Dựa vào kết quả số chủng vi khuẩn phân lập được và một số chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hoá. Đề tài đã chọn ra 7 chủng vi khuẩn (các chủng phân lập được từ cá bệnh xuất huyết) để định danh. Gồm các chủng: CTV1304 và CCT1315, CTV1310, CTV1311, CCT1313, CTV1316 và CTV1323.
Các chủng vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerich và Millar (1993), Buller (2004), và thông qua kết quả kiểm tra bằng bộ kit API 20E (Microbank™, PRO- LAB Diagnostics, UK). Kết quả test các chỉ tiêu cơ bản được trình bày qua bảng 4.2 và phụ lục E.
19
Bảng 4.2: Một số chỉ tiêu cơ bản của các chủng vi khuẩn
S T T Code Mã cá Cơ quan Gram Hình dạng Khuẩn lạc
Oxidase Catalase O/F
1 CTV1304 A1F2 Gan - Que
ngắn
Vàng kem
+ - +/+
2 CCT1315 A1F1 Não - Que
ngắn Trắng đục + + +/+ 3 CTV1310 LTC1 Gan - Que ngắn Vàng đục + + +/+ 4 CTV1311 LTC4 Thận - Que ngắn Trắng đục + + +/+ 5 CCT1313 A2F2 Thận - Que ngắn Trắng đục + + +/+ 6 CTV1316 A1F3 Tuỳ tạng - Que ngắn Hơi vàng + + +/+
7 CTV1323 A2F3 Gan - Que
ngắn
Trắng trong
+ + -/-
Hình 4.4: (A) Hình dạng khuẩn lạc, (B) Kết quả nhuộm Gram
20
Hình 4.5: (A) Kết quả O/F, (B) Kết quả Oxidase và Catalase
Qua kết quả kiểm tra ban đầu về hình dạng và các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản cho thấy, đây có thể là những chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas spp. Đây là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, oxidase và catalase dương tính. Cho những khuẩn lạc màu vàng trên môi trường GSP là loại môi trường đặc trưng để phân lập nhóm vi khuẩn Aeromonas spp có khuẩn lạc màu vàng và cho những khuẩn lạc Pseudomonas spp màu đỏ huyết. Những đặc điểm hoàn toàn giống với mô tả của Newman (1982) (trích dẫn bởi Aoki, 1988; Inglis et al., 1993). Ngoài ra, các dấu hiệu bệnh lý của những mẫu cá bệnh do nhóm vi khuẩn này cũng giống với những mô tả về dấu hiệu bệnh lý do vi khuẩn Aeromonas spp gây ra của các tác giả như: Austin and Austin (1987); Inglis et al. (1993); Aoki (1999); Noga (2010). Theo Phạm Minh Đức và ctv (2010) đã khảo sát mầm bệnh trên cá lóc nuôi thâm ở An Giang và Đồng Tháp cũng phân lập được giống Aeromonas và Pseudomonas
với tỉ lệ xuất hiện lần lượt là 54,3% và 13,6%. Giống Aeromonas thường xuất trong suốt quá tình nuôi, còn giống Pseudomonas thường xuất hiện ở cá thương phẩm.
Để định danh đến loài vi khuẩn, đề tài sử dụng bộ kít API 20E. Kết quả định danh cho thấy đây là các chủng Aeromonas hydrophila (6 chủng) và Pseudomonas aeruginosa (1 chủng). Kết quả các chỉ tiêu API 20E được trình bày thông qua phụ lục G.
21
Hình 4.6: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu bộ kít API 20E (CCT1311 là P. aeruginosa và CCT1310 là A. hydrophila)
Từ những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản tương tự như mô tả của các tác giả trước, thông qua kết quả kiểm tra bằng bộ kít API 20E cho thấy kết quả định danh các chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá lóc là vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Pseudomonas aeruginosa là hoàn toàn phù hợp.
