khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn bacillus megaterium vl2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN S

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM

CỦA VI KHUẨN Bacillus megaterium VL2

MSSV: 3102863 LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 5/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM

CỦA VI KHUẨN Bacillus megaterium VL2

MSSV: 3102863 LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 5/2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Vện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập suốt bốn năm qua

Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp này

Xin gửi lời chân thành cảm ơn đến các Thầy cô, cán bộ của Viện và các anh chị cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Phòng thí nghiệm Hóa sinh Thực phẩm - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ

đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài này

Xin cảm ơn ba mẹ, anh chị và các bạn lớp công nghệ sinh học khóa 36, đã động viên, khuyến khích, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ, ngày 4 tháng 5 năm 2014

Trần Hồng Thảo

Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

TÓM LƢỢC

Lông gia cầm là phế phẩm được sinh ra từ hoạt động chăn nuôi và giết mổ Là một chất thải khó phân hủy bởi thành phần chính là keratin, lông gia cầm có ảnh hưởng xấu tới môi trường Sử dụng vi sinh vật để phân hủy keratin có trong lông gia cầm là một hướng đi mới, không những giải quyết được vấn đề môi trường mà còn sử dụng sản phẩm tạo thành để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Kết quả nghiên cứu “ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium VL2” cho Bacillus megaterium VL2 có khả năng phân hủy tốt bột lông ở những điều kiện môi trường phù hợp Thời gian nuôi cấy tối

ưu của dòng vi khuẩn này là 3 ngày Tại mức nhiệt 50 o C và pH 9 vi khuẩn có khả năng phân hủy bột lông cao nhất so với các mức còn lại Vi khuẩn phát triển tốt khi môi trường nuôi chứa rỉ đường, bột đậu nành, nhưng khả năng phân hủy lông lại không cao Khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác như sucrose, NH 4 Cl, Yeast extract vào môi trường nuôi cấy thì đều làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn so với việc môi trường chỉ chứa nguồn dinh dưỡng duy nhất là bột lông

Từ khóa: Bacillus megaterium, keratin, lông gia cầm

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về chất thải lông vũ 2

2.2 Keratine 4

2.3 Enzyme keratinase 5

2.4 Vi sinh vật phân giải keratin 6

2.4.1 Sơ lược vi sinh vật phân giải keratin 6

2.4.2 Vi khuẩn Bacillus megaterium 7

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của vi sinh vật 8

2.5.1 Các yếu tố vật lý 8

2.5.2 Thành phần môi trường nuôi cấy 9

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 11

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 11

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

3.2 Phương tiện nghiên cứu 14

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 14

3.2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân hủy keratin 14

3.2.3 Hóa chất 16

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn 16

3.3.2 Chuẩn bị lông gia cầm 16

3.3.3 Thí nghiệm 1 Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 17

3.3.4 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 17

3.3.5 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 18

3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 19

3.3.7 Phương pháp xác định tỉ lệ bột lông bị phân huỷ 20

3.3.8 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn 20

3.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 22

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 23

4.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 27

4.4 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn 29

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 1

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần acid amin có trong lông vũ………4

Bảng 2: Thành phần môi trường tăng sinh khối………15

Bảng 3: Thành phần môi trường lỏng……… 16

Bảng 4: Thành phần môi trường đặc……….16

Bảng 5: Mật số và % bột lông bị phân hủy của vi khuẩn theo các mức pH và nhiệt độ khác nhau .25

