khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh của mầm vi khuẩn trên cá lóc (channa striata, block 1793)

TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh của mầm bệnh vi khuẩn trên cá lóc và định danh một số chủng đặc trưng.. Với các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN VĂN ÚT

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA MẦM VI

KHUẨN TRÊN CÁ LÓC (Channa striata, Block 1793)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN VĂN ÚT

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA MẦM VI

KHUẨN TRÊN CÁ LÓC (Channa striata, Block 1793)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts TỪ THANH DUNG

2013

Các Cô và cán bộ Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Các bạn lớp Bệnh học Thủy sản - Khóa 36 Anh Nguyễn Bảo Trung (Bệnh học Thủy sản - Khóa 34), anh Nguyễn Khương Duy (Bệnh học Thủy sản - K33), chị Trần Thị Ngọc Hân (Cao học Nuôi trồng Thủy sản - Khóa 18), bạn Trần Thanh Sang, Đặng Phạm Hoà Hiệp,… (Bệnh học Thủy sản - Khóa 36) đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này

Cuối cùng, xin chân thành cám ơn tất cả các anh chị em cũng như những người

thân của tôi luôn quan tâm và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cám ơn

Nguyễn Văn Út

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh của mầm bệnh vi khuẩn trên cá lóc và định danh một số chủng đặc trưng Đề tài phân lập được 97 mẫu cá bệnh xuất huyết và gan, thận mủ từ 20 ao nuôi cá lóc thâm canh, phân lập vi khuẩn trên TSA thu được 33 chủng vi khuẩn từ 18 ao nuôi Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập đều được kiểm tra một số chỉ tiêu cơ bản và các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kit API 20E Kết quả định danh vi khuẩn thu được là

Aermonas hydrophila và Pseudomonas aeruginosa

Với các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, đề tài tiến hành chọn 10 chủng vi khuẩn (đó là những chủng vi khuẩn phân lập được từ cá bị bệnh xuất huyết) từ

33 chủng vi khuẩn phân lập được trong nghiên cứu này để tiến hành làm kháng sinh đồ kiểm tra tính kháng, nhạy và nhạy trung bình Kết quả kiểm kháng sinh

đồ của 10 chủng vi khuẩn cho thấy các chủng vi khuẩn hầu như có nhạy với các

loại kháng sinh Nhạy hoàn toàn với suphamethoxazole-trimethoprim, có tỉ lệ

nhạy cao với amoxicillin-clavulanic acid (90%), doxycycline (80%), florfenicol

(70%), flumequine (60%) và rifampicin (60%) Đối với 2 loại ampicillin và novobiocin có tỉ lệ kháng tương đối cao lần lượt là 60% và 80% Bên cạnh đó, một số chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này còn thể hiện sự đa kháng thuốc

kháng sinh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Ký tên

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung của đề tài 2

CHƯƠNG II 3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên cá lóc 3

2.1.1 Vài nét chung về cá lóc 3

2.1.2 Những nghiên cứu về bệnh trên cá lóc 4

2.1.3 Một số bệnh thường gặp trên cá lóc 5

2.2 Sự kháng thuốc của vi khuẩn 6

2.2.1 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 6

2.2.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh 7

2.3 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong thủy sản 8

CHƯƠNG III 11

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU 11

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11

3.2 Vật liệu nghiên cứu 11

3.3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 12

3.3.2 Kiểm tra tổng quan mẫu cá và bệnh vi khuẩn 12

3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E 13

3.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ 14

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 15

CHƯƠNG IV 16

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 16

4.1 Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn 16

4.2 Kết quả định danh vi khuẩn 18

4.2.1 Kết quả xác định đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá 18

4.2.2 Kết quả định danh 18

4.3 Kết quả kháng sinh đồ 21

CHƯƠNG V 25

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 25

5.1 Kết luận 25

5.2 Đề xuất 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

PHỤ LỤC A 30

PHỤ LỤC B 35

PHỤ LỤC C 36

PHỤ LỤC E 38

PHỤ LỤC F 40

PHỤ LỤC G 41

PHỤ LỤC H 42

PHỤ LỤC I 43

PHỤ LỤC J 44

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Địa điểm thu mẫu và số lượng chủng vi khuẩn 16 Bảng 4.2: Một số chỉ tiêu cơ bản của các chủng vi khuẩn 19 Bảng 4.3: Tỉ lệ (%) nhạy, nhạy trung bình và kháng các chủng vi khuẩn 22

Trang

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cá lóc (Channa striata) 3

Hình 3.1: Bản đồ địa điểm thu mẫu (vùng khoanh tròn) 11

(A) Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh 11

(B) Huyện Vĩnh Thạnh, Tp Cần Thơ 11

Hình 4.1: (A) Dịch màu đỏ bầm trong xoang bụng……… …17

(B), (C) và (C) Vây, thân và não bị xuất huyết……… …17

Hình 4.2: (A) Cá lờ đờ, tấp mé ao……… ……17

(B) Gan sẫm màu, tùy tạng sưng to……… …….17

(C) Gan, thận và tùy tạng có đốm trắng nhỏ……… …… 17

Hình 4.3: Tỉ lệ vi khuẩn phân lập được ở các mẫu các bệnh khác nhau…… 18

Hình 4.4: (A) Hình dạng khuẩn lạc, (B) Kết quả nhuộm Gram……… 19

Hình 4.5: (A) Kết quả O/F, (B) Kết quả Oxidase và Catalase……….20

Hình 4.6: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu bộ kít API 20E (CCT1311 là P aeruginosa và CCT1310 là A hydrophila)……… 21

