Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật Telstar (Tây Ban Nha), tủ ủ vi sinh vật Binder (Mỹ),
nồi khử trùng nhiệt ướt Phinternational (Ý), máy khuấy từ, tủ lạnh -4ºC Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh -20ºC Electrolux Confor plus, máy lắc mẫu GFL 3005, pH kế, cân điện tửSartorius, lò vi sóng, bộ micropipette Nichipet EX (Nhật Bản),…
Một số dụng cụ khác như đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, đèn cồn, que cấy, đầu cône (vàng, xanh, trắng), găng tay...
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
Mẫu vi khuẩn: chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 được cấy chuyển sang
môi trường rắn và ủ trong vòng 48 giờ sau đó nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng.
Môi trƣờng: Vi khuẩn nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng (thành phần:
NaCl 0,5g/l, K2HPO4 0,3g/l, KH2PO4 0,4g/l, MgCl2.6H2O 0,1g/l, bột lông vũ 10g, NH4Cl 0,5g/l)
Nuôi cấy: Vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 phải được nuôi cấy trong điều
kiện vô trùng, tránh bị nhiễm vi sinh vật. Cấy xong cho vào tủ ủ, tăng sinh trong 2-3 ngày và sau đó trữ lạnh ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Tăng sinh khối: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh khối trong môi trường lỏng
(thành phần: NaCl 0,5g/l, K2HPO4 0,3g/l, KH2PO4 0,4g/l, MgSO4 0,1g/l, bột lông vũ 10g/l, NH4Cl 0,5g/l) (Riffle et al, 2003) được ủ ở 30oC trên máy lắc (120 rpm) trong vòng 48 giờ. Mật số vi khuẩn trung bình được tìm thấy trong khoảng 106
tế bào/ml.
3.3.2. Chuẩn bị lông gia cầm
Lông gia cầm (tỉ lệ lông gà – vịt 1:1) đã được chọn lọc và cắt thành những mảnh nhỏ. Rửa sạch các mẫu lông trên bằng nước sạch (loại bỏ các hạt bụi), sấy khô ở 80o
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
trong 48 giờ trong tủ sấy. Sau đó, đem nghiền thành bột lông thông qua máy nghiền lông. Cân mỗi mẫu khoảng 0,5g và sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.3.3 Thí nghiệm 1. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian
Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời gian nuôi cấy tối ưu.
Bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian. + Số lần lặp lại: ba lần
+ Số nghiệm thức: 21 đơn vị nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Mật số vi khuẩn.
Các bƣớc thực hiện
+ Chuẩn bị ba bình tam giác, mỗi bình 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng.
+ Dùng giấy bạc đậy kín miệng bình và đem khử trùng ở 121o
C trong 20 phút. + Chủng vào bình tam giác 2,5ml dịch nuôi tăng sinh khối đã chuẩn bị từ trước ở mật số 106 rồi đem lắc ở 37oC .
+ Mỗi ngày rút ra 1ml đem pha loãng đếm mật số vi khuẩn.
Thực hiện việc đếm vi khuẩn cho tới ngày thứ bảy và so sánh kết quả.
3.3.4 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn
Mục đích: Chọn ra điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm được bố trí theo thừa số với hai nhân tố là nhiệt độ (4 mức nhiệt độ: 45, 50, 55, 60) và pH (5 mức pH: 7, 8, 9, 10, 11 ).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
+ Số lần lặp lại : ba lần
+ Tổng số nghiệm thức : 60 đơn vị nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi
+ Mật số vi khuẩn.
+ Khả năng phân huỷ bột lông. Các bƣớc thực hiện thí nghiệm
+ Chuẩn bị 15 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng và điều chỉnh mức pH lần lượt như bố trí thí nghiệm, mỗi mức gồm ba bình tam giác. Dùng giấy bạc bịt kín miệng bình rồi đem khử trùng ở 121o trong 20 phút.