Bảng 6: Kết quả thí nghiệm 1 ……… 40

Bảng 7: Kết quả thí nghiệm 2 ……… 41

Bảng 8: Kết quả thí nghiệm 3 ……… 42

Bảng 9: Kết quả thí nghiệm 4………42

TỪ VIẾT TẮT

BSM Basal salt medium

CFU colony-forming unit

EDTA Ethylene Diamin Tetra Aceticacid

PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride

PTN Phòng thí nghiệm

rpm Rotation per minute

rRNA Ribosomal ribonucleotide acid

w/v Weight/volum

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi là một trong những ngành sản xuất chủ đạo của nước ta Việc phát triển chăn nuôi không những đảm bảo được vấn đề thực phẩm mà còn mang lại cho người dân một cuộc sống tốt hơn Tuy nhiên, đi cùng với sự phát triển thì chăn nuôi cũng mang đến một vấn đề rất đáng quan tâm đó là môi trường vì lượng chất thải hằng năm của ngành này rất lớn Trong các loại chất thải từ ngành chăn nuôi thì chất thải lông gia súc – gia cầm khó xử lý nhất vì thành phần của chất thải loại này chủ yếu là keratin, một loại protein cần rất nhiều thời gian để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên Ngày nay, thay vì đốt, chôn lấp hay thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường gây ra những ảnh hưởng tiêu cực như trước đây thì trong công nghiệp người ta đã xử lý phần lớn lông thải ra ở nhiệt độ và áp suất cao để sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá

và do quá trình xử lý nhiệt độ và áp suất phá huỷ một số axit amin (như cysteine) làm mất cân bằng các axit amin thiết yếu Vì vậy, việc tìm ra một biện pháp vừa có thể xử

lý được môi trường, vừa có thể tận dụng được nguồn chất thải này để thay thế những protein đắt tiền trong sản xuất thức ăn chăn nuôi là một mục tiêu khả thi và vi sinh vật chính là chìa khóa cho những nghiên cứu này Nhiều dòng vi khuẩn phân hủy keratin

đã được phân lập, trong đó dòng vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus megaterium VL2 được

tuyển chọn trong 12 dòng vi khuẩn đã phân lập từ các mẫu chất thải ở lò giết mổ gia cầm thuộc huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long Sự phát triển và khả năng phân hủy cơ chất của chúng chịu ảnh hưởng của các yếu tố có trong môi trường Do đó, đề tài “ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm

của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được các yếu tố nhiệt độ, pH, nguồn nitơ, carbon phù hợp cho sự phát

triển và khả năng phân hủy bột lông của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về chất thải lông vũ

Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông vũ, trong đó chủ yếu là β-keratin Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông vũ được thải ra từ ngành chăn nuôi

và chế biến gia cầm, gây ra vấn đề môi trường đồng thời làm lãng phí nguồn protein (Gousterova et al., 2005) Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh khiết đồng thời được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông vũ là nguồn nguyên liệu thay thế tiềm năng cho các thành phần dinh dưỡng đắt tiền trong thức ăn gia súc Tuy nhiên, việc sản xuất lông vũ làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế Không những tiêu tốn nhiều năng lượng và không thân thiện với môi trường, quy trình sản xuất này phá hủy một số acid amin, làm cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn

về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons, 1997)

Bảng 1 Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ

Protein và các acid amin Hàm lượng (g/kg)

Protein Alanine Glycine Isoleucine Leucine Valine Phenyalanine Arginine Histidine Lysine Aspartic acid Glutamic acid Serine Thereonine Proline Cystine Methionine

922,0 28,8 51,8 39,4 56,9 53,0 34,6 67,6 2,3 15,4 41,8 82,2 87,3 34,5 73,9 65,8 7,1

(Latshaw et al, 1994)

2.2 Keratine

Keratin là một loại protein dạng sợi, có khả năng hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xương sống Là thành phần chính cấu tạo nên: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin được phân thành hai dạng α-helix của tóc, len và β-sheets của lông vũ (Akhtar và Edwards, 1997) Các sợi keratin

ở cả hai dạng α-helix và β-sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al., 2004) Ngoài ra keratin cũng được nhóm lại thành 2 loại: keratin cứng (keratin (lông, tóc, móng và móng tay) và mềm (da và mô sẹo) theo hàm lượng lưu huỳnh Một trong những đặc điểm chính của keratin là có sự ổn định cơ học cao và khả năng chống proteolytic suy thoái, mà phụ thuộc vào các liên kết disunphua

và hydro, các liên kết muối và các liên kết khác Do đó, sừng vật chất không tan trong nước và cực kỳ khả năng chống suy thoái của các enzym thủy phân protein phổ biến như trypsin, papain và pepsin

ngày : 28/12/13

Xét về cấu trúc không gian, đặc tính làm keratine trở nên rắn chắc phụ thuộc vào sự tập hợp các cấu trúc siêu phân tử (thành phần và trình tự các amino acid của những mạch polypeptide thành phần) Sự phối hợp của các cấu trúc α – helix, β- sheet

và cầu nối disulfide sẽ quyết định cấu tạo protein chức năng, một vài trong số đó là điều khiển tính không hoà tan

