh, trong đó vi khuẩn A hydrophila

cũng có tần số xuất hiện cao nhất chiếm 54,3% Từ những ghi nhận trên cho thấy,

loài vi khuẩn A hydrophila đã có sự mở rộng phổ loài cảm nhiễm trên các đối tượng

cá đồng tại Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay

Bảng 2: Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Chỉ

tiêu

LX

1.4T

LX 1.6T

TV 4.2T(N)

LX 1.1G

LX 1.5G

LX 3.1G

LX 3.2T

TV 4.3T

LX 1.3T(K)

LX 1.4TT

LX 1.2T ONPG

ADH

LDC

CIT

IND

VP

GEL

GLU

SAC

ARA

Chú thích: LX: Long Xuyên, TV: Trà Vinh, K: Cá khỏe, T: Thận, G: Gan, TT: Tỳ tạng

3.3 Kết quả kháng sinh đồ

Kết quả thực hiện kháng sinh đồ trên 11 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập từ cá

lóc bệnh xuất huyết với 7 loại kháng sinh trong nghiên cứu Kết quả phầm trăm chủng vi khuẩn nhạy, trung bình nhạy và kháng đối với 7 loại thuốc kháng sinh được trình bày qua bảng 3

Bảng 3: Tỷ lệ phần trăm chủng vi khuẩn A hydrophila nhạy, nhạy trung bình và kháng

kháng sinh.