+ Chủng vào mỗi bình đã được khử trùng 2,5ml vi khuẩn. Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
+ Ủ vi khuẩn trên máy lắc (120rpm) với nhiệt độ 45o
C
+ Nuôi lắc dựa theo số ngày đã khảo sát ở TN 1 rồi đếm mật số, sau bảy ngày tiến hành đánh giá khả năng phân huỷ lông của vi khuẩn.
+ Lặp lại thí nghiệm tương tự với các mức nhiệt độ khác.
Nghiệm thức có khả năng phân huỷ lông tốt nhất được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.5 Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon tới sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm được thực hiện dựa trên kết quả nhiệt độ, pH ở thí nghiệm 2 + Nguồn carbon bổ sung lần lượt là: dịch rỉ đường, sucose, glucose với nồng độ 1%
+ Số lần lặp lại: ba lần
+ Tổng số nghiệm thức: 12 đơn vị nghiệm thức ( bao gồm đối chứng không có carbon)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Chỉ tiêu theo dõi + Mật số vi khuẩn.
+Khả năng phân huỷ lông gia cầm. Các bƣớc thực hiện
+ Chuẩn bị 12 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng. lần lượt bổ sung vào đó các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm ( ba bình không bổ sung dùng làm đối chứng). Điều chỉnh pH như TN2, bịt giấy bạc rồi đem khử trùng.
+ Chủng vào mỗi bình tam giác 2.5ml dịch nuôi tăng sinh khối chứa vi khuẩn. + Ủ trên máy lắc với nhiệt độ tối ưu từ TN2
+ Nuôi cấy theo số ngày dựa trên thí nghiệm 1 rồi đếm mật số và sau 7 ngày đánh giá khả năng phân huỷ lông của vi khuẩn.
3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của N tới khả năng phân huỷ bột lông của vi
khuẩn.
Bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm được bố trí tương tự như thí nghiệm 3 với nguồn bổ sung lần lượt là: Bột Đậu Nành, yeast extract, NH4Cl với nồng độ 1%
+ Tổng số lần lặp lại: 3 lần
+ Tổng số nghiệm thức: 12 đơn vị nghiệm thức( bao gồm đối chứng không chứa nitơ)
- Chỉ tiêu theo dõi + Mật số vi khuẩn
+ Khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn. .
- Các bước thực hiện: Tương tự như thí nghiệm 3, nguồn carbon được thay thế bằng nguồn bổ sung nitơ với nồng độ bổ sung lần lượt như bố trí thí nghiệm.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.3.7 Phƣơng pháp xác định tỉ lệ bột lông bị phân huỷ
Mục đích: Đánh giá khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn trong những điều
kiện nuôi cấy khác nhau. - Các bƣớc thực hiện
+ Sấy khô giấy lọc ở 80oC đến khối lượng không đổi rồi đem cân
+ Sau quá trình nuôi cấy, dịch môi trường đem lọc qua vải, rửa sinh khối vi khuẩn bằng nước cất 2- 3 lần rồi đem sấy khô ở 80oC tới khối lượng không đổi, rồi cân.
+ Tỉ lệ phần trăm lông bị phân huỷ tính theo công thức ( Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010)
A = (mBĐ - mC ) x 100/ mBĐ Trong đó: A là tỉ lệ bột lông bị phân huỷ (%)
MBĐ là khối lượng lông ban đầu
MC là khối lượng lông còn lại sau phân huỷ.
3.3.8. Phƣơng pháp xác định mật số vi khuẩn Mục đích: Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn. Các bƣớc thực hiện
+ Mật số vi khuẩn được xác định bằng cách đếm sống số khuẩn lạc trên bề mặt đĩa Petri chứa môi trường thạch rắn.
+ Hút 1ml dung dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong bình tam giác vào ống nghiệm chứa 9ml môi trường BMS ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục hút 1ml trong ống vừa pha loãng và thực hiện thao tác tương tự với các ống nghiệm mới ta được các độ pha loãng khác nhau.