4.3 Kết quả kháng sinh đồ
Trong nghiên cứu này, từ 33 chủng vi khuẩn đã phân lập được, đề tài tiến hành chọn ra 10 chủng vi khuẩn, đại diện các vùng nuôi cá lóc thâm canh ở các địa điểm thu mẫu trong nghiên cứu này. Vi khuẩn có nguồn gốc từ Cần Thơ và Trà Vinh để tiến hành làm kháng sinh đồ, xác định tính kháng, nhạy và nhạy trung bình với 10 loại kháng sinh, được trình bày qua bảng 4.3 và phụ lục F.
22
Bảng 4.3: Tỉ lệ (%) nhạy, nhạy trung bình và kháng các chủng vi khuẩn
% chủng vi khuẩn
TT Thuốc kháng sinh
Nhạy Nhạy TB Kháng
1 Amoxicillin-clavulanic acid 90 10 0
2 Ampicillin 30 10 60 3 Cefotaxime 50 20 30 4 Doxycycline 80 20 0 5 Enrofloxacine 30 40 30 6 Florfenicol 70 0 30 7 Flumequine 60 20 20 8 Novobiocin 20 0 80 9 Rifampicin 60 0 40 10 Suphamethoxazole-trimethoprim 100 0 0
Qua Bảng 4.3, cho thấy các chủng vi khuẩn nhạy hoàn toàn với suphamethoxazole- trimethoprim. Có tỉ lệ kháng tương đối cao với các kháng sinh ampicillin (60%), novobiocin (80%). Vẫn còn nhạy với các loại kháng sinh amoxicillin-clavulanic acid (90%), doxycycline (80%), florfenicol (70%), cefotaxime (50%) và flumequine (60%). Đối với kháng sinh cefotaxime cũng thuộc nhóm β-lactam và vi khuẩn A. hydrophila vẫn còn nhạy tương đối (50%). Có thể vì kháng sinh cefotaxime thuộc nhóm cephalosporin thế hệ 3, có phổ kháng khuẩn rộng và có tác dụng mạnh với vi khuẩn Gram âm, được nghiên cứu để chống lại tác động phân hủy vòng β-lactam của enzyme β-lactamse do vi khuẩn A. hydrophila tiết ra (Treves-Brown, 2000). Kết quả cho thấy, kháng sinh cefotaxime vẫn còn hiệu lực với A. hydrophila nhưng chỉ có thể sử dụng một cách thận trọng và có kiểm soát để điều trị bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila gây ra, để hạn chế hiện tượng kháng thuốc kháng sinh này.
Đối với các kháng sinh doxycycline, đều cho kết quả nhạy với hầu hết các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu, tỷ lệ nhạy là 80% kết quả này tương tự với các nghiên cứu của Trần Duy Phương (2009), Phạm Thị Thanh Hương (2011). Còn enrofloxacin thì có tỉ lệ
23
nhạy rất thấp với 30% và flumequine cho tỉ lệ tương đối với 60%. Tuy nhiên, kháng sinh enrofloxacine đã bị cấm sử dụng (phụ lục H, J) và flumequine thì nằm trong danh mục hạn chế sử dụng (phụ lục I). Vì vậy, không nên sử dụng hai loại kháng sinh này để điều trị, có thể sử dụng doxycycline để điều trị bệnh xuất huyết do nhóm vi khuẩn này gây ra khi thật sự cần thiết. Florfenicol thì vẫn còn sử dụng để điều trị được vì còn nhạy với tỉ lệ 70%, nhưng novobiocin thì không vì độ nhạy rất thấp (20%).
Tương tự với amoxicillin-clavulanic acid, suphamethoxazole-trimethoprim nhạy hoàn toàn với các chủng vi khuẩn A. hydrophila. Theo kết quả nghiên cứu của DePaola et al.