α- keratine: Là keratine có trong tóc người, sừng, móng, guốc của động vật có vú

có cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng liên kết hydro

β- keratine: Là keratine có nhiều trong móng tay, và móng vuốt của các loài bò sát…có trong lông, mỏ, móng vuốt của các loài chim, nhím Được hình thành chủ yếu nhờ các phiến β cứng chắc do các phiến này được nối bằng các cầu nối disulfide Xét về liên kết hóa học, ngoài những liên kết hydro trong phân tử và giữa các phân tử, keratin còn có một lượng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, được liên kết với nhau bởi những cầu nối disulfide Nối disulfide nhiều tạo nên tính không hòa tan của keratin, ngoại trừ các tác nhân phân hủy hay tác nhân khử như urea có thể hòa tan keratin Keratin của lông có ít cầu nối disulfide hơn keratin ở móng hay guốc của động vật có vú Do đó, móng, guốc cứng hơn so với lông Trong trường hợp cấu hình ß-sheet, keratin được liên kết bởi những liên kết hydrogen tự do trong không gian giữa nhóm amino và nhóm carboxyl của những chuỗi peptide, tạo ra những liên kết dày đặc

và chắc chắn Phân tử keratin dạng sợi có thể bện xung quanh nhau tạo thành dạng sợi trung gian xoắn

2.3 Enzyme keratinase

Keratinase là loại enzyme có khả phân hủy cơ chất chứa keratine có trong tự nhiên và được phân loại là protease với mã số là EC 3.4.21/24/99.11 ( Rani Gupta, Priya Rammani) Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (-S-S-) của cơ chất khi tiến hành phân hủy chúng (Bokle et al., 1995) Enzyme này có nhiều đặc trưng bề mặt như chúng có thể phân giải protein có sợ như fibrin, elastin, collagen và các protein không có sợ như casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin… (Noval và Nickerson, 1959; Mukhapadhaya và Chandra, 1990; Dozie et al, 1994; Lin et al, 1995; Letourneau et al, 1998 và Bressollier et al., 1999)

Keratine từ vi sinh vật có pH nằm trong khoảng từ trung tính đến kiềm (6,0-9,0),

và nhiệt độ tối ưu từ khoảng 30 - 80, có khi đạt tới 100 như chủng vi khuẩn

Fervidobacterium islandium AW-1(Nam et al., 2002) Keratinase được kích thích

trong môi trường có chứa nhiều ion như Ca2+ , Mg2+ và Mn2+ và bị ức chế bởi Cu2+,

Zn2+, Ag2+, Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), EDTA,…

Keratinase có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc xử lý chất thải trong ngành công nghiệp chế biến gia cầm và thuộc da Chúng được sử dụng trong sản xuất chất

tẩy rửa, dược phẩm, đồ thuộc da, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, đặc biệt là gần đây trong các lĩnh vực mới như phân hủy prion để điều trị căn bệnh bò điên Keratinase được sản xuất bởi chủ yếu là một số loài vi sinh vật bao gồm

vi khuẩn, nấm hoại sinh và ký sinh, actinomycetes

2.4 Vi sinh vật phân giải keratin

2.4.1 Sơ lƣợc vi sinh vật phân giải keratin

Lần đầu tiên Molyneux đã phân lập một số vi khuẩn có khả năng phân giải keratin vào năm 1959 Ông phân lập những vi sinh vật này trong u nang trên thân cừu

và đã tìm thấy sự phân hủy của sợi lông cả trong cơ thể và ống nghiệm Các vi sinh vật

thuộc chi Bacillus có khả năng tấn công các protein lông cừu tự nhiên đã được ông chỉ

ra trong thí nghiệm này Cũng trong năm 1959, Noval và Nickerson đã xuất bản một

bài viết về sự phân hủy enzyme của keratin tự nhiên bởi Streptomyces fradiae Họ cho

thấy enzyme ngoại bào được tiết ra bởi vi khuẩn này có khả năng phân hủy tóc người

