Các mẫu lông gia cầm, gia súc thu tại một số cơ sở giết mổ và chăn nuôi gà, vịt tại Cần Thơ.
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 1. Thành phần hóa chất môi trường bột lông lỏng
Hóa chất Nồng độ (g/l)
MgSO4.7H2O 0,1
KH2PO4 0,4
K2HPO4 0,3
NaCl 0,5
Bột lông (lông heo/lông gà) 10
Bảng 2. Thành phần hóa chất môi trường bột lông rắn
Hóa chất Khối lượng/lít nước cất
Bột lông gà 10g NaCl 0.5g K2HPO4 0.3g KH2PO4 0.4g MgSO4 0.1g agar 20g
(Dựa theo môi trường tăng sinh bột lông gia cầm của Matikevičienė et al., 2009)
3.1.4. Hóa chất
-Hoá chất dùng để nuôi cấy các dòng vi khuẩn: K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, glucose, sucrose, NH4Cl, yeast extract.
-Hóa chất điều chỉnh pH: NaOH 0,1N, HCl 0,1N.
3.1.5. Thiết bị - dụng cụ
- Tủ ủ (Herich, Đức).
- Tủ sấy (Ehret - Đức).
- pH kế (Eutech – Malaysia).
- Cân điện tử (Sartorius Teg101 – Đức).
- Tủ cấy (Telstar Bio-II-A, Tây Ban Nha).
- Bộ micropipette (NichipetEX – Nhật Bản).
- Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational – Ý).
- Kính hiển vi (Olympus U-CMAD3, Nhật Bản).
- Máy lắc mẫu (New Brunswich Scientific – Hoa Kỳ).
- Đĩa petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh.
- Một số dụng cụ khác như: ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, đầu cone (vàng, xanh, trắng), găng tay, khẩu trang y tế, đèn cồn, bình hút ẩm,...
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống và xử lý cơ chất. a. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống a. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống
Dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 ròng trữ trong ống nghiệm ở ngăn mát tủ lạnh (4 – 10OC) được cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường bột lông vũ, ủ ở 37oC trong hai ngày. Sau đó cấy vào bình chứa 100 mL môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, nuôi tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở 37oC trong 48 giờ. Rút 1 mL dịch nuôi cấy để đếm mật số vi khuẩn. Mật số cần đạt khoảng 108 CFU/mL. Trữ bình nuôi tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. xử lý cơ chất
Lông gia cầm (tỷ lệ lông gà – lông vịt 1:1), được rửa sạch bằng nước máy, phơi dưới ánh nắng mặt trời cho khô nước, sấy khô ở 80oC đến khi khối lượng không đổi. Sau đó, chúng được nghiền thật mịn, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát cho đến khi sử dụng. Lông gia súc rửa sạch, sấy khô, loại bỏ da và các tạp chất còn lại, sau đó cắt nhuyễn khoảng 1,5 mm.
Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: Xác định mức nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển và phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: pH (5 mức độ: 4, 5, 6, 7, 8), nhiệt độ (4 mức độ: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC).
- Số lần lặp lại: 3 lần.
- Tổng số nghiệm thức: 20 nghiệm thức
- Số đơn vị thí nghiệm: 60
- Cân chính xác 0,5 g bột lông gia cầm đã xử lý, sấy khô cho vào 60 bình tam giác (dung tích 250 mL) chứa 50 mL môi trường lỏng. Lần lượt điều chỉnh pH như bố trí thí nghiệm, mỗi mức pH có 3 bình.
- Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 1 bình không chủng vi khuẩn để làm mẫu đối chứng âm.
- Đậy miệng bình bằng nút gòn và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
- Chủng vào mỗi bình 1 mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
- Ủ trên máy lắc (120 rpm) với các mức nhiệt độ như bố trí thí nghiệm.
- Sau 7 ngày thu lượng bột lông còn lại, sấy 80°C sau 48 giờ (đến khi trọng lượng không đổi), để vào bình hút ẩm, cân tính kết quả.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất.