Trang

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A hydrophila Aeromonas hydrophila

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước Trong đó, nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng cả nước Theo Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản năm 2012 ước đạt 5,8 triệu tấn, tăng 8,5% so với năm 2011 Trong đó, sản lượng khai thác đạt 2,6 triệu tấn, sản lượng nuôi trồng đạt 3,2 triệu tấn (www.thuysanvietnam.com.vn)

Bên cạnh, những loài thủy sản (cá tra, basa, tôm sú, ) là đối tượng có giá trị kinh tế cao thì cá lóc là đối tượng tương đối dễ nuôi, chất lượng thịt ngon, được nuôi với nhiều mô hình khác nhau (như nuôi trong ao đất, vèo, lồng, bè, ) ở một số nơi như Trà Vinh, Cần Thơ, Đồng Tháp, Năm 2009 thì sản lượng cá lóc đạt hơn 40.000 tấn, tăng gần 8 lần so với năm 2002 (Báo cáo của các tỉnh ở ĐBSCL, 2010) Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2010) do sự tăng nhanh về sản lượng và đạt được lợi nhuận cao nên người dân đã mở rộng diện tích nuôi với mật độ cao hơn Hiện nay, cá lóc được chú trọng nuôi ngày càng nhiều về cả quy mô lẫn diện tích (theo mô hình công nghiệp) trong đó có Trà Vinh và Cần Thơ, đặc biệt tập trung nuôi nhiều ở huyện Trà Cú (Trà Vinh) Chỉ tính riêng đến giữa tháng 7/2013 nông dân đã thả nuôi khoảng 300 ha, cao gấp 3 lần năm

2012 (www.vtv.vn) Vì vậy, người nuôi cho ăn bằng thức ăn viên là chủ yếu, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao theo hướng nuôi công nghiệp Cũng chính vì thế mà dịch bệnh ngày càng lây lan và diễn biến phức tạp Do nhiều nguyên nhân khác nhau như: nguồn nước bị ô nhiễm, con giống kém chất lượng, hiện tượng kháng thuốc do người nuôi sử dụng quá liều hoặc không hợp lý trong quá trình nuôi (www.agroviet.gov.vn) Theo Thứ trưởng Vũ Văn Tám đánh giá (Ngày 25/12/2012 - tại Hà Nội, Tổng cục Thủy sản đã tổ chức Hội nghị Tổng kết thực hiện nhiệm vụ năm 2012 và triển khai kế hoạch năm 2013): “Năm 2012, toàn ngành đã cố gắng và đạt được một số kết quả đáng ghi nhận Tuy nhiên, việc chỉ đạo phòng chống dịch bệnh vẫn chưa triệt để, còn tái diễn” (www.thuysanvietnam.com.vn) Becky (1995) cho rằng cá thường bệnh ở những ao nuôi với mật độ cao, tất cả ảnh hưởng đến sự cân bằng tự nhiên giữa cá và mầm bệnh trong môi trường, kết quả làm tăng tính nhạy của cá đối với bệnh, có lúc bệnh bộc phát gây chết cả ao trong thời gian ngắn mà không tìm được nguyên nhân Vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh khá quan trọng Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện

trên động vật thủy sản do vi khuẩn chiếm tới 50,9% Tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn có thể lên đến 100% (Bùi Quang Tề, 2008)

Trong thời gian gần đây, các loài thủy sản nuôi (cá tra, cá lóc, ) ở khu vực ĐBSCL nhiễm bệnh hầu như quanh năm như bệnh gan thận mủ, bệnh xuất huyết, bệnh đẹn miệng, bệnh trắng da, Hiện nay, ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới, thuốc kháng sinh được sử dụng phổ biến trong việc điều trị bệnh vi khuẩn trên thủy sản (Tu Thanh

Dung et al., 2008) Tuy nhiên, sử dụng hoá chất phòng và trị bệnh vi khuẩn trong thời

gian dài, đặc biệt là kháng sinh lại gặp nhiều khó khăn, như giá thành các loại thuốc

kháng sinh cao, lại gây ra hiện tượng kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh (Prescott et

al., 2000), làm giảm hiệu quả phòng và trị bệnh về sau Thêm vào đó là vấn đề ô nhiễm

môi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, nhất là không tốt cho sức khoẻ người tiêu dùng Xuất

phát từ nhu cầu phòng và trị bệnh của người nuôi, đề tài “Khảo sát sự kháng thuốc

kháng sinh mầm vi khuẩn gây bệnh trên cá lóc (Channa striata)” được thực hiện

nhằm cung cấp những thông tin mới nhất về sự kháng thuốc của vi khuẩn, góp phần cho việc điều trị có hiệu quả hơn

1.2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá sự kháng thuốc kháng sinh của một số mầm vi khuẩn, gây bệnh trên cá lóc