ở trạng thái tự nhiên của nó

Những dòng vi khuẩn sản sinh ra keratinase phân giải β-keratin được tìm thấy

trong lông gia cầm Các dòng này chủ yếu thuộc chi Streptomyces và Bacillus Trong

đó các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được tìm thấy

là các vi khuẩn Gram dương Arthrobacter sp (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) Hầu hết các dòng vi khuẩn

này có thể phân hủy lông gia cầm trong vòng 48 giờ Những enzyme keratinase giúp cho vi khuẩn dự trữ carbon, lưu huỳnh và năng lượng nhằm duy trì sự sinh sản và phát triển từ việc phân hủy β-keratin

Hoạt tính keratinase giúp phân giải keratin trong nước còn được biểu hiện ở một

số loài vi khuẩn chịu nhiệt như Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandcum (Nam et al., 2002) và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như Nesternkonia sp AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp TOA-1 (Shinju Mitsuiki et al., 2004) Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và

Microbispora aerata IMBAS-11A, được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho

thấy khả năng tạo keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu (Gousterova et al., 2005)

Khả năng thủy phân keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến

việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như pronase, đã được

sản xuất thương mại từ vi khuẩn S.griseus (Jurasek et al., 1974) Bên cạnh đó

S.pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông vũ

(Bokle và Muller, 1997), cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide reductase để phục vụ sự thủy phân keratin

Vi khuẩn có khả năng phân giải keratin được nghiên cứu nhiều nhất trên các loại

Bacillus spp., được mô tả có khả năng phân hủy lông gia cầm (Kim et al., 2001; Lin et

al., 1999) Một số dòng B.licheniformis và B.subtilis cùng một số loài khác như

B.pumilus và B.cereus đều có khả năng tạo ra keratinase (Brandelli, 2007) Gene kerA

của Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự(Linetal.,1995)

Ngoài Streptomyces và Bacillus còn một số loại vi sinh vật khác như

Lysobacter, Nesternokia, Kocurica, Microbacterium, Stenotrophomonas, Chysosporium, Aspergillus, Trichurus, Curvularia,

2.4.2 Vi khuẩn Bacillus megaterium

Bacillus megaterium là một vi khuẩn hình que, Gram dương, có bào tử Đây

được coi như là một vi khuẩn hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển được trong môi trường kị khí khi cần thiết, là một trong những loại vi khuẩn lớn nhất được tìm thấy

trong đất cát nên gọi là “ mega” B megaterium thường được tìm thấy ở dạng chuỗi

trong đó các vi khuẩn liên kết với nhau thông qua các phân tử polysacharides trên thành tế bào để tổng hợp thành lớp vỏ mỏng ở bên ngoài được cấu tạo phối hợp bởi polypeptide và polysachride Tiếp theo có rất nhiều lớp peptidoglycan tạo thành các lớp vách cho vi khuẩn và một lớp protein ở bề mặt ngoài của màng bào tương

Bacillus megaterium có khả năng chống chịu tốt với môi trường tự nhiên Bào tử

của chúng đã được chứng minh là dạng bền vững nhất của các dạng tế bào đã được tìm thấy trong tự nhiên Bào tử của chúng có khả năng đề kháng cao với tia cực tím và chúng có thể chống chịu được khí hậu khắc nghiệt như sa mạc Là một loài có khả năng tạo bào tử 100% cũng như có khả năng chuyển dạng bào tử sang dạng dinh dưỡng với cùng tỉ lệ Chu trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân hủy, giáng hóa chất hữu cơ để trở thành các hợp chất đơn giản hơn được thực hiện bởi

các loài sinh vật trong đó có B.megaterium Các loài sử dụng dinh dưỡng từ các vật

liệu hữu cơ đã chết hay hoại sinh để duy trì năng lượng cho sự phát triển và tự chuyển sang dạng bảo tử khi chất dinh dưỡng cạn kiệt Điều này cho thấy một chiến lược sinh tồn được sử dụng bởi nhiều loại vi sinh vật Các nhóm vi sinh vật đó sống trong đất và tạo ra kháng sinh quần hợp với quy trình tạo bào tử của chúng Vì có rất nhiều loại vi sinh vật tạo bào tử có thể có hiệu quả làm giáng hóa nhiều hợp chất polyme sinh học như protein, tinh bột, pectin chúng có vai trò đác kể trong chu trình sinh học của

