ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của vi khuẩn bacillus megaterium v1

Tuy nhiên các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nguồn nito và thời gian ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA SÚC, GIA CẦM CỦA

VI KHUẨN Bacillus megaterium V1

MSSV: 3103968 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA SÚC, GIA CẦM CỦA

VI KHUẨN Bacillus megaterium V1

MSSV: 3103968 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

-- -

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:

Ban Giám Hiệu, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tập thể quý Thầy, Cô - trường Đại học Cần Thơ đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

TS Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và đóng góp ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cô Trần Thị Xuân Mai – Cố vấn học tập lớp công nghệ sinh học tiên tiến, khóa

36 – trường Đại học Cần Thơ đã động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tập thể lớp công nghệ sinh học tiên tiến, khóa 36 cùng lớp bạn Công nghệ Sinh học, khóa 36 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về mặt vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực, luôn có cống hiến quý báo cho sự nghiệp giáo dục

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 11 tháng 11 năm 2014

TÓM LƯỢC

Lông vũ chứa khoảng 90% keratin và được thải ra với một khối lượng lớn từ ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm làm ô nhiễm môi trường Keratin là một loại protein rất khó phân hủy bởi các yếu tố vật lý hay hóa học Sử dụng vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn để xử lý nguồn chất thải chứa keratin này có ý nghĩa thiết thực trong ngành công nghiệp, nông nghiệp như chế biến thức ăn gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón Enzyme keratinase được tổng hợp nhiều ở Bacillus megaterium V 1 và có nhiều ứng dụng Tuy nhiên các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nguồn nito và thời gian ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme keratinase để phân hủy bột lông của chủng vi khuẩn trên là rất cần thiết Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 ” được thực hiện với mục tiêu xác định các điều kiện môi trường thích hợp để dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 phát triển và phân hủy lông gia súc, gia cầm đạt hiệu quả cao Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phát triển thuận lợi trong môi trường pH 8,0 tại nhiệt độ thích hợp là 35 o C và nồng độ giống chủng 10% Hoạt động của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy chỉ có bột lông

là nguồn carbon tốt hơn có ý nghĩa so với môi trường có bổ sung nguồn carbon Ngoài bột đậu nành và yeast extract giúp làm tăng mật số vi khuẩn, nguồn nitơ NH 4 Cl khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn so với môi trường chỉ chứa bột lông như nguồn nitơ duy nhất

Từ khóa: Bacillus megaterium, keratin, keratinase

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về chất thải lông gia súc – gia cầm 3

2.2 Cấu trúc của keratin 3

2.3 Sơ lược về enzyme keratinase 4

2.4 Sơ lược về vi khuẩn phân giải keratin 5

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của vi khuẩn 7

2.5.1 Các yếu tố vật lý 7

2.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng 7

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9

2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 9

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 11

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

3.1 Phương tiện nghiên cứu 13

3.1.1 Địa điểm - Thời gian 13

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 13

a Giống vi khuẩn 13

b lông gia súc, gia cầm làm cơ chất 13

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 13

3.1.4 Hóa chất 14

3.1.5 Thiết bị - dụng cụ 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống và xử lý cơ chất 15

a Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống 15

b xử lý cơ chất 15

Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 15

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 15

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 16

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 17

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 17

3.2.6 Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 18

Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 19

3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 19

3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 19

3.2.9 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 20

3.2.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển

và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 21 3.2.11 Khảo sát sự phân hủy sợi lông gia súc theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 21 3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và

khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 26

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 26 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 29 4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển

và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 31 4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1. 33 4.5 Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1. 36

Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và

khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 38

4.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 38 4.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 41 4.8 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển

và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 43 4.9 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 45 4.10 Khảo sát sự phân hủy lông gia súc nguyên theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 48

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần hóa chất môi trường bột lông lỏng 13Bảng 2 Thành phần hóa chất môi trường bột lông rắn 14Bảng 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy bột

lông gia cầm và hàm lượng protein hòa tan của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 26Bảng 4 Mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy sợi lông gia cầm nguyên và hàm lượng

protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 ở tuần thứ 10 36Bảng 5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy bột

lông gia súc và hàm lượng protein hòa tan của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 38Bảng 6 Mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy sợi lông gia súc nguyên và hàm lượng

protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 ở tuần thứ 10 49

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Cấu trúc hiển vi của các vi sợi keratin trong tế bào 4Hình 2: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến mật số vi khuẩn 29Hình 3: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến hiệu suất phân hủy bột

lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V 1 30Hình 4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến mật số của vi

khuẩn Bacillus megaterium V 1 31Hình 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến hiệu suất phân hủy

bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V 1 32Hình 6: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số của vi khuẩn

Bacillus megaterium V 1 34Hình 7: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến hiệu suất phân hủy

bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V 1 35Hình 8: Sợi lông gia cầm nguyên bị phân giải ở tuần thứ 10 37Hình 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến mật số của vi khuẩn

Bacillus megaterium V 1 41

Hình 10: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến hiệu suất phân hủy bột

lông gia súc và hàm lượng protein của Bacillus megaterium V 1 42Hình 11: Biểu đồ ảnh hưởng Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon

đến mật số của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 43Hình 12: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến hiệu suất phân

hủy bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V 1 44Hình 13: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số của 45

vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 45Hình 14: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến hiệu suất phân hủy

bột lông và hàm lượng protein hòa tan của Bacillus megaterium V 1 47Hình 15: Sợi lông gia súc nguyên bị phân giải ở tuần thứ 10 49

CÁC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi là một ngành kinh tế quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, nó vừa đáp ứng nhu cầu lương thực, thực phẩm cho tiêu dùng hằng ngày của con người vừa là nguồn thu nhập quan trọng của hàng triệu người dân hiện nay Tuy nhiên, song song với những lợi nhuận đó là vấn đề ô nhiễm môi trường nghiêm trọng từ các sản phẩm chăn nuôi Lông gia súc, gia cầm thải từ các lò mổ gia súc gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe người dân sống xung quanh

Lông gia súc, gia cầm rất khó phân hủy do thành phần chính của chúng là keratin nguyên chất, một loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân hủy cao, cần thời gian rất lâu để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên Nếu sử dụng phương pháp vật

lý và hóa học để xử lý lông thì tốn rất nhiều năng lượng và không thân thiện với môi trường Việc sử dụng phương pháp sinh học là phương pháp hiệu quả, không tốn năng lượng lại cho hiệu suất phân hủy cao Bên cạnh đó, nếu được xử lý thích hợp thì phế phẩm lông có thể trở thành một nguồn protein bổ sung hiệu quả vào thức ăn chăn nuôi thay thế cho các nguồn protein đắt tiền khác, vừa có thể giải quyết vấn đề môi trường lại có thể tận dụng nguồn phế phẩm này đem lại hiệu quả cao về kinh tế Ứng dụng công nghệ sinh học vi sinh vật đã phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả

năng phân hủy mạnh chất thải chứa keratin mà trong đó dòng vi khẩn Bacillus megaterium V 1 thể hiện được khả năng phân hủy keratin mạnh Tuy nhiên, các yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nguồn nito và thời gian có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme keratinase

để phân hủy bột lông của vi khuẩn

Xuất phát từ những vần đề trên đề tài: “Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của dòng vi

khuẩn Bacillus megaterium V1” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định các điều kiện môi trường thích hợp để dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V 1 phát triển và phân hủy lông gia súc, gia cầm đạt hiệu quả cao

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon

và nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của dòng

vi khuẩn Bacillus megaterium V1

Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên và sợi lông gia súc nguyên theo thời

gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 ở các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon và nitơ phù hợp

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về chất thải lông gia súc – gia cầm

Theo báo cáo của Cục Chăn nuôi, hằng năm đàn vật nuôi thải ra khoảng 80 triệu tấn chất thải rắn, vài chục tỷ chất thải lỏng hàng năm Lông gia súc, gia cầm chiếm một lượng lớn trong chất thải rắn, khó phân hủy do lượng keratin chiếm đến 90% trong thành phần cấu tạo và ngày càng tích lũy nhiều trong tự nhiên dẫn đến ô nhiễm môi trường (Gupta và Ramnani, 2006) Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh khiết đồng thời được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông gia súc, gia cầm được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn protein đắt tiền khác

để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên việc sản xuất lông làm thành phần bổ sung cho thức ăn chăn nuôi chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý hóa học còn nhiều hạn chế, không những tiêu tốn rất nhiều năng lượng mà cũng không thủy phân hoàn toàn được lông còn phá hủy amino acid làm giảm chất lượng và tỉ lệ tiêu hóa protein

2.2 Cấu trúc của keratin

Keratin là một protein có cấu trúc dạng sợi, là thành phần chủ yếu cấu thành nên

da, tóc, móng tay… (Eggling, 2003) hoàn toàn không tan, kể cả trong dung dịch acid hay kiềm Khi phân giải cho nhiều cystine (7 – 12%) và acid glutamic (4 – 17%) Theo cấu trúc cơ bản bậc hai, keratin được phân thành hai dạng α (α – helix của tóc) và β (β – sheets của lông) (Akhtar và Edwards, 1997) Các sợi keratin ở cả hai dạng α-helix và β-sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al., 2004) Keratin cũng được phân loại thành keratin cứng và mềm dựa vào hàm lượng lưu huỳnh Keratin cứng được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc, móng guốc và móng với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài và keratin mềm được tìm thấy ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mềm dẻo hơn (Voet và Voet, 1995) Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ liên kết hidro, tương tác kỵ nước

và các cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc bền vững của keratin có khả năng kháng lại tác động của các tác nhân phân hủy vật lý, hóa học và sinh học Keratin không tan trong nước, acid loãng kiềm và dung môi hữu cơ cũng như không bị phân giải bởi các protease thông thường như trypsin, pepsin hay papain (Veslava Matikevičienė et al., 2009) Tuy nhiên một số loài vi khuẩn vẫn có khả năng phân giải keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính của enzyme keratinase (Onifade et al 1998)

Hình 1: Cấu trúc hiển vi của các vi sợi keratin trong tế bào

(Nguồn http://en.wikipedia.org/wiki/Keratin ngày 6/3/2014) Lông gia súc có cấu tạo chủ yếu từ protein keratin dạng α – helix, cấu trúc này bền vững, tương tự cấu trúc β – sheets của keratin có trong lông gia cầm cũng hết sức chặt chẽ và khó phân giải Trong tự nhiên, thời gian thật sự để keratin (từ lông gà) tự phân là 5 – 7 năm (Lê Thị Thu Huyền, 2012)