(Channa striata) nuôi thâm canh đã được phân lập ở tỉnh Trà Vinh và Cần Thơ Nhằm

tìm ra loại thuốc kháng sinh có hiệu quả cao trong điều trị

1.3 Nội dung của đề tài

 Thu mẫu và định danh vi khuẩn gây bệnh trên cá lóc ở tỉnh Trà Vinh và Cần Thơ

 Kiểm tra khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá lóc

(Channa striata) (làm kháng sinh đồ)

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trên cá lóc

2.1.1 Vài nét chung về cá lóc

Theo hệ thống phân loại của Fishbase (2010), cá lóc đen (Channa striata, Block,

1793) có vị trí phân loại như sau:

Cá lóc (Channa striata) là loài phân bố rộng trong tự nhiên và thường thấy ở các thủy

vực nước ngọt châu Á như Indonesia, Philippin, Campuchia, (Pillay, 1990; Rainboth, 1996) Cá lóc sống phổ biến ở đồng ruộng, kênh rạch, ao hồ, và cả môi trường nước đục, lợ, có thể chịu đựng được ở nhiệt độ trên 30oC (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu

Hương, 1993) Đặc biệt, một số loài có thể chịu đựng được điều kiện môi trường khắc

nghiệt trong thời gian dài như loài C banganensis sống ở vùng “nước đen” có độ acid cao (3-4 độ pH); loài C gachua, C striata và C punctata có thể chịu đựng được pH biến

thiên rất rộng, từ 4-9 độ trong vòng 72 giờ; Arunachalam và Palanichamy (1982) cho thấy cá lóc có cơ quan hô hấp khí trời nên chúng có thể sống rất lâu trên cạn, với điều

kiện chỉ cần ẩm ướt toàn thân (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Công và ctv, 2006) Cá lóc là

loài cá dữ, ăn động vật điển hình, thức ăn chủ yếu là cá, ếch, côn trùng, giáp xác, (Qin

Jian Guang et al., 1996; Nguyễn Văn Thường, 2004) Cá lóc 1-2 tuổi bắt đầu đẻ trứng,

mùa vụ sinh sản từ tháng 4-8 (tập trung vào tháng 4-5) Sức sinh sản tương đối lớn khoảng 5.000-20.000 trứng/kg cá cái (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) Trong các năm 1995-

1996, Trung tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ đã nghiên cứu thành công đề tài sinh sản nhân tạo cá lóc từ nuôi vỗ cá bố mẹ, cho đẻ nhân tạo, ương nuôi giống

Theo định loại cá nước ngọt vùng ĐBSCL (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương,

1993) gồm 4 loài: cá lóc đen (C striata), cá chành dục (C gachua), cá lóc bông (C

micropeltes) - kích thước tối đa 150cm, cá dầy (C lucius) - kích thước tối đa 40cm

Riêng loài cá lóc đen (C striata) và cá lóc bông (C micropeltes) hiện là 2 đối tượng nuôi

quang trọng trong cơ cấu đàn cá nuôi ở ĐBSCL (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Thường, 2004) Theo Nguyễn Văn Hòa (2008) ở ĐBSCL đã có thêm nhóm cá lóc Môi trề, cá lóc Đầu nhím và cá lóc Đầu vuông (chưa có tên khoa học) phân bố chủ yếu ở huyện Tam Nông, tỉnh Đồng Tháp Đây là nhóm cá lóc có kích cỡ lớn, giá trị kinh tế cao, được nuôi

và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nghề nuôi cá lóc

2.1.2 Những nghiên cứu về bệnh trên cá lóc

Trong những năm gần đây, theo khảo sát của Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung (2009) cho thấy khảo sát 635 hộ nuôi ở ĐBSCL thì các mô hình nuôi cá lóc xuất hiện nhiều bệnh như: bệnh ký sinh trùng (KST) xuất hiện nhiều nhất (85,9%), kế đến là bệnh xuất huyết (55,9%) và một số bệnh khác như tuột nhớt (11,8%), trắng mang (8,5%), gan thận (7,8%), Trong đó, giống như nghề nuôi cá tra bệnh gan, thân mủ là một bệnh rất nguy hiểm và khó điều trị Bệnh tuy mới xuất hiện trên cá lóc vài năm trở lại đây nhưng lại gây

tỉ lệ hao hụt cao, làm giảm năng suất và hiệu quả kinh tế cho người nuôi Về bệnh KST thì xuất hiện trên mô hình nuôi vèo trên sông là cao nhất (93,6%), kế đến là lồng bè (83,3%), nguyên nhân là do chất lượng nước chứa nhiều mần bệnh, khó quản lý nguồn nước trong khi nuôi, nhất là về mùa lũ hay mùa mưa Về bệnh xuất huyết thì mô hình nuôi ao có tỉ lệ xuất hiện cao nhất (80,3%), do mần bệnh tích lũy nhiều trong quá trình

nuôi Bệnh tuột nhớt thì xảy ra nhiều ở mô hình bể bạt và nuôi lòng bè (25-30%), còn bệnh gan thận xuất hiện nhiều ở mô hình nuôi ao đất (22,7%)

Theo Lư Trí Tài (2010) đã định danh được 81 chủng vi khuẩn trên cá lóc trong ao nuôi

thăm canh Trong đó, tần số suất hiện của các giống vi khuẩn lần lượt là Aeromonas chiếm tỷ lệ cao nhất 38,3%, kế đến Edwardsiella (17,3%), Vibrio (16,0%), Streptococcus (14,8%), và Pseudomonas chiếm tỷ lệ thấp nhất (13,6%) Một điều quan trọng là giống

Edwardsiella chỉ xuất hiện ở tháng nuôi thứ 2 (trọng lượng 175,7-295,3g) và giống Streptococcus duy nhất chỉ xuất hiện ở tháng nuôi thứ 5 (trọng lượng 620,4-850,0g)

Hội chứng dịch bệnh lở loét ở cá (The Epizootic Ulcerative Syndrome of fish – EUS) Đây là một loại bệnh nguy hiểm đã lây lan rất nhanh và gây thiệt hại lớn cho cá nuôi ở nhiều quốc gia Theo nhóm nghiên cứu đã ghi nhận được bệnh EUS do nhiều tác nhân

gây ra: vi rút, vi khuẩn, ký sinh trùng và một số nấm bậc thấp như Aphanomyces sp.,

Saprolegnia sp và Achlya sp Tuy nhiên, tác nhân chính gây ra hiện tượng hoại tử của

bệnh EUS là nấm bậc thấp Aphanomyces invadans Khi gặp điều kiện thuận lợi, nấm này

đã tấn công vào mô cơ và các mô khác, nấm này tiết ra enzym phân hủy protein nên tạo

ra những vết loét trên cơ thể cá (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

2.1.3 Một số bệnh thường gặp trên cá lóc

Nhóm động vật đơn bào - Protozoa: Thành phần giống KST thuộc nhóm động vật đơn

bào ký sinh trên cá lóc nuôi thâm canh gồm những giống như Myxobolus, Trichodina,

Chilodonella, Epistylis, Tripartiella, Apiosoma và Henneguya Nhóm động vật đơn bào

này ký sinh ở các cơ quan bên ngoài như da và mang Chúng thường xuất hiện chủ yếu ở những tháng nuôi đầu tiên (Trung tâm khuyến nông - skhuyến ngư Quốc gia, 2009; Phạm Minh Đức, 2012)

Nhóm ký sinh trùng đa bào - Metazoa: Thành phần giống KST đa bào ký sinh trên cá

lóc nuôi thâm canh gồm những giống như sán lá đơn chủ Trianchoratus ký sinh ở mang; sán lá 18 móc Gyrodactylus ký sinh ở da và mang; sán dây Proteocephalus ký sinh ở ruột; giun tròn Spinitectus ký sinh trên dạ dày, ruột, bóng hơi; giun đầu gai Pallisentis ký

sinh ở ruột (Trung tâm khuyến nông - khuyến ngư Quốc gia, 2009; Phạm Minh Đức, 2012)

Nhóm giáp xác - Crustacea: Thành phần nhóm giáp xác ký sinh trên cá lóc nuôi thâm

canh gồm những giống như Ergasilus ký sinh ở mang, Lamproglena ký sinh ở mang, trùng mỏ neo Lernaea ký sinh ở da, và rận cá Argulus ký sinh trên da (Trung tâm khuyến

nông - khuyến ngư Quốc gia, 2009; Phạm Minh Đức, 2012)

Bệnh nấm thủy mi: Bệnh nấm thủy mi do các loài của 2 giống nấm Saprolegnia và

Achlya gây ra Đây là loại nấm gây hại cho cá ở tất cả các giai đoạn từ trứng đến cá thịt

Khi mắc bệnh này, cá bơi lờ đờ xung quanh ao và bị bệnh nặng sau một thời gian sẽ chết

Nấm thủy mi bám trên mình cá như những túm bông màu trắng (Phạm Minh Đức và ctv,

2012; Yanong, 2003)

Bệnh xuất huyết: Do nhiều loài thuộc giống Aromonas, Pseudomonas,… gây ra Có

hiệu bệnh lý như xuất huyết da, nắp mang; đốm đỏ xuất hiện trên thân; xuất huyết hậu môn; góc vi, hàm dưới nắp mang bị tụ máu thành những lớp màu đỏ; xoang bụng xuất huyết nội tạng Bệnh xuất hiện ở tất cả các giai đoạn ương giống và nuôi thịt, phát triển trong điều kiện cá bị sốc và chuyển mùa, thời tiết bất lợi Môi trường ương nuôi nhiễm bẩn, nhiều khí độc, hàm lượng oxy thấp (Trung tâm khuyến nông - khuyến ngư Quốc gia, 2009; Lư Trí Tài, 2010)

Bệnh do vi khuẩn Flavobacterium: Vi khuẩn Flavobacterium columnare là tác nhân

gây bệnh trên nhiều loài cá nước ngọt (Inglis et al., 1993) Khi cá bị bệnh do nhiễm khuẩn F columnare xuất hiện những vùng hoại tử màu vàng hay trắng đục và những tổn

thương mòn trên da, vây và khoang miệng hay hoại tử ở những sợi mang Khi các sợi mang bị hoại tử thì cá sẽ hô hấp nhanh hơn, nếu sống trong môi trường thiếu oxy thì cá sẽ

bị chết ngạt (Robert et al., 1998)

Bệnh do vi khuẩn Streptoccocus: Vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh trên

nhiều loài cá nước ngọt khi nhiệt độ vượt quá 20oC (Inglis et al., 1993) Bệnh có thể xảy

ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá basa (Pangasius bocourti), cá rô phi (Oreochromisniloticus), cá chép (Ciprinus carpio) và một số loài cá biển như cá chẽm (Latescalcarifer) (Bùi Quang Tề, 2006) Khi bị nhiễm vi khuẩn S agalactiae thì cá có

biểu hiện bơi lội bất thường, màu sắc cơ thể tối, giác mạc bị đục, xuất hiện những vết loét trên bề mặt cơ thể là những triệu chứng phổ biến nhất Những vết loét dần mở rộng và phát triển làm tổn thương và hoại tử thường thấy ở khu vực hậu môn, mắt bị ảnh hưởng với tần số cao (Robinson and Meyer, 1966)

2.2 Sự kháng thuốc của vi khuẩn

2.2.1 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên trên động vật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu từ rất lâu Từ những năm 50 của thế kỉ 20 các nhà khoa học Nhật Bản đã nghiên cứu sự lan truyền rộng rãi của các loài vi khuẩn kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng sinh thông dụng

Kháng thuốc của vi khuẩn là hiện tượng một chủng vi khuẩn nào đó có khả năng chống lại tác dụng ức chế, kìm hãm, tiêu diệt của một số loại kháng sinh đối với vi khuẩn đó Khả năng kháng thuốc này được qui định bởi gen kháng thuốc gọi là plasmid, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn Do được quy định bởi gen nên vi khuẩn kháng

thuốc có thể truyền cho thế hệ sau khả năng kháng thuốc của nó (Prescott et al., 2000)

Sự đề kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn có 2 dạng:

Kháng thuốc tự nhiên: Đề kháng tự nhiên đối với một loại kháng sinh nào đó là do bản

chất nội tại hay có sẵn của vi khuẩn, tức là tình trạng giống hoặc một loài vi khuẩn nào

đó không nhạy cảm với kháng sinh Điều này có thể do vi khuẩn thiếu cấu trúc đích cho

tác động của kháng sinh Chẳng hạn, vi khuẩn không có thành tế bào như Mycoplasma thì

đề kháng tự nhiên với kháng sinh nhóm β-lactam Ngoài ra, đề kháng tự nhiên còn có thể

do thành tế bào không cho kháng sinh thấm qua Vi khuẩn G- đề kháng tự nhiên với glycopeptide vì phân tử thuốc quá lớn, không qua màng vi khuẩn (http://uv-vietnam.com.vn)

Kháng thuốc thu nhận: Vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc trong quá trình

sống do đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc

Đề kháng thu nhận là trường hợp vi khuẩn trước đây nhạy cảm với kháng sinh nhưng sau một thời gian tiếp xúc với kháng sinh đó làm cho chúng trở nên kháng Đề kháng thu được là kết quả của sự thay đổi trong hệ thống gene bởi đột biến hoặc sự truyền ngang thông tin di truyền từ vi khuẩn khác Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng để tạo nên đề kháng kháng sinh Sự đề kháng này đã được nghiên cứu và ghi nhận với các cơ

chế chủ yếu sau: (1) sản xuất enzyme β-lactamases làm bất hoạt kháng sinh; (2) đẩy

kháng sinh ra ngoài tế bào bằng bơm protein (efflux pump) trước khi kháng sinh đến vị

trí đích của nó; (3) thay đổi điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm

tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn (Tenover, 2006)

Khi dùng kháng sinh ở nồng độ thấp kéo dài sẽ tạo các chủng vi khuẩn kháng thuốc Ngoài ra, khi dùng ở nồng độ thấp hơn nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đó thì có thể kích thích vi khuẩn gây bệnh phát triển

2.2.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

Hiện nay có nhiều giả thuyết khác nhau về cơ chế tác động của kháng sinh lên vi khuẩn

nhưng theo Tenover et al (2006) thì kháng sinh tác động lên tế bào vi khuẩn theo một số

cơ chế chính sau: (1) ức chế sinh tổng hợp vách tế bào (kháng sinh có khả năng tác động vào nhiều giai đoạn của quá trình tổng hợp vách tế bào); (2) gây rối loạn chức năng màng

sinh chất (kháng sinh gây rối loạn tính thấm của màng sinh chất); (3) ức chế sinh tổng

hợp protein (kháng sinh gắn lên bán đơn vị 30S của ribosom và ngăn cản RNA vận chuyển mang acid amin đối mã với phân tử RNA thông tin Tác động lên bán đơn vị 50S của ribosom làm rối loạn quá trình tổng hợp protein do ngăn cản quá trình hình thành liên

kết peptid giữa các acid amin); (4) ức chế sinh tổng hợp acid nucleic (kháng sinh gắn vào

enzym gyrase làm cho enzym này không cắt được phân tử DNA hình vòng của vi khuẩn

thành dạng sợi thẳng); (5) ức chế quá trình trao đổi chất (một số loại kháng sinh khác có

thể ức chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn)

Thuốc kháng sinh có tác động gây độc cho vi khuẩn nhưng không gây độc cho người, tức

là có tinh chọn lọc Vì vậy, thuốc kháng sinh cần tác động vào các thành phần hay quá trình chuyển hóa chỉ có ở vi khuẩn mà không có ở người Chẳng hạn thành vi khuẩn có cấu tạo peptidoglycan chỉ có ở tế bào vi khuẩn không có ở tế bào người, nên đó là vị trí tác động của nhiều kháng sinh có tác dụng rất chọn lọc nên ít độc tính (Trần Thị Thu Hằng, 2007)

Ngoài ra, thuốc kháng sinh còn có tác dụng ức chế tổng hợp acid nucleic và protein Do

đó, tùy thuộc vào loại thuốc kháng sinh mà cơ chế tác động lên tế bào vi khuẩn khác nhau (Aharonowitz và Cohen, 1981)

2.3 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong thủy sản

Ngày nay, thuốc kháng sinh được dùng rất nhiều trong phòng trị bệnh thủy sản, nhất là ở các mô hình nuôi thâm canh với mật độ nuôi cao và thiếu khâu vệ sinh đúng cách Chính việc sử dụng quá nhiều loại thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh thủy sản nên vấn đề kháng thuốc kháng sinh ở các loài vi khuẩn trong thực tế là không thể tránh khỏi (Cabello, 2006) Từ lâu, các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn bệnh trong thủy sản nói riêng Hawke (1979) là

nhà khoa học đầu tiên đã làm kháng sinh đồ trên 10 chủng vi khuẩn E Ictaluri Sau đó, Walman và Shotts (1986) kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng E Ictaluri phân lập

được ở Mỹ với 37 loại thuốc kháng sinh, kết quả nghiên cứu cho thấy đa số vi khuẩn Gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc trong nghiên cứu Tuy nhiên, có hơn 90% số

chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamids Reger et al., (1993) cũng xác định các chủng E.ictaluri ở Mỹ đều nhạy với erofloxacin, gentamicin và docyxyline Nửa thập kỷ

sau đó, Stock và Wiedeman (2001) đã xác định nồng độ ức chế tối thiểu của 41 chủng vi

khuẩn E.ictalluri đối với 71 loại thuốc kháng sinh (trích dẫn bởi Tu Thanh Dung et al.,

2008)

Ngoài ra, sự kháng thuốc của vi khuẩn trong thủy sản còn gặp ngay cả hệ vi khuẩn trong

hệ tiêu hóa của cá tra khỏe gồm 3 dòng vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế:

Enterobacteriaceae (41,9%), Pseudomonas (35,2%) và Vibrionaceae (15,7%) đã xuất

hiện hiện tượng đa kháng kháng sinh (Sarter et al., 2007)

Năm 2008, Dung et al nghiên cứu về hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của 64 chủng

vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra ở ĐBSCL thu từ năm 2002-2005

bằng phương pháp pha loãng thuốc trong môi trường thạch, kết quả không tìm thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn với thuốc kháng sinh amoxicillin, amoxicillin+clavulanic acid, chloramphenicol, florfenicol, gentamicin, kanamycin, neomycin và nitrofurantoin Tuy

nhiên, đa số vi khuẩn E ictaluri đã kháng với streptomycin (83%), oxytetracyline (81%),

oxolinic acid (6%) và enrofloxacin (5%) Trong đó, thì hầu hết vi khuẩn đã kháng thuốc

tự nhiên với colistin (nhóm polypeptide) Đặc biệt, kết quả đã xác định trên 73% chủng vi

khuẩn E ictaluri biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít nhất 3 loại thuốc) Giá trị MIC của florfenicol đối với vi khuẩn E ictaluri là ≥ 2 (µg/mL), cho thấy dòng vi khuẩn này đã giảm tính nhạy với thuốc florfenicol So với nghiên cứu của Shu-Peng et al (2000), giá trị MIC của florfenicol đối với vi khuẩn Edwardsiella phân lập từ các loài cá nuôi bệnh ở

Đài Loan, ở mức 0,78 (µg/mL) Kết quả nghiên cứ đã cảnh báo sự cần thiết kiểm soát nghiêm ngặt việc dùng thuốc kháng sinh để phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản ở

Việt Nam (Dung et al., 2008)

Nhiều loài vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản khác cũng đã xảy ra hiện tượng kháng

thuốc kháng sinh được, như gần đây tác giả Akinbowale et al (2007) Phân lập 100 dòng

vi khuẩn Gram âm (chủ yếu là Vibrio spp Và Aeromonas ssp.) từ các nguồn gốc khác

nhau như: từ mẫu cá giáp xác, từ nước ương ấu trùng cua ở Úc Tất cả mẫu vi khuẩn được kiểm tra tính nhạy và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên 19 loại thuốc kháng sinh bằng phương pháp pha loãng trong agar Kết quả phân tích hầu hết các dòng vi khuẩn này

đã kháng cao với ampicillin, amoxicillin, cephalexin và erythromycin, kháng thấp với oxytetracycline, tetracycline, nalidixic acid và sulfonamides, nhạy cao với chloramphenicol, florfenicol, oxolinic acid, gentamicin, kanamicin, trimethoprin và nhạy hoàn toàn với ciprofloxacin Các dòng vi khuẩn trên có giá trị MIC như sau: trung bình chỉ có 4,75% chủng nhạy với các thuốc kháng sinh ở nồng độ thấp 0,1-0,25 (µg/mL) và

có tới 24.32% chủng giá trị MIC ở nồng độ trên 128 (µg/mL) Đặc biệt, có 74,4% các chủng vi khuẩn trên xảy ra hiện tượng đa kháng kháng sinh

Việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng không ngừng tăng cao trong các ao nuôi tôm công nghiệp nhất là ở khu vực Đông Nam Á (GEMSAMP, 1997 Trích dẫn bởi Sara và Bengt-Erik, 2001) Không nằm ngoài quy luật tự nhiên, một khi sử dụng một lượng lớn thuốc

kháng sinh trong các ao nuôi tôm công nghiệp qua thời gian dài, thì hiện tượng kháng thuốc kháng sinh đã xảy ra trong môi trường nước lợ điều không thể tránh khỏi Trong các ao nuôi tôm sú ở một số tỉnh của Việt Nam có sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian dài, kết quả là lượng thuốc kháng sinh tồn lưu trong môi trường bùn và nước là

nguyên nhân dẫn đến tăng hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn (Tuan et al.,

2005)

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

Địa điểm:

- Thu mẫu tại các hộ nuôi cá lóc ở huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh và huyện Vĩnh Thạnh,

Tp Cần Thơ Đây là nơi tập trung nhiều hộ nuôi cá lóc thâm canh Thời gian thu mẫu khoảng tháng 8/2013 đến tháng 11/2013

Hình 3.1: Bản đồ địa điểm thu mẫu (vùng khoanh tròn)

(A) Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh, (B) Huyện Vĩnh Thạnh, Tp Cần Thơ

- Địa điểm phân tích mẫu: Mẫu được phân tích tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

- Thí nghiệm xác định sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ thí nghiệm: Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu, giấy vệ sinh, bao tay, khẩu

trang, giấy nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, tủ cấy, tủ ấm Đĩa petri, đèn cồn, bộ tiểu phẫu, que cấy, que trải thủy tinh, bình xịt cồn, cốc đốt 250 mL, hộp đầu col 1 mL, pipet 100-1000 µL, lame, lamelle, khay nhựa, sổ ghi chép, phiếu điều tra thong tin (phụ lục C) và các vật liệu cần thiết khác

Môi trường: TSA (Tryptone Soya Agar), MHA (Muneller-Hinton Agar), GPS Agar

(Pseudomonas Aeromonas Selective Agar Base), BHI-B (Brain heart infusion broth) của

Merck

Hóa chất: Cồn tuyệt đối, cồn 70o, nước muối sinh lý đã tiệt trùng (0,85%), chlorine, glycerol, nước cất, các loại hóa chất nhuộm Gram, các hóa chất dùng để kiểm tra các chỉ sinh lý, sinh hóa để định danh vi khuẩn, bộ kit API 20E

Thuốc kháng sinh dùng trong kháng sinh đồ như: Amoxicillin-clavulanic acid

(AMC/30 µg), ampicillin (AMP/10 µg), cefotaxime (CTX/30 µg), doxycycline (DO/30 µg), enrofloxacine (ENR/5 µg), florfenicol (FFC/30 µg), flumequine (UB/30 µg), novobiocin (NV/5 µg), rifampicin (RD/5µg), suphamethoxazole-trimethoprim (SXT/25 µg) (Oxoid,UK)

Mẫu cá: Thu 20 ao (mỗi nơi thu 10 ao) cá bệnh thu khoảng 5-6 con và cá khỏe thu

khoảng 2 con trong mỗi ao

- Mẫu cá bệnh: Thu mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ trên mặt nước và những cá có dấu hiệu khác thường

- Mẫu cá khỏe: Thu mẫu cá không có bất kỳ dấu hiệu khác thường nào

Vi khuẩn làm kháng sinh đồ: 10 chủng vi khuẩn

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển

Thu mẫu và phân lập vi khuẩn ở 20 ao và điều tra thông tin khoảng 30 ao (trong đó bao gồm các ao thu mẫu) nuôi cá lóc thâm canh ở huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh và huyện Vĩnh Thạnh, Tp Cần Thơ Thu thập các thông tin liên quan đến quá trình quản lý sức khỏe như mật độ nuôi, thời gian xuất hiện bệnh, dấu hiệu bệnh lý, loại thuốc điều trị bệnh, trong quá trình thu mẫu

Mẫu cá được tiến hành tiến hành phân tích tại chỗ hoặc vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp và tiến hành phân tích tùy điều kiện thực tế Chỉ sử dụng mẫu cá

lờ đờ, có biểu hiện lâm sàng hay vừa mới chết

3.3.2 Kiểm tra tổng quan mẫu cá và bệnh vi khuẩn

Mẫu vật: Mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống hoặc vừa mới chết Trước khi

giải phẫu đặt cá lên khay sạch và cân trong lượng Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng bệnh

Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tùy tạng và não: Dùng dao kéo đã tuyệt trùng để giải

phẫu cá Khi tiến hành giải phẫu cần tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng vì đây là nguồn vi khuẩn tạp nhiễm làm ảnh hưởng đến kết quả phân lập Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên trong