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm nồng độ giống chủng vào thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố thí nghiệm là nồng độ chủng với 3 mức độ (3%, 5%, 10%) của dung dịch vi khuẩn gốc chứa 108 tế bào/mL.
- Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại
- Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
- Đơn vị thí nghiệm: 9
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của 3.2.2 và nồng độ chủng với 3 mức độ 3%, 5%, 10% của dung dịch chủng gốc chứa 108 tế bào/mL.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nồng độ chủng vào thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất.
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩnBacillus megaterium V1 khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩnBacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn carbon với mức độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : hàm lượng carbon và các nguồn carbon (glucose, sucrose và tinh bột) với các mức độ (1%, 2% và 3%)
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.2 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.3. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa carbon thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn nitơ với nồng độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : Hàm lượng nitơ và các nguồn nitơ (yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), NH4Cl) với các nồng độ (0.1%, 0.5% và 1%).
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Số đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.2 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.3. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn nito được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa nitơ thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.6. Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với các mốc nhiệt độ ủ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nồng độ carbon, nguồn nitơ, nồng độ nitơ bổ sung thích hợp được chọn từ các kết quả trên và nhân tố thí nghiệm là các mức độ thời gian khác nhau. Thời gian theo dõi kéo dài khoảng 10 tuần và xác định kết quả ở tuần thứ 10.
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 1 nghiệm thức (1 chủng vi khuẩn)
- Số đơn vị thí nghiệm: 3
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm thời gian thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất.
Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: Xác định mức nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển và phân hủy bột lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: pH (5 mức độ: 4, 5, 6, 7, 8), nhiệt độ (4 mức độ: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC).
- Số lần lặp lại: 3 lần.
- Tổng số nghiệm thức: 20 nghiệm thức (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Số đơn vị thí nghiệm: 60
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy chỉ thay cơ chất thành lông heo.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất.
3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm nồng độ giống chủng vào thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 .
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố thí nghiệm là nổng độ chủng với 3 mức độ (3%, 5%, 10%) của dung dịch vi khuẩn gốc chứa 108 tế bào/mL.
- Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại
- Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của 3.2.7 và nồng độ chủng với 3 mức độ 3%, 5%, 10% của dung dịch chủng gốc chứa 108 tế bào/mL.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nồng độ giống chủng vào thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất.
3.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn carbon với mức độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : hàm lượng carbon và các nguồn carbon (glucose, sucrose và tinh bột) với các mức độ (1%, 2% và 3%)
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, chỉ thay cơ chất thành lông heo, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.7 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.8. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa
carbon thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn nitơ với nồng độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 .
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : Hàm lượng nito và các nguồn nitơ (yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), NH4Cl) với các nồng độ (0.1%, 0.5% và 1%).
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Số đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, chỉ thay cơ chất thành lông heo, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.7 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.8. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn nitơ được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa nitơ thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.11. Khảo sát sự phân hủy sợi lông gia súc theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự thí nghiệm 3.2.2 với các mốc nhiệt độ ủ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nồng độ carbon, nguồn nitơ, nồng độ nitơ bổ sung thích hợp được chọn từ các kết quả trên và nhân tố thí nghiệm là các mức độ thời
gian khác nhau. Thời gian theo dõi kéo dài khoảng 10 tuần và xác định kết quả ở tuần thứ 10.
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 1 nghiệm thức (1 chủng vi khuẩn)
- Số đơn vị thí nghiệm: 3
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm thời gian thích hợp để chủng vi khuẩn B. megaterium V1. có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất.
3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
a. Xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy
Mục đích: Xác định tỷ lệ bột lông gia cầm/gia súc bị phân hủy bởi vi khuẩn trong những điều kiện nuôi dưỡng khác nhau. Tỷ lệ bột lông bị phân hủy thể hiện được khả năng phân hủy keratine của vi khuẩn ở từng điều kiện môi trường.