2.3 Sơ lược về enzyme keratinase

Keratinase thuộc họ protease có khả năng thủy phân keratin trong tự nhiên Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử (IUBMB), keratinase được ký hiệu

là EC 3.4.99 Trọng lượng phân tử 33 kDa (Owen et al., 1989) Ngoài ra, keratinase còn được gọi là serine protease do 97% trình tự tương đồng với protease có tính kiềm

và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế tương tự serine Hầu hết các keratinase được tìm thấy đến nay đều thuộc loại serine protease và chỉ có một vài metalloprotease cho thấy có hoạt tính phân giải keratin Các metalloprotease này thường được tìm thấy ở các vi khuẩn Gram âm (Brandelli, 2007)

Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, chỉ được tạo ra trong sự hiện diện của keratin trong cơ chất Keratinase phân giải keratin bằng cách tấn công vào các cầu nối disulfide (Prasad et al., 2010) Enzyme này có nhiều đặc trưng bề mặt, chúng có thể phân giải protein dạng sợi như fibrin, elastin, collagen và các protein không có sợi như casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin,…

Keratinase có tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,… Bên cạnh đó, enzyme này còn có ứng dụng nổi bật là phân hủy prion và protein giống prion (Selvam và Vishnupriya, 2012) Keratinase được sản xuất chủ yếu bởi một số loài vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm hoại sinh và ký sinh, actinomycetes.

2.4 Sơ lược về vi khuẩn phân giải keratin

Molyneux đã phân lập một số vi khuẩn có khả năng phân giải keratin vào năm

1959 Một số dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Streptomyces có khả năng phân giải

lông vũ cũng được phân lập từ đất và lông vũ ở các cơ sở sản xuất và chế biến gia

cầm Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia

tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và hình thành nội bào tử Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc

chi Bacillus rất đa dạng Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám Trong đó các dòng cho khả năng phân giải keratin tốt thuộc Bacillus sp., B licheniformis và B subtilis (Balaji et al., 2008; Cai et al., 2008; Manczinger et al., 2003; Suh và Lee, 2001) Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất,

nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 30oC, sinh enzyme tối đa ở 37oC và có khả năng sinh bào tử ở môi trường khắc nghiệt

Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hình thành bào tử, hô hấp hiếu khí và nó được tìm thấy trong đất Bacillus megaterium phát triển ở nhiệt độ

từ 3 - 45oC, tối ưu khoảng 30– 35OC Một số dòng phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam

Bacillus megaterium là một loại vi khuẩn hoại sinh rất thường có trong đất Chu

trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân hủy hóa chất hữu cơ thành các hợp chất đơn giản hơn được thực hiện bởi các loại vi sinh bao gồm nhiều loài vi

khuẩn và nấm khác nhau mà Bacillus megaterium là một trong số đó Các loài vi sinh

này sử dụng các chất dinh dưỡng từ các vật liệu hữu cơ chết hay hoại sinh để duy trì nguồn năng lượng cho sự phát triển của chúng Trong môi trường đất vi khuẩn ở dạng sinh dưỡng khi có sẵn cơ chất cho chúng phát triển và chuyển thành dạng bào tử khi chất dinh dưỡng trở nên cạn kiệt Điều này là một chiến lược sinh tồn được sử dụng

bởi nhiều loại vi sinh chiếm ưu thế trong môi trường sống hiếu khí của đất ngoài vi khuẩn còn có các loại nấm sợi và các loài xạ khuẩn (actinomyces) Các nhóm vi sinh

đó sống trong đất và tạo ra kháng sinh quần hợp với quy trình tạo thành bào tử của chúng Vì có rất nhiều loài vi sinh tạo bào tử có thể có hiệu quả phân giải nhiều hợp chất polymer sinh học như protein, tinh bột, pectin,… chúng được cho là có vai trò đáng kể trong chu trình sinh học của carbon và nitrogen Chính nhờ đặc tính này hiện

nay Bacillus megaterium là một trong những loài vi khuẩn được dùng khá phổ biến

trong lĩnh vực xử lý môi trường (Patricia S Vary et al., 2007).Bacillus megaterium là

dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông cao Protein keratinase từ dòng này đã được nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thương mại có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học, liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia súc gia cầm và công nghệ da Trong số các vi khuẩn Gram dương, các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả

năng phân giải keratin được nhận diện là Arthrobacter sp (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) Một số dòng vi khuẩn Gram âm cũng có khả năng phân giải keratin như các loài Vibrio sp (Sangali et al., 2000), Chryseobacterium sp (Riffel et al., 2003) và Xanthomonas sp

(De Toni et al., 2002) Bên cạnh đó, nhóm xạ khuẩn và nấm cũng có khả năng phân

giải keratin như Streptomyces fradiae (Novel và Nickerson, 1959), Streptomyces sp A11 (Mukhopadhyay Chandra, 1990), Streptomyces pactum (Blockle et al., 1995), Streptomyces albidoflavus (Letouneau et al., 1998)