+ Hút 0,1ml ở độ pha loãng phù hợp cho vào đĩa Petri và tiến hành thao tác trải mẫu.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
+ Số TB vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy từ số liệu pha loãng được tính theo công thức (CFU/ml = Ci x Di x 10).
Với Di là độ pha loãng, Ci là số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng Di.
3.3.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý, vẽ biểu đồ dựa trên phần mềm MS Exel2003 và phân tích thống kê dựa trên phần mềm Statgraphics Plus 3.1
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian
Đường sinh trưởng của vi khuẩn thể hiện các gian đoạn phát triển của vi khuẩn theo thời gian trong quá trình nuôi cấy. Nhờ vào đường sinh trưởng mà người nghiên cứu có thể xác định được thời điểm phát triển tối ưu của vi khuẩn để tiến hành thực hiện các thí nghiệm.
Thí nghiệm này khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trong vòng 7 ngày nhằm tìm được khoảng thời gian phát triển tối ưu của vi khuẩn. Giống vi khuẩn được chủng vào ba bình tam giác chứa 50ml môi trường bột lông lỏng với mức pH 7, ủ lắc 120rpm ở 37oC. Mỗi ngày tiến hành lấy 1ml dịch trong môi trường pha loãng ra các tỉ lệ khác nhau, trải lên môi trường agar và theo dõi sự thay đổi mật số. Thực hiện thao tác liên tục trong vòng 7 ngày nuôi cấy.
2.16g 17.1a 16.2b 14.07c 10.86d 9.57e 6.63f 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (ngày)
M ật s ố TB (x 10 e6 C FU /m l)
Hình 2 : Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian
*Ghi chú : Số liệu trên hình là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.
Các giá trị trung bình có cùng mẫu tự theo sau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Từ hình 2 cho thấy đường sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn trong vòng 7 ngày. Trong hai ngày đầu tiên vi khuẩn phát triển tương đối chậm. Sang ngày thứ 3 thì mật số vi khuẩn đạt cực đại (17,1 x106 CFU/ml). Mật số của vi khuẩn luôn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% ở các ngày nuôi cấy. Mật số giảm dần từ ngày 3 cho tới ngày cuối cùng. Hiện tượng này có thể được giải thích như sau : Môi trường
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
nuôi cấy vi khuẩn này chứa một loại dinh dưỡng duy nhất là keratine – một chất khó phân hủy nên những vi khuẩn phân giải keratin luôn cần thời gian thích nghi dài hơn những dòng vi khuẩn ở các môi trường khác. Vi khuẩn khi mới được đưa vào môi trường chưa kịp tổng tổng hợp nên enzyme cần thiết để phân giải cơ chất nên khi mới đưa vào khoảng hai ngày đầu tiên, mật số vi khuẩn không cao. Sau ngày thứ 2 thì vi khuẩn đã tổng hợp enzyme để phân giải môi trường nên mật số vi khuẩn đã có sự khác biệt rõ rệt, cao hơn rất nhiều lần só với hai ngày trước đó. Những ngày tiếp theo thì mật só giảm dần. Bình thường thì sau khoảng thời gian mật số đạt cực đại thì ngưng phát triển do hàm lượng dinh dưỡng bắt đầu hết dần, lượng vi khuẩn sinh ra ngang bằng với lượng chết đi. Tuy nhiên, Bacillus megaterium VL2 là vi khuẩn chịu nhiệt nên có thể mức nhiệt độ 37oC gần ngưỡng chịu nhiệt thấp nhất của dòng vi khuẩn này khiến chúng gặp nhiều bất lợi hơn, số lượng giảm đi nhanh chóng khiến thời gian xảy ra pha cân bằng quá nhanh, sớm hơn khoảng cách giờ khảo sát (24 giờ ) nên khi chạy số liệu thống kê ta không nhìn thấy được pha cân bằng. Từ kết quả thí nghiệm, có thể kết luận thời gian nuôi cấy tối ưu cho dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 là 3 ngày.