(1988), Phạm Thị Thanh Hương (2011) thì vi khuẩn này kháng với suphamethoxazole-
trimethoprim với tỷ lệ 37%. Từ những phân tích trên cho thấy cần thật thận trọng trong việc sử dụng kháng sinh này trong điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Qua quá trình phân tích còn cho thấy, đặc tính kháng và nhạy với thuốc kháng sinh của vi khuẩn cũng không giống nhau giữa các chủng và các nơi thu được (Hình 4.10). Ghi nhận của nghiên cứu có sự tương đồng với nhận định của tác giả Sarter et al. (2007) khi nghiên cứu đặc tính kháng thuốc của những chủng vi khuẩn Gram âm trong môi trường nuôi ở các trang trại nuôi cá khác nhau tại ĐBSCL. Điều này cho thấy sự cần thiết phải làm kháng sinh đồ khi điều trị bệnh cho cá nhằm đạt hiệu quả điều trị cao nhất.
Qua kết quả kháng sinh đồ, đề tài còn xác định được sự đa kháng thuốc kháng sinh (vi khuẩn kháng cùng lúc nhiều loại kháng sinh, ít nhất là 3 loại kháng sinh), với 10 loại thuốc kháng thì vi khuẩn A. hydrophila có kiểu hình đa kháng 3-6 loại thuốc kháng sinh (phụ lục F).
Kết quả cho thấy, sự đa kháng thuốc của các chủng vi khuẩn (kháng trên 3 loại kháng sinh) có tỉ lệ tương đối thấp. Tỷ lệ đa kháng này tương đồng so với những nghiên cứu trước đây (DePaola et al.,1988; Mirada and Zemelman, 2002; Akinbowale, 2006; Starter
et al., 2007; Phạm Thị Thanh Hương, 2011).
Đối với vi khuẩn P. aeruginosa vẫn còn nhạy với các loại kháng sinh như amoxicillin-
clavulanic acid, cefotaxime, doxycycline, florfenicol, flumequine với tỉ lệ tương đối cao. Kháng với ampicillin, novobiocin, rifampicin, suphamethoxazole-trimethoprim, có kiểu đa kháng là APM+NV+RD+SXT (phụ lục F). Kết quả này cũng tương đồng với những nghiên cứu của các tác giả trước. Do đó, cần phải thận trọng hơn trong việc điều trị bằng kháng sinh hiện nay. Có thể dùng những loại thuốc còn nhạy với P. aeruginosa nhưng với liều lượng hợp lý.
24
Bên cạnh đó, hiện nay sự gia tăng đáng kể của tỷ lệ đa kháng cho thấy sự kháng thuốc kháng sinh ngày càng phức tạp hơn. Vì thế, cần thận trọng trong việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh cho động vật thủy sản, nhằm đảm bảo an toàn sức khỏe cho con người. Người nuôi phải tuân thủ các nguyên tắc sử dụng kháng sinh theo đúng chỉ dẫn của nhà sản xuất. Thận trọng khi dùng các loại thuốc được khuyến cáo sử dụng, đặc biệt không nên dùng những loại nằm trong danh mục cấm sử dụng của Bộ đưa ra.
25
CHƯƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết luận
Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên các mẫu cá lóc thu được là loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Pseudomonas aeruginosa.
Kết quả kháng sinh đồ ghi nhận kháng sinh suphamethoxazole-trimethoprim nhạy hoàn toàn với các chủng vi khuẩn A. hydrophila và nhạy với các loại kháng sinh amoxicillin-
clavulanic acid (90%), doxycycline (80%), florfenicol (70%), flumequine (60%), rifampicin (60%). Đối với vi khuẩn P. aeruginosa thì vẫn còn nhạy với các loại kháng sinh như amoxicillin-clavulanic acid, cefotaxime, doxycycline, florfenicol, flumequine với tỉ lệ tương đối cao. Kháng với ampicillin, novobiocin, rifampicin, suphamethoxazole- trimethoprim, có kiểu đa kháng là APM+NV+RD+SXT.
Đề tài cũng ghi nhận có một số chủng vi khuẩn trong nghiên cứu thể hiện sự đa kháng thuốc (kháng 3-6 loại thuốc kháng sinh) với cả 2 chủng vi khuẩn này
5.2 Đề xuất
Cần có những nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của các yếu tố (như môi trường, sử dụng thuốc, tác động của vi khuẩn,…) lên cá lóc khi đã bị nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và P.
aeruginosa, những yếu tố này cũng khá qua trọng dẫn đến việc bộc phát bệnh trong suốt quá trình nuôi.
Tình hình bệnh thủy sản xảy ra ngày phức tạp, hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila diễn ra ngày càng gia tăng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu theo hướng mới: vaccine, thảo dược… để giảm vai trò của thuốc kháng sinh trong ngành nuôi trồng thủy sản.
26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Angka, S.L., 1990. The Pathology of the Walking catfish Clarias batrachus (L), infected intraperitonneally with Aeromonas hydrophila Asian Fish Sei. 3: 343-351.
Aoki, T., 1988. Motile Aeromonas (Aeromonas hydrophila). Fish disease and disorder. 3:427-443.
Akinbowale, L.O, H. Peng and D.M. Barton, 2007. Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia. Journal of Applied Microbiology. 103: 1364-5072.
Austin, B., and D.A. Austin. 1987. Bacterial fish pathogens disease in framed and wild fish. Ellis Horwood. Chichester. United Kingdom.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Trung tâm khuyến nông-khuyến ngư Quốc gia, 2009. Kỹ thuật nuôi cá lóc bong. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 35 trang.
Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học Thủy sản. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I. Nhà Xuất Bản Nông nghiệp. 439 trang.
Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 2000. Những bệnh thường gặp của tôm cá và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 79 trang.
Bùi Quang Tề, 2001. Ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và các giải pháp phòng trị chúng. Luận văn tiến sĩ.
Bùi Thị Tho, 2003. Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi. NXB Hà Nôi, 323 trang.
Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. NXB Nông nghiệp-Hà Nội, 219 trang.
Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng và Bùi Kim Tân, 2001. Thuốc kháng sinh. Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu. 255 trang.
CrumLish, M. Thanh, P.C., Koesling, J., Tung, V., T. and Gravingen, K., 2006. Antibiotic sensitivity profiles for bacteria from natural outbreaks of Edwardsiellosis
and motile Aeromonas septicaemia in Vietnamese Pangasius hypophthamus.
www.phamaq.no/Posters/DAAVI_2008-poster.
Chang, B.J., and S.M. Bolton. 1987. Plasmid and resistance of antimicrobial agents in
27
Cabello, F.C., 2006. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for environmet. Environment of Microbiology. 8:1137-1144.
Cipriano, R.C., G.L. Bullock and S.W. Pyle, 2001. Aeromonas hydrophila Aad Motile Aeromonad. Revision of Fish Disease Leaflet 68 (1984).
Crumlish, TTDung, JFTurnbull, NTN.Ngoc, and HW Ferguson (2001), Short communication of Edwerdsiella ictaluri from diseases freshwater catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Joural of fish diseases 2002, 25, 733-736.
Dương Nhựt Long, 2004. Giáo trình kỹ thuật nuôi cá nước ngọt. Khoa thủy sản-Đại học Cần Thơ. 168 trang.
Dung , T.T., F. Heasebrouck, N.A Tuan, P. Sorgeloos, M. Baele and A. Decostere, 2008. Antimicrobial susceptibility pattenrn of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreaks of Bacillary Necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam. Microbial Drug Resistance. 14: 311-316.
Inglis, V., Roberis R.J. and Bromage N.R, 1993. Bacterial disease of fish. Blackwell Science.
Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2006. Bài giảng thuốc và hóa chất trong nuôi trông thủy sản, 74 trang.
Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 2009. Khảo sát các mô hình nuôi cá lóc (Channa micropeltes và Channa striata) ở ĐBSCL. Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản toàn quốc Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh: trang 436-447.
Lư Trí Tài, 2010. Tìm hiểu một số mần bệnh trên cá lóc (Channa striata) trong ao nuôi thâm canh. Luận văn cao học. Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Diệp Thúy, 2010. Phân tích một số chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật của các mô hình nuôi cá lóc ở ĐBSCL. Luận văn cao học. Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ. Nguyễn Văn Thường, 2004. Tổng quan về thành phần loài và phân bố của cá họ
Channidae. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, chuyên đề thủy sản, trang 14-24. Nguyễn Quốc Thịnh, 2006. Điều tra đánh giá tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong
nuôi cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) đề tài cấp trường, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ.
28
Nguyễn Thị Thuý Hằng, 2008. Tiêu chuẩn hoá phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa thuỷ sản. Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thuỷ Sản, trường đại học Cần Thơ. 56 trang.
Noga, E.J., 2010. Fish disease, diagnosis and treatment. Blackwell Publishing, p.199-201. Phạm Minh Đức, Trần Ngọc Tuấn và Trần Thị Thanh Hiền, 2012. Khảo sát mầm bệnh trên cá lóc (Channa striata) nuôi thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp. Tạp chí Khoa học 2012:21b. Trang 124-132.
Phạm Thị Thanh Hương, 2010. Nghiên cứu sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra
(Pangasianodon hypopthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt nghiệp
Cao học, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.
Prescott, J.F., J.D. Baggot and R.D. Walker, 2000. Antimicrobial therapy in veterinary medicine. Lowa State University press/Ame: 796 pp.
Pillay, T.V.R, 1990. Aquaculture principles and practices. Fishing News Books, Blackwell Science, Oxford, UK, p410-412.
Qin Jian Guang, A.W. Fast and J.G. Qin, 1996. Size and feed dependent cannibalism with juvenile Snakehead Channa striata. Aquaculture 144(4): 313-320.
Rainboth, W.J., 1996. Fishes of The Cambodian Mekong. FAO species identification sheets for fishery purposes. Food and Agriculture Organization, Rome. 265p.
Robinson, J.A and F.P. Meyer, 1966. Streptococcus fish pathogen. Journal of Bacteriology 92. 512p.
Snieszko, S.F. and Axelrod, H.R. 1971. Septicemec diseases caused by motile Aeromonads and Pseudomonads. Book 2A: Bacterial Diseases of fishes. Bullock G. L. Conroy D. A. and Sneiszko S. F. Book 2B. Bullock G. L. Identification of fish pathogenic bacteria. T. F. H. Publications Inc., 245.
Shu-Peng H., H. Tain-Yan, C. Ming-Hui and W. Way-Shyan, 2000. Antibacterial effect of chloramphenicol, thiamphenicol and flofenicol against aquatic animal bacteria. Journal Veterinary Medicine Science. 62: 479-485.
Stock, I. And B. Wiedemann, 2001. Natural antimicrobial susceptibility of Edwardsiella tarda, E. Ictaluri and E. Hoshinae. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 45:2245- 2255.
29
Sarter, S., N.H Kha, L.T. Hung, J. Lazard and D. Montet, 2007. Antibiotic resitance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish. Food Control. 18: 1391-1396. Tenover F.C. 2006. Mechanism of antimicrobial resistanc in bacteria. The Amarican
Journal of Medicine. 119, S3-10.
Treves-Brown, K.M., 2000. Applied fish pharmacology. Kluwer Academic publishers. 309 pp.
Từ Thanh Dung, 2005. Bài giảng bệnh học thủy sản, 65 trang. Khoa Thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ.
Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa. 2005. Bài giảng Bệnh vi khuẩn trên động vật thuỷ sản, 124 trang
Tuan, X.L., Y. Munekage and S. Kato, 2005. Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas. Science of the Total Environment. 349: 95-105. Yanong, R.P.E., 2003. Fungal diseases of fish. Vet Clin Exot Anim. 6: 377-400.
Trang wed http://tepbac.com/technical/full_2_26_81/Phong-va-tri-mot-so-benh-thuong-gap-o-ca- loc.htm (Cập nhât: 19h, 01/08/2013). http://vibo.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=63 (Cập nhật: 20h, 01/08/2013). http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1231 (Cập nhật: 8h, 02/08/2013). http://www.agroviet.gov.vn/pages/news_detail.aspx?NewsId=12745 (Cập nhật: 21h,