Một số loài vi khuẩn chịu nhiệt cũng tạo được enzyme keratinase như

Thermoanaerobacterkeratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002), và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004) Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A, được

phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho thấy khả năng tạo keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gousterova et al., 2005)

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân hủy lông gia súc, gia cầm của vi khuẩn

2.5.1 Các yếu tố vật lý

Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải keratin của vi khuẩn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Các thông số vật lý cho sự sản xuất của vi sinh vật chuyên biệt theo loài và vì thế thay đổi tùy theo từng dòng vi sinh vật Các giá trị pH kiềm nằm trong khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase và sự phân hủy lông gia cầm ở hầu hết các vi khuẩn Giá trị pH kiềm được cho là kích thích sự phân hủy keratin do làm biến đổi các cystine thành lathionine khiến cho keratinase dễ dàng tiếp cận cơ chất Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng từ 28 – 50oC ở hầu hết các

vi khuẩn Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp kr6 phát triển tối ưu ở nhiệt độ 30oC

và pH 8,0 và hoạt động phân hủy lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt độ này (Riffel

et al., 2003) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là 30oC, và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại (Sangali et

al., 1999) Theo Sinoy et al (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp phát

triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30 – 40oC và pH tối ưu là 6 – 8, hoạt độ keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ, pH này

2.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng

 Nguồn nitơ

Vi sinh vật có khả năng hấp thụ nhiều nguồn dinh dưỡng nitơ khác nhau Tùy theo đặc điểm dinh dưỡng của từng loài mà nó đòi hỏi các dạng nitơ khác nhau Các nguồn nitơ hữu cơ như: bột ngô, bột đậu nành, cám mì, casein, peptone, tryptone, yeast extract, sữa không béo, và các nguồn nitơ vô cơ như: urea, NH4NO3, NH4Cl, NO2-,

NO3-, thích hợp cho các vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, sản sinh nhanh enzyme thúc đẩy quá trình phân hủy lông Brandelli (2000) sử dụng nguồn nitơ bổ sung là yeast extract và NH4Cl cho hiệu quả phân hủy keratin đáng kể Các dạng nitơ hữu cơ

không những là nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi sinh vật Theo nghiên cứu của Mohammad et al (2007), NH4Cl được bổ sung với nồng độ 0,1% (w/v) cho kết quả là hoạt động enzyme tăng thêm 12% Trong trường hợp bổ sung cả rỉ đường và NH4Cl với nồng độ lần lượt là 1% (w/v) và 0,1% (w/v), sự

phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 đạt hiệu quả

parafin, khí thiên nhiên

Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân (amilase, xenlulase, pectinase, lipase,…) để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấu thụ (đường, axit amin, axit béo,…)

Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn carbon khi nuôi cấy phần lớn các

vi sinh vật dị dưỡng Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau Với vi khuẩn người ta thường dùng 0,5 – 0,2% đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3 – 10% đường

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường Thành phần chính của rỉ đường là đường, chủ yếu là saccharose một ít glucose và fructose Thành phần chính xác của rỉ đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà máy Do vậy, đường thay đổi đáng kể về thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và

độ nhớt

Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường được chia thành 3 phần: đường, chất hữu cơ không đường và chất khoáng Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn) là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu Bên cạnh

đó, rỉ đường là một nguồn giàu chất khoáng, vitamin – kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Theo kết quả nghiên cứu của Mohammad et al (2007), bổ sung nồng độ rỉ đường với 1% thúc đẩy sự hoạt động của enzyme phân hủy lông gia cầm ở dòng vi khuẩn

Bacillus licheniformis MZK-3

Trong sản xuất Keratinase, có thể dùng một số cơ chất tự nhiên làm nguồn carbon: bột bắp, rỉ đường, cám mì, cám gạo, cám ngô (Ramnani et al.,2001)

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Theo Sangali et al (1999) các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin thuộc

họ Vibrionaceae đã được phân lập từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil Nghiên cứu

cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và tạo ra enzyme phân giải keratin của vi khuẩn này là 30oC

Sangali và Brandelli (2000) đã phân lập được những dòng vi phuẩn Vibrio sp từ chất thải lông gia cầm Một dòng Vibrio sp kr2 được khảo sát cho thấy khả năng phân

hủy keratin tốt so với các dòng còn lại Điều kiện thuận lợi cho những dòng này phát triển là nhiệt độ trong khoảng 20-30oC và pH 6,0 Một nghiên cứu khác về quá trình

phân hủy keratin của dòng vi khuẩn Serratia sp HPC 1383 nhằm khảo sát những điều

kiện ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme keratinase và hiệu quả của việc phân hủy keratin bằng vi sinh vật Kết quả cho thấy rằng enzyme được tạo ra nhiều hơn khi môi trường dinh dưỡng bổ sung thêm những protein cần thiết cho vi sinh vật phát triển, như là bổ sung thêm 0,2% yeast extract thì hoạt độ của enzyme tăng lên 130 U/ml so với mẫu không bổ sung Enzyme kertinase được khảo sát ở những điều kiện khác nhau Kết quả cho thấy nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme keratinase là