Đốt que cấy vi sinh trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ đều và để nguội Dùng dao mổ rạch một đường trên cơ quan cần lấy, dùng que cấy để lấy mẫu vi sinh ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng cấy trên môi trường TSA Ủ đĩa phân lập trong tủ ấm 28°C sau 24 giờ Ghi nhận màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, tiến hành tách ròng để có được đĩa vi khuẩn thuần Vi khuẩn được lưu trữ trong môi trường BHI-B và glycerol trong tủ -80°C

Phương pháp nuôi và trữ vi khuẩn: Được thực hiện trong điều kiện vô trùng, tốt nhất

nên thực hiện trong tủ cấy

Đầu tiên, dùng que cấy đã tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguôi, nhặt 2-3 khuẩn lạc

vi khuẩn (đã thuần) cho vào ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn dung dịch BHIB (đã tiệt trùng)

Ủ trong tủ ấm 24 giờ ở nhiệt độ 280C để nuôi vi khuẩn

Sau đó, chuẩn bị các ống ependof (1,5mL), dung dịch glycerol 60% và đầu col (1mL) đã tiệt trùng Dùng pipet hút 250 µL glycerol cho vào ống ependof và kế tiếp là hút 750 µL dung dịch vi khuẩn đã nuôi trước đó cho vào ống ependof chứa glycerol Quấn chặt các ống ependof bằng paraffin Trộn đều hỗn hợp dung dịch vi khuẩn trong các ống epepdof bằng máy vortex Cuối cùng, trữ các ống ependof này trong tủ đông ở -800C

3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E

Trước khi định danh vi khuẩn cần kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa cơ bản như: nhuộm Gram, oxidase, catalase và phản ứng O/F Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kit API 20E được trình bày ở phụ lục E

Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm ở 28°C

(2) IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND, đợi 2 phút Màu đỏ xuất hiện thì kết quả phản ứng

là dương tính (+), màu vàng xuất hiện thì kết quả phản ứng là âm tính (-)

(3) VP: Nhỏ một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2 Đợi ít nhất 10 phút, màu hồng/đỏ xuất hiện thì kết quả phản ứng là dương tính (+), nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10-12 phút thì kết quả phản ứng là âm tính (-)

Các chỉ tiêu còn lại không cần sử dụng thuốc thử thì đọc kết quả dựa vào bảng ở phụ lục

A Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm

- Dùng pipet tiệt trùng hút 0.1 mL dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch TSA Dùng que trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đều đến vừa khô Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pen tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giữa hai tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10-15 mm Mỗi đĩa thạch dán tối đa 6 đĩa kháng sinh Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh thì đặt đĩa vào tủ ấm ở 28ºC

- Đọc kết quả: Sau 24 giờ, trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các vòng tròn không có

vi khuẩn phát triển (vòng vô khuẩn) Đo đường kính của vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011, để xác định tính kháng,

nhạy trung bình và nhạy cảm của với vi khuẩn đối với kháng sinh Tiêu chuẩn tính kết quả đường kính vô khuẩn của một số loại kháng sinh ở phụ lục B

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu thập, tổng hợp và xử lý bằng phần mền Microsoft excel và trình bày bằng Microsoft word

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn

Đề tài đã tiến hành thu mẫu cá bệnh của các hộ nuôi cá lóc thâm canh ở Trà Vinh và Cần Thơ Kết quả phân lập được 33 chủng vi khuẩn từ cá lóc bị bệnh

Số lượng chủng vi khuẩn thu được ở từng tỉnh sử dụng trong nghiên cứu của đề tài được trình bày chi tiết trong bảng 4.1 và phụ lục D

Bảng 4.1: Địa điểm thu mẫu và số lượng chủng vi khuẩn

Địa điểm thu mẫu Thời gian Số chủng vi khuẩn

-Bệnh xuất huyết: Cá bơi lờ đờ, ăn ít; thân, vây và đầu bị xuất huyết; nội quan sẫm màu,

có chất dịch màu đỏ bầm chảy ra; tỉ lệ chết khoảng 30-50%

-Bệnh gan, thận mủ: Cá bơi lờ đờ, tấp mé ao; gan sẫm màu, tùy tạng sưng to, thận có đốm trắng; tỉ lệ chết khoảng 30-60%

Hình 4.1: (A) Dịch màu đỏ bầm trong xoang bụng, (B), (C) và (C) Vây, thân và não bị

xuất huyết (mủi tên)

Hình 4.2: (A) Cá lờ đờ, tấp mé ao, (B) Gan sẫm màu, tùy tạng sưng to (khoan tròn), (C)

Gan, thận và tùy tạng có đốm trắng nhỏ (mủi tên) Tất cả các lần đi thu mẫu đều phân lập được vi khuẩn, với số chủng khác nhau Tuy nhiên, có những mẫu quan sát bên ngoài thấy có dấu hiệu bệnh lý (như trắng thân, lờ đờ, tấp mé ao) nhưng nội quan bên trong lại bình thường và phân lập thì không có vi khuẩn

Cụ thể là: bệnh xuất huyết dạng chấm nhỏ 10 chủng, bệnh xuất huyết toàn thân 8 chủng