carbon và nitrogen Chính nhờ đặc tính này mà hiện nay B.megaterium là một trong

những loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến trong lĩnh vực môi trường Tuy được coi

là vi khuẩn không gây bệnh nhưng chúng đóng vai trò lớn trong việc gây nhiễm các môi trường vô khuẩn thông qua việc tiếp xúc trực tiếp hay các hạt bụi và chúng có thể

là tác nhân gây nên phân hủy, thối rữa Trong công nghệ sinh học, nhờ kích thước lớn

của vi khuẩn đã cho phép sử dụng B megaterium trong nghiên cứu về protein cũng

như các nghiên cứu về màng tế bào thành công Chủng đơn được sử dụng cho nhiều nghiên cứu trên lĩnh vực sinh lý bào từ và cấu trúc màng tế bào, một số các ứng dụng của nó trong xử lý môi trường và công nghiệp như sản xuất enzyme, vitamin, và rất

nhiều ứng dụng khác kể cả công nghệ gen và DNA tái tổ hợp

và sự phân hủy lông vũ ở hầu hết các vi khuẩn giá trị pH kiềm được cho là kích thích

sự phân hủy keratin do làm biến đổi các cysyine thành lathionine khiến cho keratinase

dễ dàng tiếp cận cơ chất Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng

từ 30-500C ở hầu hết các vi khuẩn Năm 2006 Geun-Tae Park et al phát hiện vi khuẩn

Bacillus megaterium F7-1 phát triển tối ưu cũng như hoạt tính keratinase cao nhất ở

nhiệt độ 25-400C và pH 7,0 – 11,0 Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi

khuẩn thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là

300C, và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực

đại (Sangali et al., 1999) Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp kr6 phát triển tối ưu ở

nhiệt độ 300

C và pH 8,0 và hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt

độ này (Riffel et al., 2002) Ngoài những thông số vật lý thì trong hầu hết các trường hợp, keratin đóng vai trò như chất cảm ứng cho hoạt động phân giải keratin; bên cạnh

đó, bột đậu nành cũng được biết đến như là chất cảm ứng cho sự sinh enzyme (Cheng

et al., 1995; Gradisar et al., 2000) Điều này cho thấy rằng hoạt tính phân giải keratin

có thể được cảm ứng bởi nhiều tác nhân

2.5.2 Thành phần môi trường nuôi cấy

Nguồn nitơ

Vi sinh vật có khả năng hấp thụ nhiều nguồn dinh dưỡng nitơ khác nhau Tùy theo đặc điểm dinh dưỡng của từng loài mà nó đòi hỏi các dạng nitơ khác nhau Dạng nitơ vô cơ như NH3, NH4+, NO3- là các nguồn dinh dưỡng đối với nhóm vi sinh vật tự dưỡng amin Chúng có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ ở dạng các hợp chất vô cơ như trên, từ đó tổng hợp nên các acid amin của cơ thể Trong các hợp chất đó, dễ hấp thụ nhất đối với vi khuẩn là NH3, NH4+ , các dạng hợp chất này dễ dàng thâm nhập vào

tế bào và tạo nên các nhóm amin (Nguyễn Như Thanh, 1990) Dạng nitơ hữu cơ như protein, polypeptit, acid amin là nguồn dinh dưỡng đối với nhóm vi sinh vật dị dưỡng amin, chúng không có khả năng tự tổng hợp các acid amin của tế bào từ các hợp chất nitơ vô cơ Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp phân tử protein mà phải phân hủy chúng thành các polypeptit nhờ men protease Thường chỉ những polypeptit không quá 5 acid amin mới được vi sinh vật hấp thụ Có những loài vi sinh vật đòi hỏi phải có sẳn những acid amin nhất định trong môi trường nuôi cấy, các acid amin cần thiết đó khác nhau tùy theo loài vi sinh vật Các dạng nitơ hữu cơ không những là nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi sinh vật Ngoài ra, nguồn dinh dưỡng khoáng và các chất sinh trưởng cũng rất cần thiết đối với vi sinh vật (Trần Cẩm Vân, 2001)

Nguồn cacbon

Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3, CaCO3 .) hoặc chất hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố : một là thành phần hoá học

và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật Trên thế giới hầu như không có hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không bị hoặc

nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải Không ít vi sinh vật có thể đồng hóa được cả các hợp chất cacbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ,

parafin, khí thiên nhiên

Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thuỷ phân (amilaza, xenlulaza, pectinaza, lipaza, ) để chuyển hoá chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, axit amin, axit béo, )

Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng Cần chú ý rằng đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất có màu tối gọi là đường cháy rất khó hấp thụ Trong môi trường kiềm sau khi sử dụng đường còn dẽ bị acid hóa và làm biến đổi pH môi trường

Để tránh các hiện tượng này khi khử trùng môi trường chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm (112,50

C) và duy trì trong 30 phút Với các loại đường đơn tốt nhất là nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal) hoặc lọc riêng dung dịch đường (thường dùng nồng độ 20%) bằng nến lọc hoặc màng lọc vi khuẩn sau đó mới dùng thao tác vô trùng để bổ sung vào các môi trường đã khử trùng

Khi chế tạo các môi trường chứa tinh bột trước hết phải hồ hoá tinh bột ở nhiệt

độ 60 - 700C sau đó đun sôi rồi mới đưa đi khử trùng ở nồi hấp áp lực

Cellulose được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải xenlulozơ dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các loại bột cellulose (cellulose powder, avicel, )

Khi sử dụng lipit, parafin, dầu mỏ, để làm nguồn cacbon nuôi cấy một số loại vi sinh vật phải thông khí mạnh để cho từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với thành tế bào từng vi sinh vật

Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau Với vi khuẩn, xạ khuẩn người ta thường dùng 0,05 - 0,2% đường còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3 - 10% đường

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu trong nước về vi sinh vật có khả năng phân hủy keratine còn hạn chế Những năm gần đây mới có một vài nghiên cứu về một số loại vi sinh vật có khả năng phân giải keratin Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Hương (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh

Nguyễn Huy Hoàng et al (2010) cũng đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng phân hủy keratine ứng dụng vào chế biến thức ăn thủy sản Điều kiện cho các chủng vi khuẩn này là ở nhiệt độ từ 30-

40 thì khả năng phân hủy lông gia cầm từ 75%- 90% sau một tuần nuôi cấy

Bùi Thị Minh Diệu et al (2012) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn, kết quả đánh giá khả năng thủy phân lông gà cho thấy 21 dòng vi khuẩn đã làm giảm khối lượng bột lông gà từ 24,43% đến 58,13% sau một tuần lắc ủ ở 37o

C Ngoài ra các dòng

vi khuẩn có khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn sau 10 ngày lắc ủ Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng thủy phân lông gà hiệu quả nhất Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng

Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương

đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91 với độ tương đồng 99%

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Có rất nhiều dòng vi khuẩn phân hủy lông gia cầm được phân lập từ đất và nước

thải Trong đó, Bacillus licheniformis PWD1 (Williams et al., 1990; Lin et al., 1995),

Fervidobacterium pennavorans (Friedrich and Antranikian, 1996), Kocuria rosea

LBP-3 (Vidal et al., 2000; Bernal et al., 2006), Bacillus subtilis KS1 (Kim et al., 2001; Suh and Lee, 2001), Bacillus licheniformis K-508 (Rozs et al., 2001; Manczinger et al., 2003), Xanthomonas maltophila POA-1 (De Toni et al., 2002), Chryseobacterium

sp kr6 (Riffel et al., 2003), Bacillus licheniformis RG1 (Ramnani and Gupta, 2004), Microbacterium arborescens kr10 (Thys et al, 2004), Bacillus licheniformis, Bacillus

subtilis ATCC 6633 (Zerdani et al., 2004)

Sangli và Brandelli (2000) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn từ rác thải chứa chủ yếu là keratin ở Brazil Trong số đó thì kr2 là dòng có khả năng phân hủy cao nhất khi phát triển trên môi trường chứa 10 g/l lông gia cầm (là nguồn năng lượng, cacbon, nitơ duy nhất) Nhiệt độ tối ưu để nuôi vi khuẩn là 30oC và nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động là 55oC, pH = 8 Dòng kr2 được xác định là thuộc họ Vibrionaceae

Gupta và Ramnani (2006) cũng đã tổng hợp các đặc điểm của các dòng vi khuẩn

có khả năng phân hủy keratin được phân lập từ các bài nghiên cứu trước đó Kết quả cho thấy, các dòng vi khuẩn phân hủy keratin có dòng Gram âm và có dòng Gram

dương Các dòng vi khuẩn Gram dương đã được phân lập phần lớn thuộc chi Bacillus:

Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams et al., 1990), Bacillus subtilis S14 (Macedo et

al., 2005), Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, và Bacillus cereus (Kim et al., 2001), hoặc chi Streptomyces như: Streptomyces flavus (Antarctic soil Gushterova et al., 2005), Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995), Streptomyces

albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999), Streptomyces thermoviolaceus (Chitte et

al., 1999) và một vài trường hợp khác là các dòng Fervidobacterium pennavoran (Friedrich, Antranikian, 1996), Microbacterium sp kr10 (Thys et al., 2004),

Terrabacter terrae (Barrientos et al, 2005) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) Các

dòng Gram âm chủ yếu thuộc các chi Vibrio (Sangals, Brandelli, 2000) và chi

Chryseobacterium (Riffel et al., 2003),…

Park và Son (2009) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường

đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium

F7-1 Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày Nhiệt độ 25o

Savitha et al (2010) đã phân lập 2 dòng vi khuẩn phân hủy keratin từ đất:

(KI8101 và KI8102) và nhận diện 2 dòng này là Bacillus subtilis và B licheniformis

Enzyme tinh sạch từ dòng KI8102 có hoạt tính cao (500 U/mg), trọng lượng phân tử là 32KDa Nhiệt độ tối ưu là 50oC và pH = 7,5 thì dòng vi khuẩn này có khả năng phân hủy chất thải chứa keratin như tóc, móng, lông gia súc

Evelise et al (2010) đã tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn mới được phân lập từ mẫu đất ở vùng Amazon Các dòng vi khuẩn này phát triển tốt trên môi trường FMA (feather meal agar) Các dòng vi khuẩn này được kiểm tra khả năng phân hủy lông gia cầm và nhận diện bằng đặc điểm sinh hóa Ngoài ra, chúng còn được định

danh dựa vào trình tự đoạn 16S rRNA Hầu hết các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, ngoài ra còn có Aeromenas, Serratia và Chryseobacterium

Mazotto et al (2011) đã phân lập được ba dòng vi khuẩn Bacillus (B subtilis LFB-FIOCRUZ 1270, B subtilis LFB-FIOCRUZ 1273 và B licheniformis LFB- FIOCRUZ 1274) từ nguồn chất thải lông gia cầm và tiến hành khảo khả năng tổng hợp

enzyme keratinase khi sử dụng bột lông vũ làm cơ chất Ba dòng vi khuẩn này sản sinh

ra các enzyme keratinase và peptidase ngoại bào sau 7 ngày Lông vũ được xác định là

cơ chất tốt nhất cho hoạt động của keratinase và peptidase tạo ra bởi B subtilis

LFB-FIOCRUZ 1273 và đây cũng là dòng vi khuẩn biểu hiện hoạt động enzyme mạnh nhất

Cả ba dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải bột lông vũ (62% đến 75%) và lông vũ (40% đến 95%), tạo ra 3,9 đến 4,4 mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung bột lông vũ và tạo ra 1,9 đến 3,3 mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung lông vũ

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2013-04/2014 tại PTN Sinh học phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm

Mẫu lông gia cầm thu ở một số cơ sở giết mổ gia cầm thuộc tỉnh Vĩnh Long,

chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 được cung cấp bởi PTN Sinh học phân tử

Thực vật do Huỳnh Kim Yến phân lập năm 2013

3.2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân hủy keratin

a Môi trường tăng sinh khối (Riffle et al, 2003)

Bảng 2: Thành phần môi trường tăng sinh khối

b Môi trường lỏng (Bo Xu et al., 2009): đánh giá khả năng phân hủy keratin và

sự hoạt động của enzyme keratinase

3.2.3 Hóa chất

K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, NaCl, Agar

Dung dịch đệm Potassium Phosphat pH=7,5 (Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.H2O), casein, trichloracetic acid (TCA), Na2CO3, NaOH, Tyrosin (Sigma)

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật Telstar (Tây Ban Nha), tủ ủ vi sinh vật Binder (Mỹ),

nồi khử trùng nhiệt ướt Phinternational (Ý), máy khuấy từ, tủ lạnh -4ºC Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh -20ºC Electrolux Confor plus, máy lắc mẫu GFL 3005, pH kế, cân điện

tửSartorius, lò vi sóng, bộ micropipette Nichipet EX (Nhật Bản),…

Một số dụng cụ khác như đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, đèn cồn, que cấy, đầu cône (vàng, xanh, trắng), găng tay

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn

Mẫu vi khuẩn: chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 được cấy chuyển sang

môi trường rắn và ủ trong vòng 48 giờ sau đó nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng

Môi trường: Vi khuẩn nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng (thành phần:

NaCl 0,5g/l, K2HPO4 0,3g/l, KH2PO4 0,4g/l, MgCl2.6H2O 0,1g/l, bột lông vũ 10g,

NH4Cl 0,5g/l)

Nuôi cấy: Vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 phải được nuôi cấy trong điều

kiện vô trùng, tránh bị nhiễm vi sinh vật Cấy xong cho vào tủ ủ, tăng sinh trong 2-3 ngày và sau đó trữ lạnh ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Tăng sinh khối: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng

(thành phần: NaCl 0,5g/l, K2HPO4 0,3g/l, KH2PO4 0,4g/l, MgSO4 0,1g/l, bột lông vũ 10g/l, NH4Cl 0,5g/l) (Riffle et al, 2003) được ủ ở 30oC trên máy lắc (120 rpm) trong vòng 48 giờ Mật số vi khuẩn trung bình được tìm thấy trong khoảng 106

tế bào/ml

3.3.2 Chuẩn bị lông gia cầm

Lông gia cầm (tỉ lệ lông gà – vịt 1:1) đã được chọn lọc và cắt thành những mảnh nhỏ Rửa sạch các mẫu lông trên bằng nước sạch (loại bỏ các hạt bụi), sấy khô ở 80o

C

trong 48 giờ trong tủ sấy Sau đó, đem nghiền thành bột lông thông qua máy nghiền lông Cân mỗi mẫu khoảng 0,5g và sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo

3.3.3 Thí nghiệm 1 Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian

Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời

gian nuôi cấy tối ưu

Bố trí thí nghiệm

+ Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian + Số lần lặp lại: ba lần

+ Số nghiệm thức: 21 đơn vị nghiệm thức

Chỉ tiêu theo dõi

ở mật số 106 rồi đem lắc ở 37oC

+ Mỗi ngày rút ra 1ml đem pha loãng đếm mật số vi khuẩn

Thực hiện việc đếm vi khuẩn cho tới ngày thứ bảy và so sánh kết quả

3.3.4 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn

Mục đích: Chọn ra điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển và khả

năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn

Bố trí thí nghiệm

+ Thí nghiệm được bố trí theo thừa số với hai nhân tố là nhiệt độ (4 mức nhiệt độ: 45, 50, 55, 60) và pH (5 mức pH: 7, 8, 9, 10, 11 )

+ Số lần lặp lại : ba lần

+ Tổng số nghiệm thức : 60 đơn vị nghiệm thức

Chỉ tiêu theo dõi

+ Chủng vào mỗi bình đã được khử trùng 2,5ml vi khuẩn Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng

+ Ủ vi khuẩn trên máy lắc (120rpm) với nhiệt độ 45o

C + Nuôi lắc dựa theo số ngày đã khảo sát ở TN 1 rồi đếm mật số, sau bảy ngày tiến hành đánh giá khả năng phân huỷ lông của vi khuẩn

+ Lặp lại thí nghiệm tương tự với các mức nhiệt độ khác

Nghiệm thức có khả năng phân huỷ lông tốt nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.5 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng

phân huỷ bột lông của vi khuẩn

Bố trí thí nghiệm

+ Thí nghiệm được thực hiện dựa trên kết quả nhiệt độ, pH ở thí nghiệm 2 + Nguồn carbon bổ sung lần lượt là: dịch rỉ đường, sucose, glucose với nồng độ 1%

+ Số lần lặp lại: ba lần

+ Tổng số nghiệm thức: 12 đơn vị nghiệm thức ( bao gồm đối chứng không có carbon)