60oC và pH 10 Enzyme keratinase bị ức chế bởi các tác nhân như b-mercaptoethanol làm ức chế 39% hoạt tính enzyme, Zn2+ gây ức chế đến 41% hoạt tính của enzyme (Khardenavis et al 2009)

Kim et al (2001) đã phân lập được một số dòng Bacillus sp từ nước thải lông gia cầm Một trong những dòng được phân lập, có 3 dòng được định danh là Bacillus subtilis, Bacillus pumilis và Bacillus cereus có khả năng phân hủy hiệu quả lông gia

cầm và tạo ra được lần lược là 142, 96, 109 đơn vị hoạt độ enzyme Các dòng vi khuẩn này được khảo sát khả năng phân hủy keratin và những điều kiện ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng và phát triển của chúng Kết quả cho thấy, dòng B Subtilis cho hiệu quả

phân hủy tốt nhất, điều kiện môi trường tối ưu cho hoạt động của dòng vi khuẩn B

subtilis là ở 400C, trong khoảng pH 5 - 9 Hoạt độ enzyme keratinase phân hủy keratin của dòng này là 161 U/ml sau 84 giờ ủ lắc

Riffel et al (2002) đã thực hiện một nghiên cứu cho thấy vi khuẩn

Chryseobacterium sp dòng kr6 có khả năng phân giải hoàn toàn lông vũ trong quá

trình nuôi cấy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của dòng này là 30oC và pH tối ưu 8,0 Dưới điều kiện này, lông vũ cũng được phân giải một cách tối đa Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính của keratinase bị ức chế bời EDTA, Hg2+, Cu2+ và được kích hoạt bởi Ca2+

Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng của enzyme này Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều kiện môi trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế phản ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân protein Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp

Riffel và Brandelli (2006) đã tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải keratin từ chất thải lông gia cầm Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông gia súc và kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa Trong đó có ba

dòng Gram âm (thuộc chi Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas) và một dòng Gram dương (Microbacterium sp.) Những vi khuẩn này có thể phát triển trên

nhiều loại chất thải chứa keratin như bột lông gia súc, lông vũ thô, móng gà, tóc và len Hoạt tính phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra với hai cơ chất azokeratin và azocasein Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân gải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường

Joshi et al (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp PW-1 có khả

năng phân giải lông vũ từ chất thải gia cầm Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, nitơ và lưu huỳnh

Bo Xu et al (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là

Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90oC) và pH rộng (6 – 10) Nhiệt độ tối ưu là 60oC và pH tối ưu từ 7,5 – 8

Daroit et al (2009) cũng đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp P45 có khả

năng phân giải protein trên môi trường sữa không béo và môi trường bột lông gia súc

Dòng Bacillus sp P45 có khả năng phân giải 90% lông gà sau 72h nuôi cấy trong môi

trường lỏng có bổ sung lông gà Tuy nhiên, dòng vi khuẩn này không có khả năng phân giải keratin tóc, có thể do sự đa dạng về cấu hình của cơ chất này so với keratin lông vũ

Hai dòng vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có khả

năng phân hủy tóc, móng và lông gia súc đã được phân lập bởi Savitha et al (2010) Enzyme của chúng có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thịt, đồng thời enzyme được sản xuất từ các dòng vi khuẩn này cũng được sử dụng để xử lý các loại rác thải chứa keratin

Ba dòng vi khuẩn B megaterium SN1, B thuringenesis SN2, B pumilis SN3

phân lập từ bãi đất chôn lông gia cầm có khả năng phân giải lông gà và lông bồ câu sau 5 ngày nuôi cấy (Agrahari et al., 2010)

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải keratin đã được phân lập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông gia cầm Nguyễn Đình Quyến (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất 7 dòng xạ khuẩn

và 15 dòng Bacillus có hoạt tính phân giải casein rõ rệt Trong đó 5 dòng xạ khuẩn và

2 dòng Bacillus có khả năng phân hủy lông gà mạnh

Nguyễn Huy Hoàng et al (2010) đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn

Bacillus, Chryseobacterium, từ một số vùng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam

Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này là ở 30°C đến 40°C và có khả năng phân hủy lông vũ đạt từ 75% đến 90% sau một tuần nuôi cấy Các chủng vi khuẩn đã được phân loại định danh bằng các nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit API

50CHB, API 20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA Kết quả định danh của bốn dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông vũ mạnh nhất cho thấy các dòng này lần

lượt tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Chryseobacterium spp

Nguyễn Thu Hiền et al (2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã

phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân giải lông vũ

Bùi Thị Minh Diệu và Đinh Thị Bé Hiền (2011) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 19 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc Trong đó, dòng vi khuẩn K13, dòng O3 và dòng K8 cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân giải lông gia súc lần lượt là 63,38%, 60,9% và 58,33%

Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiên một nghiên

cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân giải lông gà, pH tối

ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 – 8, nhiệt độ

35C, nồng độ lông là 20 g/L

Phạm Minh Triết (2013) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 18 dòng vi

khuẩn có khả năng phân giải keratin Trong đó có dòng vi khuẩn Bacillus megaterium

cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lông lên đến 40,48%

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm - Thời gian

- Thời gian thực hiện: từ tháng 04/2014 đến 10/2014

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và

Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm

a Giống vi khuẩn

Dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm Minh Triết phân lập từ đề tài luận văn “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy keratin chịu nhiệt ở tỉnh Đồng Tháp” (2013)

b lông gia súc, gia cầm làm cơ chất

Các mẫu lông gia cầm, gia súc thu tại một số cơ sở giết mổ và chăn nuôi gà, vịt tại Cần Thơ