4.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân huỷ
bột lông của vi khuẩn
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật khác nhau sẽ có khoảng nhiệt độ riêng để phát triển thuận lợi và khi nhiệt độ quá thấp, hoặc quá cao sẽ ức chế quá trình trao đổi chất, làm ức chế sự phát triển và có thể làm chết tế bào vi sinh vật. Bên cạnh nhiệt độ thì vi sinh vật còn chịu ảnh hưởng nhiều bởi pH môi trường sống. Chính nồng độ H+
có trong môi trường sẽ làm thay đổi tính thấm của tế bào cũng như enzyme ngoại bào từ đó làm ảnh hưởng tới khả năng trao đổi chất của tế bào vi sinh vật.
Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất bột lông gia cầm và dòng vi khuẩn
Bacillus megaterium VL2 với 4 mức nhiệt độ lần lượt 45, 50, 55, 60 và 5 mức pH 7, 8, 9, 10, 11 từ đó chọn ra mức nhiệt độ và pH tối ưu để tiến hành những thí nghiệm sau.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Bảng 5 : Mật số và % bột lông bị phân hủy của vi khuẩn theo các mức pH và nhiệt độ khác nhau. Nhiệt độ pH Mật số (CFU/ml) Phân hủy (%) 45 7 19x105c 16,89 f 45 8 21,3 x105c 31,4 d 45 9 25,7 x106c 39,74 d 45 10 14,7 x105c 27,69 e 45 11 11,7 x104c 16,17 f 50 7 31,7 x107c 45,23 c 50 8 44,3 x108a 69,7a 50 9 46,7 x108a 70,73 a 50 10 37,3 x107c 46,82 c 50 11 24,7 x106c 28,92 d 55 7 12,8 x107c 44,38 c 55 8 14 x108b 59,67 b 55 9 16,3 x108b 61,91 b 55 10 30,3 x107c 44,13 c 55 11 11,7 x106c 18,59 e 60 7 8 x105c 15,.8 f 60 8 6 x106c 23,45 e 60 9 6,13 x106c 21.37 e 60 10 4 x105c 24,06 e 60 11 4,7 x104c 8,2 f
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Từ kết quả Bảng 5 cho thấy có sự biến động giữa các nghiệm thức về sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn, đồng thời thấy được mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông. Khi tăng nhiệt độ từ 45°C lên 50°C, mật số vi khuẩn tăng lên, đồng thời khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng tăng lên. Khi nhiệt độ môi trường tăng từ 55oC và 60°C, mật số vi khuẩn giảm đi rất nhanh và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng giảm theo.
Kết quả phân tích thống kê số liệu (Phụ lục3) cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn là rất có ý nghĩa. Khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn ở từng mức nhiệt độ đều khác biệt có ý nghĩa so với các mức nhiệt độ còn lại, khả năng phân hủy trung bình đạt cao nhất tại nhiệt độ 50°C (50,88%) và thấp nhất là ở 60°C (16,75%). Mật số vi khuẩn trung bình đạt cao nhất ở 50°C (19.8×108 CFU/ml), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại; thấp nhất là ở 60°C (26,76×105
CFU/ml).
Bên cạnh đó còn có thể thấy được sự thay đổi về mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn ở các mức pH khác nhau. Khi pH môi trường giảm từ 7 xuống 8 và 9; mật số vi khuẩn tăng lên khá nhanh và khả năng phân hủy bột lông cũng tăng theo. Khi pH giảm dần từ 9 xuống 10 và 11; mật số vi khuẩn cũng như khả năng phân hủy bột lông cũng giảm theo.
Kết quả phân tích thống kê số liệu (Phụ lục3) cho thấy ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn là rất có ý nghĩa. Tại pH 9 mật số vi khuẩn đạt cao nhất (16.01×108 CFU/ml) khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm