b. xử lý cơ chất
3.2.5.Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển
Mục đích: tìm các nguồn carbon với mức độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : hàm lượng carbon và các nguồn carbon (glucose, sucrose và tinh bột) với các mức độ (1%, 2% và 3%)
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.2 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.3. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa carbon thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn nitơ với nồng độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : Hàm lượng nitơ và các nguồn nitơ (yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), NH4Cl) với các nồng độ (0.1%, 0.5% và 1%).
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Số đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.2 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.3. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn nito được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa nitơ thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.6. Khảo sát sự phân hủy lông gia cầm nguyên theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với các mốc nhiệt độ ủ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nồng độ carbon, nguồn nitơ, nồng độ nitơ bổ sung thích hợp được chọn từ các kết quả trên và nhân tố thí nghiệm là các mức độ thời gian khác nhau. Thời gian theo dõi kéo dài khoảng 10 tuần và xác định kết quả ở tuần thứ 10.
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 1 nghiệm thức (1 chủng vi khuẩn)
- Số đơn vị thí nghiệm: 3
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm thời gian thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất.
Phần B: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: Xác định mức nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển và phân hủy bột lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: pH (5 mức độ: 4, 5, 6, 7, 8), nhiệt độ (4 mức độ: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC).
- Số lần lặp lại: 3 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tổng số nghiệm thức: 20 nghiệm thức
- Số đơn vị thí nghiệm: 60
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy chỉ thay cơ chất thành lông heo.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất.
3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chủng vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 phân hủy lông gia súc của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm nồng độ giống chủng vào thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 .
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố thí nghiệm là nổng độ chủng với 3 mức độ (3%, 5%, 10%) của dung dịch vi khuẩn gốc chứa 108 tế bào/mL.
- Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại
- Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của 3.2.7 và nồng độ chủng với 3 mức độ 3%, 5%, 10% của dung dịch chủng gốc chứa 108 tế bào/mL.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nồng độ giống chủng vào thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất.
3.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn carbon với mức độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : hàm lượng carbon và các nguồn carbon (glucose, sucrose và tinh bột) với các mức độ (1%, 2% và 3%)
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, chỉ thay cơ chất thành lông heo, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.7 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.8. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa
carbon thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Mục đích: tìm các nguồn nitơ với nồng độ thích hợp cho sự phát triển và phân hủy lông gia súc của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 .
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố : Hàm lượng nito và các nguồn nitơ (yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), NH4Cl) với các nồng độ (0.1%, 0.5% và 1%).
- Số lần lặp lại: 3 lần (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
- Số đơn vị thí nghiệm: 27
Các bước thực hiện:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự mục 3.2.2 với cùng công thức môi trường nuôi cấy, chỉ thay cơ chất thành lông heo, pH và nhiệt độ ủ được điều chỉnh ở mức thích hợp được chọn từ kết quả của mục 3.2.7 và nồng độ giống chủng vào được chọn từ kết quả của mục 3.2.8. Lần lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm, ba bình không bổ sung các nguồn nitơ được dùng làm mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm ra nguồn dinh dưỡng chứa nitơ thích hợp để dòng vi khuẩn B. megaterium V1 có khả năng phân hủy lông mạnh nhất.
3.2.11. Khảo sát sự phân hủy sợi lông gia súc theo thời gian của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được thực hiện tượng tự thí nghiệm 3.2.2 với các mốc nhiệt độ ủ, pH, nồng độ giống chủng vào, nguồn carbon, nồng độ carbon, nguồn nitơ, nồng độ nitơ bổ sung thích hợp được chọn từ các kết quả trên và nhân tố thí nghiệm là các mức độ thời
gian khác nhau. Thời gian theo dõi kéo dài khoảng 10 tuần và xác định kết quả ở tuần thứ 10.
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 1 nghiệm thức (1 chủng vi khuẩn)
- Số đơn vị thí nghiệm: 3
Chỉ tiêu theo dõi: sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông, hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Sorensen) để tìm thời gian thích hợp để chủng vi khuẩn B. megaterium V1. có khả năng phân hủy lông gia súc mạnh nhất.
3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
a. Xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy
Mục đích: Xác định tỷ lệ bột lông gia cầm/gia súc bị phân hủy bởi vi khuẩn trong những điều kiện nuôi dưỡng khác nhau. Tỷ lệ bột lông bị phân hủy thể hiện được khả năng phân hủy keratine của vi khuẩn ở từng điều kiện môi trường.
Các bước thực hiện:
- Cân khối lượng bột lông gia cầm/gia súc ban đầu cho vào từng bình tam giác có chứa môi trường nuôi cấy vi khuẩn.
- Giấy lọc được sấy khô ở 105ºC trong hai đến năm ngày và cân đến khi khối lượng không đổi (G1).
- Sau quá trình nuôi cấy, dịch môi trường được lọc qua giấy lọc, thu lấy phần bột lông chưa bị phân hủy. Sau đó sấy khô ở 105ºC đến khi khối lượng không đổi (G2).
- Khối lượng bột lông còn lại sau khi phân hủy = G2 – G1= mC
- Phần trăm lông bị phân hủy được tính từ sự khác biệt khối lượng bột lông còn lại sau khi ủ lắc với khối lượng bột lông cho vào ban đầu, giữa mẫu đối chứng (mẫu không chủng vi khuẩn phân hủy keratin) và những mẫu được chủng vi khuẩn phân hủy keratin. Tỷ lệ phần trăm lông bị phân hủy bởi vi khuẩn được tính theo công thức sau (Park and Son, 2009):
A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐ
mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu
mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy
b. Xác định mật số vi khuẩn (Hoben and Somaseragan, 1982)
Mục đích: Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn.
Các bước thực hiện: Mật số vi khuẩn được xác định bằng cách đếm sống tổng số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri chứa môi trường dinh dưỡng agar.
-Sau khi ủ lắc các nghiệm thức trong những điều kiện nuôi dưỡng khác nhau, tiến hành xác định mật số vi khuẩn theo các bước sau:
-Pha loãng mẫu trước khi cho vào môi trường thạch agar. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hút 100 µL dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong bình thủy tinh cho vào eppendorf chứa 900 µL nước cất cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-8.
Sau khi lắc đều bằng máy vortex, hút 5 µL huyền phù tế bào vi khuẩn ở độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 cho vào đĩa môi trường agar đã chuẩn bị trước. Dùng que đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn trãi đều mẫu trên bề mặt agar, để ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút cho khô mặt.
Ủ mẫu ở 30oC, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trường.
Số tế bào vi khuẩn trong 1 mL dịch nuôi cấy (CFU/mL) tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức
Trong đó: Di: độ pha loãng
Ci: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng Di
Vi: thể tích dịch huyền phù vi sinh vật dùng để trải mẫu trên bề mặt agar.
Chú ý: Nếu độ pha loãng thấp, số lượng khuẩn lạc quá nhiều có thể cho kết quả không chính xác vì các khuẩn lạc có thể phát triển chồng lên nhau. Còn nếu độ pha loãng quá cao không xuất hiện khuẩn lạc hoặc xuất hiện rất ít 1 – 2 khuẩn lạc, độ pha
CFU/mL Ci × Di Vi
loãng càng lớn, càng cho kết quả sai lệch lớn. Mật số khuẩn lạc thích hợp để xác định mật số vi khuẩn trong khoảng 30 – 300 vi khuẩn.
c. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp sorensen (Sorensen, 1907)
Mục đích: Sinh vật tạo protein hòa tan khi phân hủy keratin. Vì vậy khả năng phân hủy keratin của sinh vật có thể được đánh giá thông qua việc xác định protein hòa tan. Hàm lượng protein hòa tan được xác định bằng phương pháp Sorensen.
Các bước thực hiện: Tiến hành thí nghiệm dùng pipet lấy chính xác 10 mL (dịch môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) cho vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch định mức.
- Hút 5 mL dịch trong bình định mức vào bình tam giác, thêm vào 10 mL dung dịch formol ½ bão hòa. Lắc, để 2 phút. Nhỏ vào 3 giọt phenolphthalein 3%.
- Định phân bằng NaOH 0,01N cho đến khi dung dịch trong bình tam giác xuất hiện màu hồng (không đổi màu sau khi lắc). Ghi nhận thể tích NaOH chuẩn độ.
- Thực hiện thí nghiệm như trên với 3 mẫu thử thật và 3 mẫu thử không (thay dịch môi trường sau nuôi cấy bằng nước cất)
- Hàm lượng đạm formol (Mf) trong 100 mL dịch môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn được tính theo công thức:
Trong đó:
ΔV: là hiệu số thể tích NaOH trung bình của lần thử thật và thử không X: là hệ số hiệu chỉnh của dung dịch NaOH 0,01N
5: là thể tích dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau khi đã pha loãng sử dụng định lượng đạm formol (mL)
F: là hệ số pha loãng (10 lần) Cách tính hệ số hiệu chỉnh dung dịch
Các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản nên mỗi lần sử dụng cần xác định lại hệ số hiệu chỉnh x
Ta có: x = Cp/Ct = Vp/Vt
14 × ΔV × x ×10-5 × 100 ×F 5
Với: Cp là nồng độ dung dịch pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch.
d. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng phần mềm Minitab 16 và MS Excel 2007.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phần A: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1
Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng phân hủy bột lông gia cầm và hàm lượng protein hòa tan của vi khuẩn Bacillus megaterium V1.
Nhiệt độ pH Mật số (CFU/mL) Phân hủy (%)
Hàm lượng protein (x10-3 mg/mL) 30°C 4 7.3×108d 17.45 ghi 2.041 fg 30°C 5 7.9×108cd 18.25 fghi 2.97 de 30°C 6 8.8×108cd 21,92 defghi