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 1 Thành phần hóa chất môi trường bột lông lỏng

(*Nguồn: Daniel et al., 2009)

Bảng 2 Thành phần hóa chất môi trường bột lông rắn

- Cân điện tử (Sartorius Teg101 – Đức)

- Tủ cấy (Telstar Bio-II-A, Tây Ban Nha)

- Bộ micropipette (NichipetEX – Nhật Bản)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational – Ý)

- Kính hiển vi (Olympus U-CMAD3, Nhật Bản)

- Máy lắc mẫu (New Brunswich Scientific – Hoa Kỳ)

- Đĩa petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh

- Một số dụng cụ khác như: ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, đầu cone (vàng, xanh, trắng), găng tay, khẩu trang y tế, đèn cồn, bình hút ẩm,

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống và xử lý cơ chất

a Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống

Dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 ròng trữ trong ống nghiệm ở ngăn mát tủ lạnh (4 – 10OC) được cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường bột lông vũ, ủ ở 37oC trong hai ngày Sau đó cấy vào bình chứa 100 mL môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, nuôi tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở

37oC trong 48 giờ Rút 1 mL dịch nuôi cấy để đếm mật số vi khuẩn Mật số cần đạt khoảng 108 CFU/mL Trữ bình nuôi tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4oC

b xử lý cơ chất

Lông gia cầm (tỷ lệ lông gà – lông vịt 1:1), được rửa sạch bằng nước máy, phơi dưới ánh nắng mặt trời cho khô nước, sấy khô ở 80oC đến khi khối lượng không đổi Sau đó, chúng được nghiền thật mịn, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát cho đến khi

sử dụng Lông gia súc rửa sạch, sấy khô, loại bỏ da và các tạp chất còn lại, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5 mm

Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả

năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Mục đích: Xác định mức nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển và phân hủy bột

lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

- Cân chính xác 0,5 g bột lông gia cầm đã xử lý, sấy khô cho vào 60 bình tam giác

(dung tích 250 mL) chứa 50 mL môi trường lỏng Lần lượt điều chỉnh pH như bố trí thí nghiệm, mỗi mức pH có 3 bình

- Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 1 bình không chủng vi khuẩn để làm mẫu đối chứng

âm

- Đậy miệng bình bằng nút gòn và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút

- Chủng vào mỗi bình 1 mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước

(thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

- Ủ trên máy lắc (120 rpm) với các mức nhiệt độ như bố trí thí nghiệm

- Sau 7 ngày thu lượng bột lông còn lại, sấy 80°C sau 48 giờ (đến khi trọng lượng

không đổi), để vào bình hút ẩm, cân tính kết quả

 Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp

để dòng vi khuẩn B megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Mục đích: tìm nồng độ giống chủng vào thích hợp cho sự phát triển và phân hủy

lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố thí

nghiệm là nồng độ chủng với 3 mức độ (3%, 5%, 10%) của dung dịch vi khuẩn gốc chứa 108 tế bào/mL

- Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại

tế bào/mL

 Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nồng độ chủng vào thích

hợp để dòng vi khuẩn B megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Mục đích: tìm các nguồn carbon với mức độ thích hợp cho sự phát triển và phân

hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1.

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : hàm lượng carbon

và các nguồn carbon (glucose, sucrose và tinh bột) với các mức độ (1%, 2% và 3%)

bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba

bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng

 Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa

carbon thích hợp để dòng vi khuẩn B megaterium V 1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1

 Mục đích: tìm các nguồn nitơ với nồng độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy

lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1.

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : Hàm lượng nitơ và các nguồn nitơ (yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), NH4Cl) với các nồng độ (0.1%, 0.5% và 1%)

bổ sung vào các bình tam giác các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba

bình không bổ sung các nguồn nito được dùng làm mẫu đối chứng

 Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa

nitơ thích hợp để dòng vi khuẩn B megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất

3.2.6 Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với các mốc nhiệt độ ủ, pH, nồng

độ giống chủng vào, nguồn carbon, nồng độ carbon, nguồn nitơ, nồng độ nitơ bổ sung thích hợp được chọn từ các kết quả trên và nhân tố thí nghiệm là các mức độ thời gian khác nhau Thời gian theo dõi kéo dài khoảng 10 tuần và xác định kết quả ở tuần thứ

Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả

năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Mục đích: Xác định mức nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển và phân hủy bột

lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

để dòng vi khuẩn B megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất

3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Mục đích: tìm nồng độ giống chủng vào thích hợp cho sự phát triển và phân hủy

lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố thí

nghiệm là nổng độ chủng với 3 mức độ (3%, 5%, 10%) của dung dịch vi khuẩn gốc chứa 108 tế bào/mL

- Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại

- Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức

- Đơn vị thí nghiệm: 9

 Các bước thực hiện:

Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của 3.2.7 và nồng độ chủng với 3 mức độ 3%, 5%, 10% của dung dịch chủng gốc chứa 108

 Mục đích: tìm các nguồn carbon với mức độ thích hợp cho sự phát triển và phân

hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : hàm lượng carbon

và các nguồn carbon (glucose, sucrose và tinh bột) với các mức độ (1%, 2% và 3%)

từ kết quả của mục 3.2.8 Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn carbon được

dùng làm mẫu đối chứng

 Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa

carbon thích hợp để dòng vi khuẩn B megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất

3.2.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1

 Mục đích: tìm các nguồn nitơ với nồng độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy

lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : Hàm lượng nito và các nguồn nitơ (yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), NH4Cl) với các nồng độ (0.1%, 0.5% và 1%)

gian khác nhau Thời gian theo dõi kéo dài khoảng 10 tuần và xác định kết quả ở tuần thứ 10

chủng vi khuẩn B megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất

3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

a Xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy

 Mục đích: Xác định tỷ lệ bột lông gia cầm/gia súc bị phân hủy bởi vi khuẩn trong những điều kiện nuôi dưỡng khác nhau Tỷ lệ bột lông bị phân hủy thể hiện được khả năng phân hủy keratine của vi khuẩn ở từng điều kiện môi trường

 Các bước thực hiện:

- Cân khối lượng bột lông gia cầm/gia súc ban đầu cho vào từng bình tam giác có

chứa môi trường nuôi cấy vi khuẩn

- Giấy lọc được sấy khô ở 105ºC trong hai đến năm ngày và cân đến khi khối

lượng không đổi (G1)

- Sau quá trình nuôi cấy, dịch môi trường được lọc qua giấy lọc, thu lấy phần bột

lông chưa bị phân hủy Sau đó sấy khô ở 105ºC đến khi khối lượng không đổi (G2)

- Khối lượng bột lông còn lại sau khi phân hủy = G2 – G1= mC

- Phần trăm lông bị phân hủy được tính từ sự khác biệt khối lượng bột lông còn

lại sau khi ủ lắc với khối lượng bột lông cho vào ban đầu, giữa mẫu đối chứng (mẫu không chủng vi khuẩn phân hủy keratin) và những mẫu được chủng vi khuẩn phân hủy keratin Tỷ lệ phần trăm lông bị phân hủy bởi vi khuẩn được tính theo công thức sau (Park and Son, 2009):

A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐ

Trong đó: A (%) là tỉ lệ lông bị phân hủy bởi vi khuẩn

mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu

mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy

b Xác định mật số vi khuẩn (Hoben and Somaseragan, 1982)

 Mục đích: Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn

 Các bước thực hiện: Mật số vi khuẩn được xác định bằng cách đếm sống tổng số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri chứa môi trường dinh dưỡng agar

- Sau khi ủ lắc các nghiệm thức trong những điều kiện nuôi dưỡng khác nhau,

tiến hành xác định mật số vi khuẩn theo các bước sau:

- Pha loãng mẫu trước khi cho vào môi trường thạch agar

 Hút 100 µL dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong bình thủy tinh cho vào eppendorf chứa 900 µL nước cất cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-8

 Sau khi lắc đều bằng máy vortex, hút 5 µL huyền phù tế bào vi khuẩn ở

độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 cho vào đĩa môi trường agar đã chuẩn bị trước Dùng que đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn trãi đều mẫu trên bề mặt agar, để ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút cho khô mặt

 Ủ mẫu ở 30oC, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trường

 Số tế bào vi khuẩn trong 1 mL dịch nuôi cấy (CFU/mL) tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức

Trong đó: Di: độ pha loãng

Ci: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng Di Vi: thể tích dịch huyền phù vi sinh vật dùng để trải mẫu trên bề mặt agar

 Chú ý: Nếu độ pha loãng thấp, số lượng khuẩn lạc quá nhiều có thể cho kết quả không chính xác vì các khuẩn lạc có thể phát triển chồng lên nhau Còn nếu độ pha loãng quá cao không xuất hiện khuẩn lạc hoặc xuất hiện rất ít 1 – 2 khuẩn lạc, độ pha

CFU/mL  Ci × Di

Vi

loãng càng lớn, càng cho kết quả sai lệch lớn Mật số khuẩn lạc thích hợp để xác định mật số vi khuẩn trong khoảng 30 – 300 vi khuẩn

c Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp sorensen (Sorensen, 1907)

 Mục đích: Sinh vật tạo protein hòa tan khi phân hủy keratin Vì vậy khả năng phân hủy keratin của sinh vật có thể được đánh giá thông qua việc xác định protein hòa tan Hàm lượng protein hòa tan được xác định bằng phương pháp Sorensen

 Các bước thực hiện: Tiến hành thí nghiệm dùng pipet lấy chính xác 10 mL (dịch môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) cho vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch định mức

- Hút 5 mL dịch trong bình định mức vào bình tam giác, thêm vào 10 mL dung

dịch formol ½ bão hòa Lắc, để 2 phút Nhỏ vào 3 giọt phenolphthalein 3%

- Định phân bằng NaOH 0,01N cho đến khi dung dịch trong bình tam giác xuất

hiện màu hồng (không đổi màu sau khi lắc) Ghi nhận thể tích NaOH chuẩn độ

- Thực hiện thí nghiệm như trên với 3 mẫu thử thật và 3 mẫu thử không (thay dịch

môi trường sau nuôi cấy bằng nước cất)

- Hàm lượng đạm formol (Mf) trong 100 mL dịch môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn được tính theo công thức:

Trong đó:

ΔV: là hiệu số thể tích NaOH trung bình của lần thử thật và thử không

X: là hệ số hiệu chỉnh của dung dịch NaOH 0,01N

5: là thể tích dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau khi đã pha loãng sử dụng định lượng đạm formol (mL)

Với: Cp là nồng độ dung dịch pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch

d Xử lý số liệu

Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng phần mềm Minitab 16 và MS Excel 2007

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả

năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân

hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V 1

Bảng 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy

bột lông gia cầm và hàm lượng protein hòa tan của vi khuẩn Bacillus megaterium

V 1

Hàm lượng protein (x10 -3

Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của 3 lần lặp lại

Các giá trị mang chữ giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%

CV = 0,56%

Kết quả ở Bảng 3 cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn cũng như hàm lượng protein hòa tan của bột lông sau khi phân hủy, đồng thời thấy được mối liên hệ giữa mật số vi

khuẩn và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của chủng vi khuẩn B megaterium V 1 Khi nhiệt độ tăng từ 30oC lên 35oC, mật số vi khuẩn tăng, đồng thời khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng tăng dẫn đến hàm lượng protein hòa tan cũng tăng Khi nhiệt độ lên đến 40oC và 45oC thì mật số vi khuẩn giảm xuống và khả năng phân

hủy bột lông của vi khuẩn cũng giảm kéo theo hàm lượng protein hòa tan cũng giảm

Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn, khác biệt có ý nghĩa thống

kê giữa các mốc nhiệt độ khác nhau ở mức 5% Mật số vi khuẩn trung bình cao nhất tại nhiệt độ 35oC là 9,6×108 CFU/mL và thấp nhất ở nhiệt độ 45oC là 5,5×108CFU/mL, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại Khả năng phân hủy trung bình đạt giá trị cao nhất tại nhiệt độ 35oC là 29,79%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại, thấp nhất ở nhiệt

độ 45oC là 21,45%

Bên cạnh đó, pH môi trường cũng ảnh hưởng đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn Ở pH 4,0 mật số vi khuẩn trung bình có giá trị thấp nhất là 6×108 CFU/mL và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn ở mức pH này cũng thấp nhất là 16,71%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại Khi tăng pH lên tới 8,0, mật số vi khuẩn trung bình đạt giá trị cao nhất là 10,8×108 CFU/mL và khả năng phân hủy trung bình cũng đạt giá trị cao nhất là 33,8%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại Từ kết quả trên cho thấy mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn Khi mật số vi khuẩn tăng thì khả năng phân hủy bột lông cũng tăng theo và ngược lại Mặc dù khả năng phân hủy bột lông phụ thuộc nhiều vào

keratinase do vi khuẩn tiết ra nhưng tế bào vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy này Theo Gupta và Ramnani (2006), có thể chia sự phân hủy keratin thành hai quá trình là phá hủy các cầu nối disulfide và phân hủy protein, tế bào sống giữ vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ các enzyme ngoại bào phá hủy các cầu nối disulfide

Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% Mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột của vi khuẩn đạt giá trị cao nhất tại 35oC và pH 8,0 với lần lượt các giá trị là 12,8×108 CFU/mL và 45,15%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại Kết quả trên tương đồng với nghiên cứu của Ganesh Kumar et al (2007), nhiệt độ và pH

thích hợp cho sự phát triển và khả năng phân hủy keratin của dòng vi khuẩn B Licheniformis K-508 là 35oC và pH 8,0 Mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn thấp nhất tại 45oC và pH 4,0 với lần lượt các giá trị là 2,2×108

CFU/mL và 14,81% Từ kết quả thí nghiệm này cho thấy môi trường acid pH 4,0 ở các mức nhiệt độ sau 7 ngày ủ lắc làm ức chế sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn Nhiệt độ quá cao cũng làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

Cũng từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) cho thấy hàm lượng protein hòa tan cao nhất tại nhiệt độ 35oC 5,22×10-3 mg/mL và thấp nhất ở nhiệt độ 45OC là 2,14×10-3mg/mL Ở pH 4,0, hàm lượng protein hòa tan có giá trị thấp nhất là 2.38×10-3 mg/mL

và khi tăng lên pH 8,0 thì hàm lượng protein hòa tan có giá trị cao nhất là 3.70×10-3

mg/mL Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) còn cho thấy sự tương tác pH và nhiệt

độ ảnh hưởng đến hàm lượng protein hòa tan khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% Hàm lượng protein hòa tan đạt giá trị cao nhất tại 35oC và pH 8,0 là 7.11×10-3 mg/mL

và thấp nhất tại 45oC và pH 4,0 là 1.66 ×10-3 mg/mL

Tóm lại, kết quả thí nghiệm cho thấy rằng có sự tương tác giữa hai nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng như hàm lượng protein hòa tan Giá trị pH 8,0 và nhiệt độ 35oC là điều kiện thích hợp cho hoạt động phân hủy bột lông (keratin) và được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo